Aula Tecnicas_BioMol_2019

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Técnicas de Biologia
Molecular
Digestão de DNA com enzimas 
de restrição e eletroforese em 
gel de agarose
Werner Arber (Nobel de 1978) 
descobriu as enzimas de 
restrição em 1971
Enzimas de restrição: origem Enzimas de Restrição
•Endonucleases sítio-específicas isoladas de 
procariotos
•Protegem a bactéria do ataque de vírus 
•Protegem seu próprio DNA metilando-o no 
sítio de restrição
•Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em 
Biologia Molecular
EcoRI metilase
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Características dos sítios de restrição
• Tipicamente, são sequências 
palindrômicas de 4-8 bp
• Algumas enzimas toleram alguma 
degeneração no sítio
• Clivagem produz extremidades 
5’-PO4 e 3’-OH
Extremidades Geradas
Bam HI
Kpn I
Sma I
5’-salientes
3’-salientes
Abruptas (cegas)
Frequência de corte no sítio
de restrição
• Sítios estão espalhados randomicamente no genoma
• Número estimado depende da composição de bases:
• Para genoma com conteúdo de 50% GC:
G A A T T C
(¼) (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) = 1/4096
• Se o genoma tiver 4 x 106 pb, então haverá 1000 sítios 
• Distribuição randômica implica na geração de fragmentos de diversos 
tamanhos
Eletroforese
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Eletroforese em gel
• Ácidos nucleicos têm carga global 
negativa (PO4
-)
• Separação em géis de agarose ou
poliacrilamida
• Migração inversamente proporcional ao
tamanho
• Influência da topologia
• linear vs. circular
• Fita dupla vs. fita simples
acrilamida
Eletroforese de gel de agarose
• Aplicar voltagem constante
• Detectar com corante fluorescente
(brometo de etídeo, SYBR, etc)
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Cálculo do tamanho
de fragmentos
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
0.2 0.4 0.6 0.8 1
Mobilidade (cm)
lo
g(
b
p
)
• Plotar mobilidade relativa vs log [tamanho] em pb
• Melhor usar dsDNA linear
Digestão (2 sítios de restrição)
Digestão DNA Linear X DNA Circular Digestão de DNAs com 
múltiplos sítios de restrição
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Mapas de restrição Mapas de restrição
Pulse Field Gel 
Electrophoresis (PFGE)
Configuração de eletrodos do aparato CHEF 
(contoured-clamp homogeneous electric field)
Técnicas de Hibridização
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/1/14/Restriction_Map_Example.svg
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• As fitas de DNA podem ser separadas em condições que rompem 
as ligações de hidrogênio
• Fitas duplas (duplexes) podem se formar in vitro
• Formação dos duplexes depende da complementaridade das 
sequências
• Sondas homólogas (fita simples) podem ser usadas para detectar 
ácidos nucleicos específicos
calor
Técnicas
1) Southern Blot: deteção de DNA: sonda é DNA ou 
RNA marcado. 
2) Northern Blot: deteção de RNA: sonda é DNA ou 
RNA marcado.
Hibridização de ácidos nucleicos
Southern Blot
• Descrito pelo Dr. Southern (1975)
• Digestão do DNA seguido de eletroforese
• Transferência para membrana (imobilização)
• Detecção com sonda (radioativa ou não)
Northern Blot
• Eletroforese de RNA
Exemplos de sondas
• Fragmentos de DNA clonados
• Oligonucleotídeos sintéticos
• RNA (riboprobes)
Northern e Southern Blot
Northern blot
Southern blot
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Transferência do DNA/RNA para 
membrana
• Ação capilar
Hibridização
• A sonda (DNA) é desnaturada por calor, 
adicionada à membrana e incuba-se o sistema 
por um tempo suficiente para permitir a 
interação 
• No caso do Southern e Northern Blot, a 
temperatura de incubação é um parâmetro 
essencial
“Melting Temperature” (Tm) e Estringência
Melting Temperature (Tm)
• temperatura em que 50% das fitas estão separadas
Estringência
• Refere-se às condições experimentais que favorecem a 
hibridização (temperatura de incubação e concentração de 
sais)
• Reflete a homologia entre a sonda e o alvo
alta Tm-15
ºC
moderada Tm-25
ºC
baixa Tm-35
ºC
Detecção dos híbridos 
sonda-molécula alvo
• Autorradiografia: exposição da membrana a um 
filme de raios X (se a sonda for radioativa) 
• Detecção de atividade enzimática: sondas não-
radioativas marcadas com enzimas. Incubação com 
substrato que pode gerar luz ou um preciptado 
colorido
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Autorradiografia: exposição da membrana a 
um filme de raios X
Resumo
Marcação radioativa de sondas de DNA
•Nick translation 
•Random priming
Nick translation
Target dsDNA
The first nucleotide on the 5Õ-P side
of nick has been removed
A nick with a 3Õ-OH terminus has been
introduced by Dnase I into the DNA duplex
A nucleotide has been inserted to replace
the one removed. The nick has been translated
one position along the chain in a 5Õ to 3Õ direction.
The nick has now translated 4 positions along
the DNA chain. The process continues
The 5-3 exonuclease and the
5-3 polymerase plus
dNTP's one of which is labelled
Digestão branda com 
DNAseI produz cortes 
(nicks)
Ação Exo 5´→3´ e Polimerásica
5´→3´da DNA Pol I na 
presença de dNTP sendo um 
deles radioativo
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Klenow = DNA Pol. I sem atividade 
Exo 5´→3´
Random Priming
• usar [32P]dNTP Aplicações das Técnicas de 
Hibridização
Aplicações
• Teste de paternidade/maternidade
• Identificação criminal (forense)
• Diagnóstico de doenças genéticas
“Fingerprinting” genético
• Uso de sonda de DNA repetitivo 
produz uma padrão complexo de 
bandas no Southern Blot
• Distinção de espécies, cepas, 
indivíduos, etc.
• Pode ser usado no diagnóstico, 
taxonomia e análises forenses
Isolados de M. tuberculosis
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Identificação forense: o caso da 
família Romanov
Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. 
Nature Genetics 6, 130 - 135 (1994) 
Teste de Paternidade Teste de Paternidade
MOM = Mãe
DAD = Pai
D1 e S1 = Filha e Filho de MOM e DAD
D2 = Filha do primeiro casamento de MOM
S2 = Filho adotivo
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RFLP
Restriction
Fragment
Length
Polymorphisms
• Ganho ou perda de sítios de restrição 
produzem fragmentos de DNA de 
diferentes tamanhos para análise por 
Southern blot
• Também é sensível a eventos de 
inserção e deleção 
• Polimorfismos não precisam estar 
relacionados com o lócus genético da 
sonda
Diagnóstico de anemia falciforme por RFLP
Sequenciamento de DNA
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Estratégias de Sequenciamento
Dois métodos clássicos:
1) Método de Maxim & Gilbert: técnica química (em desuso)
2) Método de Sanger (1977): Reação de Terminação de Cadeia 
(técnica enzimática)
Pré-requisitos:
DNA polimerase, magnésio
primer
dNTPs (substrato) 
ddNTPs (análogos dos dNTPs)
Reação da DNA Polimerase
Dideoxirribonucleotídeo O
| 5 ’
O = P - CH2
|
O
o
3’ 2’
H
H
BASE
O
| 5’
O = P - CH2
|
O H
o
3 ’
H 
2’
H
H
BASE
Fim de Cadeia
H
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Frederick_Sanger.jpg
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primer
template
DNA pol
dNTP
3´ 5´
3´5´
A Reação de Sequenciamento
+ 1 dNTP radioativo
Principais aperfeiçoamentos 
da técnica
• Introdução de instrumentos 
de sequenciamento baseados 
em capilares e leitura ótica a 
laser da fluorescência gerada 
96 amostras em paralelo
AUTOMAÇÃO
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Sequenciamento 
automático de DNA
• ddNTPs ligados a uma molécula 
fluorescente → todos os fragmentos 
terminando em um ddNTP específico 
apresentam uma cor particular
• todos os 4 ddNTPs marcados em um 
único tubo
• separação dos fragmentos em capilar
• feixe de luz lazer 
• sequência de DNA → sequência de 
cores
Principais aperfeiçoamentos 
da técnica
• Desenvolvimento da bioinformática, 
com sistemas de softwares para 
interpretação dos dados gerados e 
montagem das sequências.
Pirosequenciamento
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Pirosequenciamento Sequenciamento de DNA em 
nanoporos
Reação em Cadeia da Polimerase
Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Técnicas de Hibridização: Limitações
• requerem muito DNA (ordem de microgramas) 
• DNA tem que estar bem puro
• tempo do ensaio: até uma semana
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Fragmentos específicos de DNA são
enzimaticamente amplificados
- Amplificação de até 106 X é possível!
- Pode detectar até 1 molécula de DNA!
•Tolera DNA relativamente impuro
•Tempo: menos de 1 dia !
Kary Mullis (1985)
PCR
O que é necessário??
Termociclador
DNA Molde (template)
Primers
dNTPs
DNA Polimerase
Mg2+
Taq Polimerase
• DNA polimerasede Thermus aquaticus: 
organismo termofílico
• Enzima resiste a altas temperaturas
• Temp. ótima: 72-74°C
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Princípio da Técnica
Reação de Replicação in vitro
1. Desnaturação: 94°C
2. Anelamento (Tm)*: 45°C - 60°C
3. Polimerização: 72°C
*Tm = 4(G+C) + 2(A+T) (para primers pequenos) = 
2(A + T) + 4(G + C)
Desnaturação do template
95°C
Anelamento dos primers
45-65°C
Extensão pela polimerase
72°C
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Algumas aplicações clínicas do PCR
• Clonagem de genes
• Screening (triagem) de genes mutantes
• Determinação de sexo pré-natal
• Diagnóstico de doenças genéticas
• Detecção de infecções
• Monitoração de terapia contra o câncer
Três regiões 
amplificadas para 
gerar um “DNA 
fingerprint”
Identificação
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Aplicações não-clínicas
• Sequenciamento de DNA
• Screening de clones
• Estudos de ecologia e evolução molecular
• Identificação de organismos transgênicos
• Fingerprinting forense