Unidade 2 - Biologia molecular

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Unidade I – Biologia molecular 4º período - Farmácia 
 
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Evolução na clonagem de DNA 
• Através da tecnologia do DNA recombinante, 
podemos replicar um fragmento do DNA dentro de 
uma célula bacteriana. Basta cortar o fragmento de 
interesse, através das enzinas de restrição, e inserir esse 
fragmento no DNA bacteriano, 
denominado plasmídeo, utilizando-se as enzimas de 
DNA ligase. Esse DNA recombinante, introduzido em 
uma bactéria por transformação, pode ser replicado 
várias milhões de vezes à medida que as bactérias se 
multiplicam. 
• Porém, um questionamento intrigou durante 
muito tempo o mundo científico: como escolher 
identificar e isolar um gene sem saber previamente sua 
sequência de nucleotídeos? De acordo com Alberts 
(2011), a solução encontrada foi o desenvolvimento 
de bibliotecas de DNA. Para entendermos essa 
técnica, analisaremos o exemplo do gene que codifica 
o fator VIII de coagulação humana. 
• A hemofilia, uma doença que causa problemas 
da coagulação sanguínea levando a quadros de 
sangramento descontrolado, é caracterizada por 
alterações no gene para o fator VIII. O tratamento para 
essa doença era a injeção da proteína fator VIII 
concentrada, coletada a partir de várias amostras de 
sangue. Contudo, durante a década de 1980, esse 
procedimento expôs diversos pacientes à infecção pelo 
vírus do HIV. O método de produção do fator VIII 
através da tecnologia do DNA recombinante trouxe 
uma melhora significativa nesse aspecto e no 
tratamento dessa doença. Para tanto, foi necessária 
realizar a clonagem do gene que codifica esse fator 
VIII, através da identificação das suas sequências 
específicas e utilizá-las para produzir uma grande 
quantidade de proteínas purificadas (ALBERTS, 
2011). 
• Entretanto, trabalhar com 3x109 pares de 
nucleotídeos não é uma tarefa fácil. Através da 
tecnologia do DNA recombinante, milhares de 
fragmentos são inseridos em plasmídeos 
recombinantes, fornecendo milhares de DNA clonados 
em uma cultura bacteriana, denominada biblioteca de 
DNA. Nessa etapa, poderíamos pensar que achar um 
gene seria como achar um livro dentro de uma 
biblioteca com milhares de livros sem ter um catálogo 
em mãos. 
• No caso que analisamos, a utilização de sondas 
de DNA foi a solução encontrada. Na proteína para o 
fator VIII, a sequência parcial de aminoácidos é 
deduzida por espectrometria de massas. 
Consequentemente, se deduz os nucleotídeos que a 
compõem. A partir dessa informação, são produzidas 
sondas especificas que podem identificar um gene 
dentro de uma biblioteca de DNA. 
• Apesar dessa técnica ainda ser utilizada no 
sequenciamento de genomas inteiros, ela vem sendo 
substituída em grande parte pelo método conhecido 
como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que 
fornece uma alternativa mais rápida e barata. De acordo 
com Vieira (2020), essa técnica foi desenvolvida em 
meados da década de 1980 por dois cientistas: Saike e 
Mullis. O método de clonagem da PCR já havia sido 
descrito por Saiki, mas foi aperfeiçoada por Mullis que 
conseguiu obter maior especificidade na cópia de 
apenas segmentos específicos, introduziu o conceito 
de primer de PCR e instituiu o uso de enzimas 
denominadas DNA polimerase termoestáveis. Mullis 
utilizou enzimas termoestáveis recém descritas, 
melhorando o processo que demandava grandes 
quantidades de enzimas a cada ciclo de amplificação. 
Além disso, utilizou diversos equipamentos para 
automatização do processo. 
• Em 1989, foi desenvolvido o 
primeiro termociclador automático DNA, Thermal 
Cycler, o que melhorou muito o processo manual de 
ciclos de temperaturas que era feito anteriormente 
banhando os vários tubos em banhos-maria de 
temperaturas diferentes. A maioria dos 
termocicladores, ainda hoje, funciona com o mesmo 
princípio, aquecimento por resistência elétrica e 
refrigeração com ventoinhas e etileno glicol. 
• Segundo Vieira (2020), técnica da PCR 
revolucionou as tecnologias em biologia molecular, 
teve grande impacto e contribuição no estudo de 
sequenciamento do genoma humano e levou ao avanço 
de diversas áreas. Suas aplicações são totalmente 
abrangentes atingindo atualmente campos como 
genética, medicina, indústria, alimentos, ciência 
forense, diagnostico, dentre tantos outros. 
Procedimentos e funções da PCR 
• A PCR é utilizada atualmente na grande 
maioria dos processos de clonagem do DNA. Através 
dela, determinada sequência especifica de nucleotídeos 
pode ser replicada totalmente in vitro sem a 
necessidade do uso de células e de forma rápida e 
seletiva, obtendo grandes quantidades de clones, a 
partir de uma pequena amostra de DNA humano. Os 
fundamentos desse método estão baseados na 
utilização de enzimas chamadas polimerase, capazes 
de copiar um molde de DNA em uma reação com 
ciclos repetidos de replicação. Essa polimerase é 
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guiada até a sequência a ser copiada por primers, 
sequências curtas de ácidos nucleicos adicionados a 
reação, que posteriormente copiam o DNA molde no 
início e no final da sequência desejada. Essa técnica de 
PCR é extremamente sensível e pode detectar uma 
única cópia de uma sequência especifica de DNA em 
uma amostra. A partir disso, amplifica tanto essa 
sequência, que permite detectá-la por métodos de 
coloração após separação com eletroforese em gel. 
• Para esse processo, é necessário ter 
conhecimento da sequência de DNA a ser amplificada. 
A partir disso, é possível projetar moléculas de DNA 
sintéticas curtas, cada uma complementar à sequência 
do DNA a ser amplificada em cada uma das 
extremidades opostas da região alvo. Essas sequências 
sintéticas, servem como iniciadores para a síntese do 
DNA in vitro, através das enzimas polimerases. 
• A PCR consiste essencialmente em três etapas 
básicas com variação de temperatura por ciclo, 
sendo elas: 
1. Desestruturação da proteína - O DNA 
contendo a sequência a ser amplificada é desnaturada, 
ou seja, sua fita dupla é aberta, tornando-a uma fita 
única. Essa etapa é realizada na temperatura entre 92ºC 
a 96ºC e dura de 30 seg. a 1 min. 
2. Ligação dos iniciadores sintéticos - Após essa 
primeira etapa, um par de iniciadores ou primers (uma 
sequência especifica feita para o gene que se quer 
ampliar) iniciam a reação de polimerização, ou seja, 
complementam a fita oposta na sequência do DNA que 
se deseja ampliar, realizando a duplicação desse trecho. 
Essa etapa tem duração de 30 seg. a 1 min em 
temperaturas entre 58ºC a 65ºC. 
3. Amplificação através da enzima Taq - Com 
as fitas de DNA molde já identificadas pelos 
iniciadores, a enzima DNA polimerase adiciona as 
bases complementares, originando uma nova fita e 
obtendo novamente a duplicação da fita de DNA. Essa 
etapa tem duração de 45s a 1 min e acontece a 
temperatura de 72ºC. 
• Cada ciclo desse é repetido entre 30 a 35 vezes 
e realiza a amplificação da região do DNA determinada 
conforme a ligação dos iniciadores sintéticos ou 
primers. Os produtos obtidos em cada um desses ciclos 
servem de molde para as próximas reações; por isso, a 
denominação de reação em cadeia. Esse processo vai 
se repetindo até que se obtenha o nível de amplificação 
desejada, em geral por volta de 30 ciclos. 
4. Já que cada uma dessas etapas ocorre diferentes 
temperaturas, a reação pode ser controlada através de 
um termociclador que pode garantir a temperatura 
especifica e o tempo de cada etapa, assim como o 
número de ciclos da replicação. A amplificação desse 
DNA através da PCR pode ser lida, ou seja, detectado 
através da separação em gel de eletroforese e posterior 
coloração das bandas de DNA 
5. Com o passar dos anos houve o 
aprofundamento do estudo dos métodos de PCR, 
levando a um desenvolvimento dessa técnica. Hoje 
existem alguns tipos diferentes de PCR, os 
mais comuns são: 
I. RT-PCR (Transcriptase Reversa) - Nessareação, duas etapas são realizadas, primeiro há a 
transcrição reversa seguido da amplificação, a 
diferença é que essa técnica não precisa de um molde 
de DNA diretamente extraído da amostra, podendo 
ser obtido apenas o RNA da amostra e partir dele 
produzir um cDNA (DNA complementar). Aqui é 
utilizado um molde baseado em RNA para originar 
uma fita de DNA através da enzima transcriptase 
reversa, essa técnica tem bastante aplicabilidade no 
estudo da expressão gênica, já que avaliando o mRNA 
é possível identificar as proteínas que estão de fato 
sendo expressas. 
II. PCR multiplex - Nessa técnica, mais de um 
fragmento de DNA pode ser amplificado numa 
única reação, cada um com um com o seu par de 
primers específico. Esse procedimento apresenta 
vantagens para algumas aplicações como testes de 
paternidades que devem analisar vários 
marcadores genômicos ao mesmo tempo e também 
para introduzir um controle de reação esse método. 
Nesses casos esse tipo de PCR tem a vantagem de 
simplificar significativamente o processo. 
III. PCR Nested - Esse tipo consiste em amplificar 
primeiramente um fragmento de forma abrangente, 
copiando até sequencias localizadas fora dela, 
posteriormente a obtenção desse produto, a ampliação 
da sequência alvo é iniciada. Essas duas etapas podem 
ser realizadas simultaneamente, ou em duas reações 
separadas, esse procedimento serve para melhorar a 
eficiência e especificidade da reação. 
IV. PCR Competitiva - Essa técnica, altamente 
utilizada em kits diagnósticos para análise carga viral, 
por exemplo, utiliza um outro fragmento de DNA além 
do DNA molde, sendo esse primeiro de tamanho e 
concentração conhecidos (controle), no qual as 
extremidades são complementares também aos primers 
que irão amplificar a sequência alvo. A consequência 
disso é a amplificação de dois trechos de DNA, o de 
interesse e o controle, pelo fato das concentrações do 
controle serem conhecidas é possível quantificar o 
DNA alvo. 
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 De acordo com Nascimento (2015), esse último 
tipo de PCR é também denominado PCR em tempo 
real, representado pela sigla qPCR que significa PCR 
quantitativa, isso porque através desse método é 
possível a quantificação do DNA alvo durante o 
processo. Ainda, o resultado da reação pode ser 
visualizado imediatamente dispensando a necessidade 
de eletroforese, somente pela adição de sondas 
fluorescentes que aumentam seu nível de fluorescência 
de acordo com a quantidade de ampliação do DNA 
alvo. Nesse aspecto, como o equipamento consegue 
detectar essa fluorescência enquanto está ocorrendo a 
amplificação, é possível acompanhar os resultados em 
tempo real daí a sua denominação. Por sua precisão, 
rapidez e sensibilidade essa técnica apresenta uma 
diversidade de aplicações. 
 O perfilamento genético para avaliação do 
genoma de um organismo é uma aplicação bastante 
utilizada no campo da pesquisa básica. O perfilamento 
ou “microarray” é um procedimento que permite a 
análise de milhares de genes ao mesmo tempo, sendo 
possível quantificação e observação de genomas 
inteiros. 
 A identificação de polimorfismos ou 
mutações pontuais é outra aplicação da PCR em tempo 
real muito utilizada nas áreas clinicas e de pesquisa. Ela 
pode ser feita por análise de curva de dissociação, após 
amplificação por qPCR. Essa técnica é ideal para 
analisar mutações, até mesmo de um único nucleotídeo 
modificado, para a detecção de mutação no fragmento 
de DNA alvo é necessária a avaliação do produto 
amplificado em curva de dissociação, realizada 
automaticamente após a termociclagem. 
 No campo da farmacogenética, a qPCR tem 
ganhado grande importância, no intuito de analisar a 
expressão de determinado gene em resposta a um 
determinado tratamento com fármacos. Para detecção 
de microrganismos e doenças infectocontagiosas, há 
uma utilização crescente também da PCR em tempo 
real, pois permite a distinção de uma sequência 
especifica de DNA dentro de uma mistura complexa. 
Nesse campo, a qPCR permite a determinação 
específica da presença e quantidade de um vírus, 
bactéria ou fungo, com base na relação existente entre 
a carga viral e a gravidade da doença, através dessa 
técnica é possível mensurar a progressão da doença nos 
pacientes e a eficácia das terapias antivirais. A análise 
de bactérias com esse mesmo processo pode viabilizar 
um rápido acesso as características de sensibilidade do 
organismo, permitindo que se prescreva o antibiótico 
adequado. 
 Desde o desenvolvimento da tecnologia de 
PCR, foram rápidos os avanços realizados nas técnicas 
de biologia molecular em especial na medicina 
humana, as também podemos citar a utilização dos 
diversos tipos de PCR nas mais variadas aplicações. 
Essa tecnologia trouxe um novo patamar à ciência de 
biologia molecular e permitiu a evolução de uma 
infinidade de segmentos dentro da sociedade. 
Enzimas de restrição 
 O ser humano vem manipulando o DNA e 
consequentemente os genes há séculos. Contudo, essa 
manipulação se dá através de um longo tempo e vários 
cruzamentos entre raças, para se selecionar as 
características desejadas. A advento e desenvolvimento 
das técnicas de biologia molecular, em especial, 
a engenharia genética, representada em grande parte 
pela técnica do DNA recombinante, permitiu que a 
ciência alterasse o DNA com muito mais precisão e em 
um tempo muito menor. Hoje, através dos métodos e 
tecnologias estabelecidas, principalmente ao longo das 
últimas décadas, se tornou relativamente fácil isolar 
uma região específica do DNA, separar um gene para 
estudá-lo e criar milhares de cópias idênticas desse 
DNA. 
 A princípio, os cientistas perceberam que 
ficaria muito difícil desvendar todos os mecanismos de 
codificação do DNA, sem que se estudassem 
individualmente e especificamente os genes, já que á 
na sequência de nucleotídeos que estava toda a 
informação genética que confere as mais variadas 
características biológicas aos seres vivos. O grande 
problema de estudar o gene, na época, é que seria como 
procurar uma agulha no palheiro, visto que os genes 
são sequências muito longas de nucleotídeos e os 
fragmentos de DNA, contendo um determinado gene, 
se perdia entre milhares que fragmentos obtidos, 
criando um grupo confuso de fragmentos aleatórios. 
Esse tipo de problema foi resolvido ao se desenvolver 
mecanismos que aprimorassem a técnica de DNA 
recombinante. 
 Uma das ferramentas melhor desenvolvidas 
para sanar essas questões foi a descoberta de uma 
classe de enzimas bacterianas chamadas polimerases. 
Essas enzimas se diferenciavam das outras “tesouras” 
moleculares, pois conseguiam cortar a dupla fita de 
DNA em uma região altamente especifica, delimitado 
por uma sequência curta de pares de nucleotídeos, 
sendo possível utilizar esses fragmentos para 
reprodução de clones de um genoma. A descoberta e 
validação dessas enzimas só foi possível a partir do 
desenvolvimento das técnicas moleculares e o avanço 
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nos estudos sobre essa área da ciência. A primeira 
demonstração de que essas enzimas poderiam cortar 
fragmentos específicos do DNA se deu em 1971, 
através dos trabalhos de Smith e Nathans, que 
observaram isso em um vírus oncogênico. Além disso, 
seus estudos revelaram que esses fragmentos poderiam 
ser separados por eletroforese em gel, a partir de uma 
carga elétrica. O descobrimento dessas enzimas foi um 
marco para biologia molecular e rendeu o Nobel aos 
cientistas que a descreveram. Desde então, já foram 
identificados aproximadamente 800 enzimas de 
restrição e 100 regiões alvo de restrição (PRAY, 2008). 
 Em 1972, a primeira molécula de DNA 
recombinante foi produzida, quando Paul Berg isolou e 
empregou uma enzima de restrição para cortar o DNA 
e usando posteriormente aenzima DNA ligase para 
unir as duas fitas, tornando possível a clonagem 
daquele fragmento de DNA experimentalmente. De 
acordo com Alberts (2011), a descoberta dessa classe 
de enzimas, assim como grande parte das tecnologias 
do DNA, foram observadas quando se estudava um 
problema biológico especifico, que se pautava no 
questionamento do porquê determinadas bactérias 
sempre degradavam um DNA “estranho” que era 
inserido nelas experimentalmente. Como resultado a 
esses questionamentos os pesquisadores observaram 
que essa enzima aparecia naturalmente nas células e 
tinha como principal função proteger o DNA de um 
hospedeiro frente a um DNA externo, por exemplo, um 
DNA de vírus bacteriófago. Pelo fato dessas enzimas 
restringirem a transferência de DNA entre algumas 
cepas de bactérias, elas foram denominadas 
de nucleases de restrição ou simplesmente enzimas 
de restrição. 
 
 Funcionamento e tipos de enzimas de 
restrição 
 Com a descoberta e o desenvolvimento dessas 
tecnologias e métodos capazes de cortar o DNA e 
posteriormente ligar esses fragmentos, surge uma nova 
área na ciência conhecida como Engenharia 
Genética, que tem como técnica mais proeminente a 
Tecnologia do DNA recombinante. Hoje, através da 
Engenharia Genética, representada pela tecnologia do 
DNA recombinante, podemos detectar mutações no 
DNA responsáveis por doenças genéticas, diagnosticar 
a predisposição de um individuo em ter doenças 
hereditárias, identificar o DNA de suspeitos na ciência 
forense, produzir uma diversidade de medicamentos, 
como a insulina, ou criar outros organismos 
geneticamente modificados. 
 As enzimas de restrição têm a capacidade de 
cortar o DNA em uma sequência de nucleotídeos 
específicas. Em geral, as sequências alvo 
são palindrômicas, ou seja, são simétricas em torno de 
um ponto central. Espécies de bactérias diferentes 
contêm diferentes nucleases de restrição e cada uma 
delas corta o DNA em uma sequência de nucleotídeos 
específica. 
 As sequências alvo costumam ser curtas – em 
média 4 a 8 pares de nucleotídeos. Logo, os sítios de 
clivagem, ou seja, regiões especificas na qual as 
enzimas realizaram o corte, seguem o padrão de 
funcionamento de qualquer enzima de especificidade 
entre a proteína e o alvo (modelo chave - fechadura), 
ocorrendo um corte puramente por acaso, em qualquer 
molécula longa de DNA. 
 Esse fator permite que essas nucleases sejam 
utilizadas em DNA de qualquer fonte, e, ainda, que 
uma enzima específica corte uma dada molécula de 
DNA sempre nas mesmas regiões, o que as tornam tão 
úteis. Uma amostra de DNA humano, por exemplo, 
tratado com uma certa nuclease de restrição produzirá 
sempre a mesma coleção de fragmentos (ALBERTS, 
2011). 
 Hoje, são descritas uma gama de enzimas de 
restrições diferentes que agem nos mais diversos sítios 
de restrição, de acordo com a sequência de DNA que 
se pretende cortar e obter. As variações nas sequências 
alvo das nucleases estão relacionadas a frequência na 
qual elas ocorrem no DNA. Por isso, os tamanhos dos 
fragmentos de DNA obtidos por diferentes enzimas de 
restrição podem ser muito diferentes. 
 Tais característica tornam possível cortar uma 
longa molécula de DNA em tamanhos de fragmentos 
adequados de acordo com uma determinada aplicação. 
As nucleases de restrição podem ser divididas em 
quatro tipos de acordo com as sequências de 
reconhecimento, composição da subunidade, posição 
de clivagem e tipo de cofator. 
 As enzimas do tipo I, segundo Biclke (1993), 
são capazes de cortar o DNA em sequencias 
relativamente distantes do sitio de reconhecimento, são 
dependentes de ATP e apresentam atividades 
multifuncionais. Já as enzimas do tipo II, cortam em 
distancias muito curtas do sitio de reconhecimento ou 
no local exato, são dependentes de Mg 2+ e apresentam 
função mais de restrição. As enzimas do tipo III são 
capazes de reconhecer sequencias assimétricas e cortar 
o DNA em regiões de até 25 a 37 pares de bases, tendo 
atividades de restrição e modificação. Por fim, as 
enzimas do tipo IV têm como alvo apenas o DNA 
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metilado. Além disso, segundo Dryden (2001), essas 
enzimas ainda podem apresentar características 
particulares dentro desses tipos, subdividindo-se em 
diferentes subtipos e permitindo sua utilização para as 
mais variadas fragmentações e consequentemente 
aplicações. 
 
Advento da genômica 
 Ao falarmos em genômica, estamos tratando 
do campo da ciência que estuda o genoma, ou seja, a 
possibilidade de sequenciamento do DNA. O 
primeiro genoma de organismo vivo a ser sequenciado 
foi o genoma da bactéria Haemophilus influenzae, em 
1995, com 1,8 milhões de bases. Os avanços nessa 
ciência podem ser bem representados pelos estudos da 
genética dos Neandertais. Estudos realizados em um 
fóssil original de neandertal, descoberto em 1856, 
sequenciaram uma região de 379 pares de bases de 
DNA mitocondrial desse osso, em 1997. O 
sequenciamento desse fragmento foi uma conquista 
técnica incrível, em menos de 10 anos a mesma equipe 
de pesquisa conseguiu obter mais de um milhão de 
pares de bases de uma sequência de DNA nuclear de 
uma amostra de neandertal. 
 Ainda na década de 1990 vários avanços no 
sequenciamento genético foram realizados. Em 1996 o 
genoma de Sacharomyces cerevisiae de 12 milhões de 
pares foram descritos. Em 2000, o genoma 
de Drosophila melanogaster com 180 milhões de pares 
de bases foi sequenciado, culminando em 2001 no 
primeiro sequenciamento realizado no genoma 
humano com a obtenção de 3000 milhões de pares de 
bases. Atualmente são mais de 300 genomas 
bacterianos sequenciados, 50 genomas de fungos, uma 
diversidade de plantas e uma série de mamíferos. 
 A genômica vem se desenvolvendo a passos 
largos, revolucionando a forma como a análise genética 
é feita. Até então o estudo dos genes e do DNA estava 
focado no isolamento de mutantes que afetam alguma 
função biológica observável e o estudo desse mutante. 
Saber a sequência inteira do DNA permitiu uma análise 
muito mais detalhada do DNA e das interações entre os 
genes e as suas funções biológicas, revelando genes 
que não eram detectados nas análises clássicas. O 
estudo do genoma vem fornecendo novos horizontes, 
para identificar genes que contribuem para doenças 
genéticas, para entender os processos evolutivos na 
biologia, na medicina humana para prevenção de 
doenças, identificação e formas de tratamentos para 
microorganismos que impactam a saúde humana. 
 O projeto genoma humano impulsionado a 
partir do início século, modificou o estudo dos genes e 
dos próprios métodos para sequenciamento de DNA. 
Diferente dos princípios utilizados anteriormente para 
o estudo dos genes, os métodos de sequenciamento 
tornariam os mapas genômicos publicamente 
disponíveis. Esses mapas, podendo ser acessados pelos 
pesquisadores, se constituem uma ferramenta incrível 
que facilita a identificação da sequência especifica de 
um gene e sua função. Por isso, vemos hoje que a 
caraterização de genomas inteiros é importante para 
compreender os mecanismos de funcionamento dos 
organismos vivos e para descoberta de novas genes que 
pode beneficiar ou prejudicar a saúde humana. 
 Ainda na década de 1970, a molécula de DNA 
era uma das mais difíceis de ser estudada e analisada, 
sendo utilizado ainda métodos indiretos para sua 
observação. Tais métodos, contudo, dificultavam 
identificar as sequências dos nucleotídeos para um 
estudo mais aprofundado sobre os genomas. Essa 
problemática só foi solucionada através do 
desenvolvimento de duas metodologias, ainda na 
mesma década, proposta por Maxam Gilbert e por 
Sanger. O resultado disso é que a técnica descrita pelo 
premiado cientista Fred Sanger, em 1977, permitiu 
identificar, na ordem certa, as sequências de 
nucleotídeos que compõem umamolécula de DNA ou 
RNA. Esse procedimento causou uma mudança total 
nos princípios de sequenciamento de ácidos nucléicos, 
esse fato fez com que esse método fosse utilizado nas 
três décadas seguintes (AZAMBUJA, 2014). 
 Apesar disso, a necessidade de buscar novos 
métodos com menor custo, maior eficiência e rapidez 
foi uma realidade no final deste período. A busca pelo 
aprimoramento do método de Sanger resultou em 
sequenciadores automatizados que tornaram o 
processo de Gilbert obsoleto. O primeiro sequenciador 
automatizado utilizou a metodologia de Sanger 
modificada, e sua aplicação liderou a pesquisa 
genômica durante décadas. Esse foi o pontapé inicial 
para um crescente no número de sequenciadores, o que 
tem aumentado o número de genomas sequenciados em 
uma proporção incrível. Por exemplo, até dezembro de 
2015 já eram registradas 36.052 projetos de 
sequenciamentos finalizados e outros tantos em 
andamento, totalizando uma quantidade de 71.479. 
Esses números mostram que os métodos estabelecidos 
inicialmente na década de 1970 causaram uma 
verdadeira revolução na genômica. 
 A quantidade extraordinária de dados 
genômicos, derivados desses diversos projetos 
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impulsionaram a criação de inúmeros bancos de dados 
biológicos, sendo um dos mais proeminentes o NCBI 
(National Center for Biotechnology Information). O 
Brasil criou um programa de sequenciamento de 
genomas que sequenciaram o genoma da 
bactéria Xylella fastidiosa, o primeiro fitopatogeno 
completamente sequenciado no mundo (ALBERTS, 
2011). Atualmente, existem as técnicas denominadas 
de terceira geração, que prometem causar enormes 
mudanças no campo da genômica, diminuindo ainda 
mais os custos nos processos de sequenciamento e 
criando a possibilidade de sequenciar fragmentos de 
DNA maiores e sem utilização de fluorescência ou luz. 
 
Métodos e aplicações do sequenciamento do DNA 
 A técnica de sequenciamento desenvolvida por 
Gilbert ganhou destaque, em sua época, por 
proporcionar a obtenção de sequências nucleotídicas de 
fragmentos maiores, comparados as técnicas 
anteriores. Gilbert desenvolveu um método que 
utilizava marcação radioativa dos DNA alvo a serem 
sequenciados (FIETTO, 2020). Nessa técnica, é 
utilizado fósforo radioativo (P32) que, ligadO ao Datp, 
forma um composto que é incorporado ao DNA a ser 
sequenciado, através da enzima polinucleotídeo kinase. 
Esta incorporação pode ser feita em duas extremidades 
diferentes de acordo com aplicação desejada e as 
pontes que ligam a dupla fita do DNA são feitas pela 
adição de dimetil sulfato e aumento da temperatura a 
90ºC 
 Segundo Fietto (2000), o processo de 
sequenciamento nesse método consiste em: 
1. Técnica de sequenciamento de Gilbert – 
adição de um fosfato radioativo e uma extremidade 
após a separação da dupla dita do DNA; 
2. Adição do DNA marcado em quatro tubos, 
onde ocorre os cortes/clivagens através de compostos 
químicos em posições específicas; 
3. O produto nessas reações é colocado em 
diferentes canaletas de um gel de eletroforese; 
4. Após a separação no gel, as bandas obtidas 
podem ser lidas de baixo para cima, cada uma 
representando os nucleotídeos sequenciados. 
 O método desenvolvido por Sanger modificou 
totalmente a tecnologia do sequenciamento de DNA. 
Esse método se pautava nos mesmos princípios que a 
técnica anterior, ou seja, de produzir todos os possíveis 
trechos de sequências do DNA e marcá-los 
radioativamente. Contudo, por sua facilidade e 
precisão, essa técnica ganhou grande notoriedade e 
aplicabilidade em muitas áreas, durante muito tempo. 
 A técnica denominada sequenciamento de 
Sanger, ou método de terminação de cadeia 
didesoxi, é um método baseado na síntese de DNA 
realizada in vitro. Nesse procedimento, a DNA 
polimerase é usada para fazer cópias parciais de um 
fragmento de DNA a ser sequenciado. Essas reações 
acontecem em condições especificas que asseguram 
que essas novas fitas de DNA terminem quando um 
nucleotídeo determinado seja alcançado. Essas reações 
originam uma coleção de cópias diferentes de DNA 
que terminam em todas as posições no DNA original e 
se diferenciam no comprimento por apenas um 
nucleotídeo. Para determinação da sequência completa 
de um fragmento de DNA, primeiro há a separação da 
dupla fita de DNA em duas fitas simples e uma dessas 
fitas é utilizada de molde para o sequenciamento. 
 São adicionados quatro desses terminadores de 
cadeia diferentes em quatro reações separadas de 
síntese de DNA em cópias do mesmo molde de DNA 
de fita simples. Cada uma dessas reações produz um 
grupo de cópias de DNA que terminam em pontos 
diferentes na sequência. Os produtos dessas quatro 
reações podem ser separados por eletroforese em gel, 
geralmente de poliacrilamida. Esses fragmentos recém-
sintetizados podem ser identificados por um marcador 
fluorescente ou radioativo que realçam as bandas por 
estarem ligadas nos iniciadores ou finalizadores 
utilizados para estender a cadeia de DNA. As cópias do 
DNA irão correr em quatro canaletas em eletroforese. 
Cada uma dessas canaletas apresentará os fragmentos 
que terminaram em um determinado nucleotídeo, mas 
em diferentes posições no DNA. 
 Esses fragmentos recém-sintetizados podem ser 
identificados por um marcador fluorescente ou 
radioativo que realçam as bandas por estarem ligadas 
nos iniciadores ou finalizadores utilizados para 
estender a cadeia de DNA. As cópias do DNA irão 
correr em quatro canaletas em eletroforese. Cada uma 
dessas canaletas apresentará os fragmentos que 
terminaram em um determinado nucleotídeo, mas em 
diferentes posições no DNA. Através da leitura dessas 
bandas em ordem, em todas as canaletas iniciando no 
final do gel, a sequência de DNA da fita recém-
sintetizada pode ser determinada. Em suma, a técnica 
de Sanger usa a marcação radioativa para 
sequenciar o DNA, a partir de uma fita molde. De 
acordo com Fietto (2000), podemos sintetizar o método 
Sanger da seguinte maneira: 
1. Etapas do método Sanger – Desnaturação da 
fita dupla de DNA e obtenção de duas fitas simples; 
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2. Utilização das fitas para montar quatro reações 
independentes contendo os mesmos reagentes (exceto 
os finalizadores didesoxinucleotídeos que são 
adicionados separadamente de acordo com o tipo de 
reação); 
3. Produção de fragmentos complementares ao 
DNA molde com diferentes tamanhos. O tamanho de 
cada fragmento está relacionado a posição que os 
finalizadores foram adicionados; 
4. O produto de cada uma das reações é colocado 
nas canaletas do gel da eletroforese; 
5. Devido ao alto poder de separação dos 
fragmentos apresentado pelo gel é possível separar e 
visualizar os fragmentos diferentes; 
6. As bandas produzidas são lidas através de 
métodos radiográficos. 
 A técnica de Sanger permitiu separar, 
inicialmente, de 200 a 300 nucleotídeos por corrida, ou 
seja, um verdadeiro avanço para época. Porém. o 
aprimoramento da técnica de Sanger levou, por volta 
de 1986, a empresa de biotecnologia Applied 
Biosystems a desenvolver uma máquina de 
sequenciamento automatizada com base no método de 
Sanger. A técnica automatizada permitiu um 
aperfeiçoamento na técnica, tornando-a mais simples, 
rápida e segura, principalmente por não usar 
componentes radioativos. A principal diferença é que 
essas máquinas usam diferentes marcadores 
fluorescentes para marcar cada um dos nucleotídeos. A 
leitura nesse caso acontece quando os marcadores 
fluorescentes inseridos nos nucleotídeos são 
estimulados por raio laser e emitem diferentes 
comprimentos de onda capazes de ser detectados. 
 Além disso, com a adição de marcadores 
fluorescentes nos finalizadores foi possível realizar as 
quatro reações em um único tubo que seriam lidos por 
sequenciadoresautomatizados, realizando a corrida em 
apenas uma coluna. Apesar do custo das placas de 
vidro serem maior, as máquinas fazem o processo em 
muito menor tempo e gerando sequencias mais baratas, 
superando assim o método tradicional de Sanger. O 
sequenciamento do DNA atualmente é totalmente 
automatizado. Esses métodos permitiram gerar 
sequências de DNA, que antes pelo método tradicional 
levavam semanas a meses e eram extremamente 
trabalhosos, em 24 horas. A quantidade de dados 
criados nas técnicas automatizadas gerou a necessidade 
da criação de algoritmos de computador capazes de 
montar o genoma. 
 Com a virada do milênio, novas abordagens 
foram desenvolvidas, denominadas 
de sequenciamento de nova geração ou NGS (Next 
Generation Sequencing). De acordo com Stroher 
(2018), elas se baseiam em um sequenciamento 
paralelo massivo gerando centenas de milhões de 
curtos fragmentos de DNA, com aproximadamente 30 
a 400 nucleotídeos. As NGS mudaram o paradigma de 
sequenciamento usado há mais de trinta anos, mudando 
totalmente o patamar dessas técnicas e as metodologias 
utilizadas. Algumas diferenças podem ser observadas 
em relação ao número de etapas: na técnica de Sanger 
eram necessários dois processos, enquanto na nova 
geração à amplificação dos nucleotídeos e detecção 
podem ser realizados em uma única etapa 
 A vantagem mais marcante em relação aos 
NGS é o custo: após o investimento com o 
equipamento, o valor por megabase é menos que $0,10, 
sendo possível sequenciar genomas completos em 
menos de uma semana. Outra mudança significativa é 
que o método de Sanger produz um baixo rendimento, 
ou seja, para obter bons resultados são necessárias altas 
concentrações de DNA. Além disso, ele fornece 
padrões únicos de sinal, em eletroforese, para cada 
sequência gerada. As NGS, por sua vez, pode ser 
realizada em baixas concentrações de DNA e produz 
milhares de sinais em paralelo para a mesma sequência, 
podendo ser usados pequenas amostras de DNA para 
realização do sequenciamento. Por fim uma, das 
diferenças que vale ser ressaltada é o tamanho da 
sequência produzida. No método de Sanger, mesmo 
após décadas de aprimoramento da técnica, é possível 
obter fragmentos com aproximadamente 100 pares de 
bases. Os primeiros sequenciadores na nova geração 
eram capazes de produzir fragmentos com apenas 150 
a 200 pares de bases. Os sequenciadores atuais podem 
produzir bases de até 500 pares de bases (STROHER, 
2018). 
 Após mais de uma década da descrição dessas 
novas tecnologias, elas vêm ganhando maior 
notoriedade na ciência, com cada vez mais cientistas 
percebendo a superioridade dessas técnicas de nova 
geração. Uma consequência disso é o fato dos centros 
genômicos estarem diminuindo as rotinas com 
sequenciadores Sanger e aumentando as NGS. 
 Segundo Ferreira (2003), a análise da sequência 
genética de vários organismos, em especial, do ser 
humano impulsionou várias áreas da ciência. A 
identificação do gene causador da doença de 
Huntington no cromossomo 4 foi um dos grandes 
sucessos alcançados por essas técnicas e que mostram 
o potencial de aplicação desse tipo de tecnologia. Hoje, 
já são mais de 1.000 doenças que tiveram as regiões 
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cromossômicas especificas mapeadas. O estudo do 
genoma também permitiu demonstrar que os genes 
necessários para o desenvolvimento de um organismo 
como o ser humano, menos que 40.000 genes, é menor 
que a quantidade do genoma de uma planta como o 
arroz, mais que 40.000 genes. A quantidade de dados 
gerados até o momento nos diversos projetos genoma 
são imensos, a comparação de sequência genicas entre 
espécies é uma das melhores utilizações de dados. A 
partir do cruzamento dessas informações é possível a 
criação de catálogos completos de genes, e, 
consequentemente de proteínas dos organismos, o que 
permite desvendar o papel de ambos. 
 Nesse contexto, a ampliação da área 
de bioinformática, para que seja possível interpretar 
esses dados, provenientes de diversos tipos de 
pesquisas genômicas, é fundamental. A expectativa, a 
longo prazo, é utilizar esses dados para entender os 
complexos mecanismos moleculares que operam 
dentro da célula, ou seja, determinar as complexas 
interações proteicas que controlam as várias funções 
celulares, incluindo respostas ao estresse fisiológico, 
entre outros. 
 Diversas aplicações ainda podem ser atribuídas 
às técnicas de sequenciamento genético, o 
conhecimento tão detalhado do DNA humano 
possibilita a identificação as mutações que provocam 
as doenças genéticas. De acordo com Bruno (2017), a 
análise dessas mutações permite um maior 
entendimento dessas doenças e de sua evolução no 
organismo, possibilitando o desenvolvimento de 
terapias, testes diagnósticos, que atuem mesmo antes 
do aparecimento dos sintomas e também fármacos com 
maior especificidade. Outra das aplicações de grande 
impacto na sociedade é o diagnóstico molecular de 
doenças infecciosas. As técnicas de sequenciamento 
permitem a identificação de diversos microrganismos 
como bactérias, vírus, fungos, protozoários. Basta se 
conhecer a sequência total ou parcial do patógeno, para 
que possam se desenhar primers que serviram de 
sondas complementares específicos ao DNA do 
microrganismo especifico. 
 Dessa forma, é coletado material biológico do 
indivíduo e são feitos os processos de extração de 
DNA, juntamente ao DNA do patógeno. Caso o 
paciente esteja infectado, apenas o DNA do patógeno 
será amplificado em PCR, já que os primers 
adicionados se ligaram ao DNA do microrganismo. A 
partir desse método, é possível também fazer a 
quantificação dos agentes infecciosos, sendo esse 
procedimento importantes para: avaliações de 
contaminantes ambientais; determinação do nível de 
infecções; dosagem de carga viral; concentração de 
agentes patogênicos em vacinas. 
 As tecnologias do DNA, em especial seu 
sequenciamento, tem aplicações também na 
identificação de paternidade e culpados em crimes. 
Essa área é conhecida como ciência forense e foca no 
estudo dos polimorfismos de pequenas sequências de 
nucleotídeos que se repetem em sequência. Várias 
áreas como essas, denominadas microssatélites, são 
identificadas gerando um padrão de bandas em 
eletroforese semelhante a um código de barras. Visto 
que combinação de dois alelos de cada uma das várias 
regiões analisadas determinam perfis únicos de DNA 
para cada indivíduo, exceto para gêmeos univitelinos, 
possibilitando a identificação de parentesco ou do 
DNA de vítimas ou criminosos cadastrados. 
 A PCR é usada hoje em muito laboratórios de 
pesquisa, de diagnóstico ou nas mais variadas 
industrias, tendo aplicações na identificação de DNA 
fetal, teste pré-natal, identificação de DNA bacteriano, 
observar polimorfismos. O mercado busca 
profissionais altamente especializados nessas mais 
variadas tecnologias de DNA e quem tenham 
disponibilidade para capacitação constate e verdadeiro 
amor pela genética e biologia molecular, a realização 
de cursos de especialização, cursos de pós-graduação 
são o caminho mais indicado para entrar nesse 
mercado, já que exigida excelência aos profissionais 
que trabalharam com técnicas, por vezes, de alta 
complexidade.