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Autoras: Profa. Kátia Regina Silva Aranda Profa. Sabrina da Silva Sabo Colaboradores: Prof. Juliano Rodrigo Guerreiro Profa. Marília Tavares Coutinho da Costa Patrão Microbiologia de Alimentos Professoras conteudistas: Kátia Regina Silva Aranda / Sabrina da Silva Sabo Kátia Regina Silva Aranda Graduada no curso de Ciências Biológicas na modalidade médica pela Universidade de Mogi das Cruzes (UMC) em 1999. Possui doutorado, concluído em 2005, e pós-doutorado pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), concluído em 2010. Professora e pesquisadora desde 2005, nas áreas das ciências da saúde, como microbiologia e biotecnologia, e professora pela Universidade Paulista (UNIP), lecionando no curso de Farmácia, em São Paulo, desde 2019. Sabrina da Silva Sabo Graduada em Farmácia pela Universidade São Francisco (USF) em 2009. Possui especialização lato sensu em Microbiologia Ambiental e Industrial pela Sociedade Brasileira de Microbiologia (2011/2012), doutorado em Ciências pelo Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica na Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo (USP), em 2017, e pós-doutorado em Microbiologia Aplicada pela mesma instituição, em 2018. Trabalhou durante oito anos (2005-2012) no Laboratório Universitário de Análises Clínicas do Hospital Universitário São Francisco (Bragança Paulista, SP), dos quais durante três anos atuou como responsável técnica pela unidade de microbiologia. Adquirindo experiência em microbiologia clínica e industrial, sobretudo em processos biotecnológicos, com ênfase em bioprospecção, fermentação, bem como produção, purificação e aplicação de biomoléculas de interesse industrial. Leciona na Universidade Paulista (UNIP) nos cursos de Farmácia, Biomedicina e Ciências Biológicas, no campus de São Paulo, desde 2019. © Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) A662m Aranda, Kátia Regina Silva. Microbiologia de Alimentos / Kátia Regina Silva Aranda, Sabrina da Silva Sabo. – São Paulo: Editora Sol, 2021. 148 p., il. Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230. 1. Microrganismo. 2. Conservação. 3. Produção. I. Aranda, Kátia Regina Silva. II. Sabo, Sabrina da Silva. III. Título. CDU 579.67 U511.72 – 21 Prof. Dr. João Carlos Di Genio Reitor Prof. Fábio Romeu de Carvalho Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças Profa. Melânia Dalla Torre Vice-Reitora de Unidades Universitárias Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Graduação Unip Interativa – EaD Profa. Elisabete Brihy Prof. Marcello Vannini Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar Prof. Ivan Daliberto Frugoli Material Didático – EaD Comissão editorial: Dra. Angélica L. Carlini (UNIP) Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR) Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT) Apoio: Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos Projeto gráfico: Prof. Alexandre Ponzetto Revisão: Jacinara Albuquerque Vera Saad Sumário Microbiologia de Alimentos APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7 Unidade I 1 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ...........................................................................9 1.1 Panorama brasileiro e mundial de surtos relacionados a DTA ........................................... 11 2 FATORES QUE INTERFEREM NO CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS .................... 15 2.1 Fatores intrínsecos ............................................................................................................................... 15 2.1.1 Atividade de água ................................................................................................................................... 15 2.1.2 pH .................................................................................................................................................................. 19 2.1.3 Potencial oxidação-redução ............................................................................................................... 21 2.1.4 Composição nutricional ....................................................................................................................... 23 2.1.5 Presença de substâncias naturalmente antimicrobianas ....................................................... 24 2.1.6 Presença de microbiota natural ........................................................................................................ 25 2.1.7 Aula prática ............................................................................................................................................... 26 2.2 Fatores extrínsecos .............................................................................................................................. 28 2.2.1 Umidade relativa do ambiente .......................................................................................................... 29 2.2.2 Composição química do ambiente .................................................................................................. 31 2.3 Teoria dos obstáculos de Leistner .................................................................................................. 35 2.4 Deteriorações dos alimentos por microrganismos ................................................................. 38 2.4.1 Alterações físicas dos alimentos causadas por contaminação microbiana .................... 38 2.4.2 Alterações químicas dos alimentos causadas por contaminação microbiana .............. 41 3 MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS .................................................................................... 44 3.1 Conservação por agentes químicos .............................................................................................. 45 3.2 Conservação por agentes físicos .................................................................................................... 47 3.2.1 Métodos de remoção............................................................................................................................. 48 3.2.2 Métodos de conservação por altas temperaturas ..................................................................... 49 3.2.3 Métodos de conservação por desidratação ................................................................................. 52 3.2.4 Métodos de conservação por baixas temperaturas .................................................................. 54 3.2.5 Método de conservação por radiação ionizante ........................................................................ 56 4 UTILIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS PARA A PRODUÇÃO DE ALIMENTOS .............................. 57 4.1 Produção de queijos ............................................................................................................................ 59 4.2 Produção de outros produtos lácteos .......................................................................................... 59 4.3 Produção de pão ................................................................................................................................... 60 4.4 Produção de bebidas alcoólicas e vinagre .................................................................................. 61 Unidade II 5 PRINCIPAIS DOENÇAS RELACIONADAS AOS AGENTES TRANSMITIDOSPOR ALIMENTOS .................................................................................................................................................. 69 5.1 A importância dos agentes causadores de doença ................................................................ 70 5.2 Doenças de origem alimentar ......................................................................................................... 71 5.3 Agentes causadores de DTA ............................................................................................................. 71 5.3.1 Bactérias ..................................................................................................................................................... 72 5.3.2 Vírus.............................................................................................................................................................. 98 5.3.3 Fungos .......................................................................................................................................................100 5.3.4 Parasitas ....................................................................................................................................................103 5.4 Intoxicações químicas ......................................................................................................................110 6 PRINCIPAIS MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS EM ALIMENTOS (MICRORGANISMOS INDICADORES) ........................................................................111 6.1 Microrganismos indicadores ..........................................................................................................111 6.2 Indicadores de contaminação fecal ou da qualidade higiênica do alimento ............112 6.3 Métodos de análise ............................................................................................................................113 6.3.1 Amostragem ............................................................................................................................................ 113 6.3.2 Preparação da amostra ....................................................................................................................... 114 6.3.3 Métodos de contagem de microrganismos ................................................................................ 114 6.3.4 Isolamento e identificação de microrganismos ....................................................................... 115 7 PRINCIPAIS FERRAMENTAS DE CONTROLE DE MICRORGANISMOS: APPCC E BOAS PRÁTICAS ..............................................................................................................................115 7.1 Sistema APPCC ....................................................................................................................................116 7.1.1 Preparar um fluxograma do processo .......................................................................................... 116 7.1.2 Identificar os perigos e avaliar sua gravidade .......................................................................... 117 7.1.3 Determinar os pontos críticos de controle ................................................................................. 117 7.1.4 Instituir medidas e estabelecer critérios para assegurar o controle ................................ 118 7.1.5 Monitorar os pontos críticos de controle e registrar os dados .......................................... 118 7.1.6 Agir na correção quando os critérios não são atingidos ...................................................... 119 7.2 Implantação do sistema APPCC ...................................................................................................119 7.3 Boas Práticas ........................................................................................................................................120 7.3.1 Boas práticas de higiene (BPF) ....................................................................................................... 120 8 AULAS PRÁTICAS: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA E DE LEITES E DERIVADOS .......... 121 8.1 Aula prática – análise microbiológica de água ......................................................................121 8.1.1 Coliformes totais: método da membrana filtrante ................................................................ 124 8.2 Aula prática – análise microbiológica de leites e derivados .............................................125 7 APRESENTAÇÃO Ao estudar esta disciplina, mostraremos a você todos os fatores que contribuem para as alterações dos alimentos causadas pelo mundo microbiano, ou seja, além de conhecer o controle higiênico sanitário de alimentos, vamos conhecer também as principais doenças de origem microbiana transmitidas por alimentos, quais fatores contribuem para a proliferação de microrganismos e como identificá-los nos alimentos. Em nosso dia a dia, e onde quer que estejamos, estamos sempre cercados por microrganismos, que podem nos trazer benefícios ou, então, serem bastante indesejados. Saber lidar com esses seres minúsculos deve ser o grande diferencial dos profissionais da área da saúde. Assim sendo, mostraremos a você que algumas espécies de microrganismos são capazes de causar o que chamamos de doenças transmitidas por alimentos (DTA) e que, em situações extremas, podem ser grande problema de saúde pública, devido à capacidade de essas DTA evoluírem para um surto alimentar. Mas como podemos frear a disseminação dessas DTA? A resposta está em conhecer a composição química e as condições ideais de armazenamento dos alimentos, ou seja, saber seus fatores intrínsecos e extrínsecos. Sem dúvida, estabelecer a relação do alimento com os microrganismos nos abre um mundo de informações que nos permite entender os processos de alterações do alimento e, não mais importante, as doenças causadoras de surtos alimentares, sendo algumas delas com número elevado de óbitos. Este conteúdo prepara você para traçar um plano de análise microbiológica de alimentos desde a amostragem até a liberação do resultado. Lembre-se de que é muito importante se manter organizado em seus estudos. Dessa forma, será possível acompanhar melhor a evolução dos conteúdos, além de evoluir adequadamente na construção do seu conhecimento. INTRODUÇÃO Neste livro-texto, você vai entender o porquê de alguns alimentos durarem mais que outros; o porquê de alguns alimentos serem mais macios ou crocantes que outros; o porquê de alguns terem um gosto mais ácido, entre outros diferentes aspectos. No entanto conhecer apenas as características dos alimentos não é o suficiente para controlar o crescimento indesejado dos microrganismos. É preciso também conhecer as preferências nutricionais e ambientais desses seres, ou seja, saber que existem, por exemplo, microrganismos que se adaptam muito bem ao frio da geladeira e aqueles que sobrevivem a altas temperaturas, sendo um grande problema para as indústrias alimentícias. A partir do conhecimento das características dos alimentos, bem como dos microrganismos, você estará pronto para saber como controlá-los. Assim, também mostraremos os principais métodos de conservação dos alimentos e como cada um deles agirá sobre os microrganismos indesejáveis. Mas é preciso ter em mente que eles nem sempre são vilões. Logo, você perceberá que, sem a presença de algumas espécies microbianas em nossas vidas, não poderíamos apreciar um bom vinho ou uma boa cerveja, acompanhados por um queijo delicioso e um pão fresquinho e crocante. 8 Inicialmente, abordaremos as características químicas e ambientais que favorecem o crescimento microbiano e as alterações dessas mesmas características. Em seguida, vamos compreender o controle higiênico-sanitário de alimentos e os principais microrganismos relacionados com DTAs (doenças transmitidas por alimentos), bem como suas características as das doenças. Mais adiante, apresentaremosas principais técnicas de identificação e quantificação de microrganismos em alimentos, além dos meios de eliminação e/ou diminuição da carga microbiana. E, por fim, vamos compreender as principais ferramentas de controle de microrganismos. Após essa jornada, você será capaz de considerar os possíveis microrganismos envolvidos, de acordo com características dos alimentos e comparação dos resultados obtidos com o preconizado por legislações vigentes. Também saberá reconhecer as alterações resultantes de crescimento microbiano em alimentos. Desejamos um bom estudo e esperamos que você alcance um dos objetivos maiores na sua trajetória acadêmica, que é o conhecimento, capaz de fazer toda a diferença na sua carreira profissional. 9 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Unidade I 1 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Todos sabemos que os microrganismos estão por todas as partes. Eles já existiam na Terra há bilhões de anos antes do surgimento das plantas e dos animais. Embora sejam as menores formas de vida, coletivamente eles representam a maior parte da biomassa do nosso planeta e desempenham funções essenciais para os outros seres vivos. Na realidade, seres humanos, plantas e animais são intimamente dependentes da atividade microbiana para reciclagem de nutrientes e para a degradação da matéria orgânica, ou seja, nenhuma outra forma de vida é tão importante para manutenção da vida na Terra quanto os microrganismos. Os microrganismos podem realizar modificações benéficas nos alimentos e de grande interesse para a indústria, mas também podem ser a causa de deteriorações e DTA. A deterioração dos alimentos ocorre naturalmente por ação dos microrganismos que utilizam os nutrientes ali presentes como fonte de energia, sendo, portanto, elementos imprescindíveis para o crescimento celular. Ao se desenvolverem em um determinado alimento, os microrganismos desencadearão modificações de cor, odor, sabor, textura e aspecto (representadas na figura a seguir). Essas características representam o resultado não apenas da multiplicação indesejada do microrganismo em questão, mas também de transformações químicas influenciadas pelos seus produtos metabólicos. A deterioração microbiana é uma questão bastante preocupante para as indústrias do ramo, já que grandes perdas econômicas são relatadas anualmente. A) B) C) D) E) Figura 1 – Exemplos de modificações organolépticas e sensoriais em alguns alimentos: A) pão; B) queijo; C) feijão; D) tomate; E) frango 10 Unidade I Além dos microrganismos deteriorantes, os alimentos também estão predispostos a contaminações por microrganismos genericamente denominados “patogênicos”. As vias de contaminação de alimentos por esses microrganismos são inúmeras e estão diretamente relacionadas às más condições de higiene durante todo o processamento de um alimento, ou seja, na produção, no armazenamento, na distribuição e no manuseio. O que devemos considerar é que os alimentos contaminados por patógenos representam um risco à saúde de quem os consome, pois nem sempre liberam substâncias que deixam os alimentos com características indesejadas, tal como fazem os microrganismos deteriorantes. Portanto, em muitas situações, o patógeno pode estar presente no alimento e o indivíduo faz seu consumo sem se dar conta de sua existência, podendo ser acometido pelas DTA. As DTA podem se manifestar por meio de infecções, quando o indivíduo ingere um alimento que contenha agentes patogênicos, por intoxicações alimentares, quando uma pessoa ingere alimentos com substâncias tóxicas produzidas por microrganismos, e por toxinfecções, que resultam da ingestão de alimentos que apresentam microrganismos patogênicos que produzem toxinas tanto nos alimentos como durante passagem pelo trato intestinal. A figura a seguir traz exemplos de microrganismos que podem causar cada uma dessas manifestações clínicas. O consumo de alimentos crus ou mal cozidos que tenham entrado em contato com fezes, principalmente de aves, contaminadas por salmonella sp. podem causar a salmonelose, uma das mais frequentes DTAs. O consumo de alimentos embutidos, enlatados e em conservas produzidos em condições sanitárias precárias podem ser veículos da toxina botulínica produzida por C. botulinium, causando o botulismo alimentar. A cólera é uma doença infecciosa intestinal aguda, transmitida por contaminação fecal-oral direta ou pela ingestão de água ou alimentos, contaminados por V. cholerae, o qual libera uma toxina que se liga às paredes intestinais provocando diarreias aquosas. A) Infecção B) Intoxicação C) Toxinfecção Salmonella sp. Clostridium botulinium Vibrio cholerae Figura 2– Exemplos de microrganismos causadores de DTA, as quais se manifestam em infecções, intoxicações e toxinfecções 11 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS São documentados cerca de 250 tipos de DTA em todo o mundo, sendo que a maioria são por bactérias e suas respectivas toxinas, ou então, por vírus e fungos. Devido à diversificação dos fatores causais das DTA, não há um quadro clínico específico, mas os sintomas clássicos são: náuseas; vômitos; dores abdominais; diarreia; falta de apetite e febre. A característica e a intensidade das DTA dependem do tipo de alimento, do perfil imunológico do indivíduo afetado e, principalmente, do microrganismo em questão. Embora os microrganismos sejam muitas vezes vistos como vilões, é importante esclarecer que nem todos provocam efeitos nocivos aos produtos e aos seus consumidores. Ao contrário do que se pensa, a presença de determinados microrganismos em alimentos é desejada e, muitas vezes, essencial, tal como aqueles presentes em alimentos fermentados, como o iogurte e o queijo, por exemplo. As características organolépticas e sensoriais particulares desses alimentos fermentados só são possíveis graças à presença de microrganismos específicos que, ao utilizarem os nutrientes do leite como fonte de energia para o crescimento celular, produzem substâncias como ácidos lático, propiônico e acético, que causam alterações desejadas ao alimento, modificando suas propriedades originais, transformando-o em um novo produto. Os produtos de panificação e bebidas alcoólicas são exemplos adicionais dos benefícios dos microrganismos fermentadores. Espécies de leveduras, ao utilizarem os carboidratos e proteínas desses alimentos para se multiplicarem e se desenvolverem, produzem dióxido de carbono (CO2) como produto de suas atividades metabólicas, responsável pelo crescimento da massa do pão. No caso de bebidas alcoólicas, como o vinho e a cerveja, leveduras específicas são colocadas sobre uvas e malte, respectivamente, e, ao utilizarem os nutrientes desses alimentos, esses microrganismos produzirão o etanol como produto metabólico. Assim, conhecer os agentes responsáveis pelas ações mencionadas e saber quais as características químicas e ambientais que favorecem ou desfavorecem seus crescimentos são informações muito valiosas que permitirão que compreendamos qual a melhor forma de controlá-los. 1.1 Panorama brasileiro e mundial de surtos relacionados a DTA Você, provavelmente, já deve ter ouvido falar que existe uma relação entre o consumo de um alimento contaminado com o que chamamos de “surto” alimentar. Um surto alimentar define-se como um incidente no qual duas ou mais pessoas apresentam a mesma doença, sintomas semelhantes ou excretam os mesmos patógenos, e isso é ocasionado pela ingestão de um alimento e/ou água da mesma fonte contaminada ou que foram contaminados da mesma forma. Um dos primeiros grandes surtos bem-documentados ocorreu na Escócia em 1964, quando mais de 500 pessoas foram contaminadas por Salmonella typhi ao consumirem uma espécie de carne enlatada produzida por uma indústria que não havia feito o correto tratamento das águas utilizadas para o resfriamento das latas do produto após a esterilização. Em relação a esse caso, acredita-se que o microrganismo tenha adentrado as latas por meiode suas fissuras ou de suas emendas. 12 Unidade I O gênero Salmonella é um dos principais patógenos responsáveis por DTA em todo o mundo. No Brasil, desde a década de 1980, esse microrganismo tem sido descrito como agente causador de surtos de gastroenterites causadas pela ingestão de diversos alimentos. Até meados do século XX, o perfil epidemiológico das DTA no Brasil ainda era pouco conhecido. Escassos estados e/ou municípios dispunham de estatísticas e levantamentos confiáveis sobre os agentes etiológicos frequentes e os alimentos que mais causavam esse tipo de doença. Apenas em 1998, o Ministério da Saúde, por meio do Sistema de Vigilância Sanitária, implantou o programa de Vigilância Epidemiológica das DTA (VE-DAT) que, a partir de 1999, começou a investigar surtos. Desde então, surtos e casos de DTA têm sido acompanhados rigorosamente e, em conjunto com vigilância epidemiológica, vigilância sanitária, vigilância ambiental, assistência em saúde, defesa e inspeção agropecuária, laboratório e outras áreas e instituições parceiras, a VE-DAT tem como principal função controlar e prevenir essas ocorrências. A notificação de casos de DTA tornou-se obrigatória por meio do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan), o qual notifica, anualmente, em média, 700 surtos de doenças transmitidas por alimentos, com envolvimento de 13 mil doentes e dez óbitos. Os microrganismos mais frequentemente isolados em alimentos causadores de surtos alimentares no Brasil são representados na figura a seguir. 23,4% N = 2.431 surtos 0% Esc he ric hia co li Sa lm on ella sp p. Sta ph ylo vo vvu s a ure us Co lifo rm es No rov íru s Ro tav íru s Sh ige lla Ba cik ku s C ere us Clo str idi um pe rfr ing en s Vír us da He pa tite A 15% 30% 5% 20% 35% 10% 25% 40% 11,3% 9,4% 6,5% 3,9% 3,1% 3,0% 2,3% 1,6% 1,2% Figura 3 – Distribuição dos microrganismos mais isolados nos surtos de DTAs no Brasil entre 2009 a 2018 13 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Saiba mais Para conhecer um pouco mais sobre as DTA no Brasil, bem como a situação epidemiológica dos surtos alimentares em nosso país, acesse: BRASIL. Ministério da Saúde. Surtos de doenças transmitidas por alimentos no Brasil. Informe 2018. 2019. Disponível em: https://bit.ly/3hP41XC. Acesso em: 5 nov. 2020. Neste momento, você deve estar se perguntando: mas de onde vêm esses patógenos que contaminam nossos alimentos? Para a sua pergunta, existem várias respostas. As origens das contaminações são variadas, no entanto, as principais fontes são: o solo e a água, plantas, utensílios, trato gastrointestinal de humanos e animais, manipuladores de alimentos, ração animal, pele dos animais, ar e poeira. Veja a figura a seguir para mais detalhes. Microrganismos do solo podem, através do vento, contaminar o ar e posteriormente chegar até os copors hídricos através da chuva A) Solo e água E) Manipuladores de alimentos B) Plantas F) Ração animal C) Utensílios G) Pele dos animais D) Trato gastrointestinal H) Ar e poeira A microbiota das mãos e roupas dos manipuladore pode ser proveniente do solo, água, poeira, entre outros. Outras fontes importantes são fossas nasais, a boca e a pele Os microrganismos que contaminam plantas possuem mecanismos de adesão à superfície destas, de onde obtêm nutrientes Representa importante fonte de contaminação por Salmonella e Listeria monocytogenes em aves e outros animais A higienização inadequada de utensílios de cozinha resulta na transmissão de microrganismos de um alumento para outro (contaminação cruzada) Fonte importante de contaminação, principalmente do leite. Microrganismos encontrados nesse alimento podem ser os mesmos da pele dos animais se a ordenha dor realizada sem higiene Rico em microrganismos, não apenas em quantidade, mas também em variedade. Esta é a principal fonte dos alimentos com miroganismos enteropatogênicos Embora, em teoria, todos os microrganismos possam ser encontrados no ar, os que melhor sobrevivem nesse ambiente são as bactérias Gram-positivas e os fungos Figura 4 – Principais fontes de contaminação por microrganismos em alimentos 14 Unidade I Ainda que existam programas que exijam o controle rigoroso da qualidade e segurança dos alimentos e/ou da água, a ocorrência de surtos alimentares no mundo vem aumentando consideravelmente. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), em escala global, uma a cada dez pessoas é acometida por DTA, e, no montante, 33 milhões de vidas são perdidas anualmente. As causas do aumento de surtos são variadas, mas aqui destacamos o aumento das populações, a existência de grupos de pessoas mais susceptíveis (bebês, grávidas, imunodeprimidos e idosos), um processo de urbanização sem organização, a necessidade de produzir alimentos em grandes quantidades, além de fiscalização sanitária deficiente tanto nos órgãos públicos quanto nos privados. Como mencionado anteriormente, existem muitos tipos de DTA, e muitas vezes os agentes responsáveis produzem sintomas muito parecidos, o que dificulta o diagnóstico clínico. Nesse sentido, quando existe uma suspeita de surto causado pela ingestão de algum alimento e/ou água, o diagnóstico é realizado não apenas baseado nos sintomas dos pacientes, mas, principalmente, por exames laboratoriais específicos. De modo geral, para chegar ao diagnóstico do agente etiológico causador do surto de DTA, recomenda-se a coleta de fezes dos indivíduos envolvidos e, também, do alimento suspeito. É importante enfatizar que toda a investigação é acompanhada de perto pela vigilância sanitária e vigilância ambiental, pelo Laboratório Central de Saúde Pública (Lacen), além da autoridade sanitária local que deverá realizar a inspeção sanitária do estabelecimento produtor do alimento suspeito, coletar amostras de água e alimentos e utilizar swabs (demonstrado na figura a seguir) para coleta de amostras da superfície de utensílios e outras. Todas essas operações de investigação devem ocorrer logo após a notificação do surto, que deverá resultar em atividades para obter informações epidemiológicas e propor medidas de intervenção, prevenção e controle. Figura 5 – Swab utilizado para coletar amostras de superfícies diversas Sabendo da gravidade das DTA, o que se pode fazer para preveni-las? Para prevenção, recomenda-se lavar as mãos regularmente; consumir alimentos frescos com boa aparência, os quais devem ser previamente lavados e desinfetados; desinfetar hortifrúti emergindo-os em hipoclorito de sódio a 2,5% para cada litro de água tratada; lavar ovos com água potável imediatamente antes de serem utilizados e evitar consumi-los crus (ex.: gemada, maionese caseira; frito com a gema mole); manter alimentos 15 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS perecíveis em temperatura ambiente por um tempo mínimo, só até serem de fato preparados; reaquecer bem os alimentos que tenham sido congelados ou refrigerados antes de comê-los; na hora da compra dos alimentos, verificar se são comercializados por empresas confiáveis, além da necessidade de checar a validade, as condições de armazenamento e seus aspectos físicos, ou seja, aparência, consistência e odor; não beber leite cru nem consumir derivados de leite não pasteurizados; evitar o contato entre alimentos não cozidos e alimentos prontos para o consumo para impedir o que chamamos de contaminação cruzada; beber água e consumir gelo apenas de locais de procedência conhecida; não consumir alimentos cárneos e derivados crus ou malcozidos/assados. Se nenhuma dessas medidas preventivas for efetiva e, inevitavelmente, ocorrer DTA, o tratamento será baseado em estratégias para evitar a desidratação e o óbito. Geralmente, os sintomas desaparecem em alguns dias, mas, se a febre persistir por mais de três dias, se houver a presença de sangue nas fezes e desidratação severa, será necessária a antibioticoterapia. Também é fundamental beber bastante água, principalmenteaqueles que apresentarem quadros agudos de diarreia. 2 FATORES QUE INTERFEREM NO CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS Os alimentos são matrizes quimicamente complexas, e, de modo geral, fornecem a maioria dos nutrientes necessários para a multiplicação de diversas espécies microbianas. É importante dizer que a maioria dos alimentos possui o que chamamos de contaminação inicial, sendo proveniente da matéria-prima usada em sua elaboração e/ou das condições de higiene durante sua produção (ambiente, manipuladores e superfícies). Para considerar um alimento seguro para o consumo, é necessário verificar sua qualidade microbiológica, que dependerá não apenas de quantidade e tipos de organismos presentes, mas também da capacidade de sobrevivência e multiplicação nesse alimento. Muitos fatores podem favorecer, impedir ou limitar a multiplicação de microrganismos em alimentos e aqui, nesta unidade, serão divididos em dois grupos: fatores intrínsecos e fatores extrínsecos. 2.1 Fatores intrínsecos Os fatores intrínsecos são aqueles relacionados às características próprias do alimento, como a atividade de água (Aa), o pH, o potencial de oxirredução, os nutrientes disponíveis, a presença de substâncias naturalmente antimicrobianas e a presença de microbiota natural. Esses fatores serão individualmente discutidos nos itens a seguir. 2.1.1 Atividade de água Sabemos o quanto a água é importante para os seres humanos. Para os microrganismos isso não é diferente e o metabolismo e a multiplicação desses seres nos alimentos dependem da quantidade de água. Basicamente, os alimentos possuem dois tipos de água em sua composição: a água livre e a água ligada (ver figura). 16 Unidade I Água ligada Água livre Figura 6 – Representação da água livre e da água ligada nos alimentos A água ligada está fortemente associada às macromoléculas do alimento, e, devido a isso, o crescimento de microrganismos e o desenvolvimento de reações químicas não são possíveis de ocorrerem quando se utiliza esse tipo de água. Já a água livre está presente nos espaços intergranulares do alimento, e suas moléculas não estão ligadas a nenhum de seus componentes. Atua como meio de distribuição de nutriente para o crescimento de microrganismos e/ou reações químicas e enzimáticas. Para saber o quanto de água livre temos em um alimento, deve-se determinar o parâmetro denominado “atividade de água” (Aa). A Aa é um parâmetro de fundamental importância para as indústrias alimentícias, já que está diretamente relacionada com crescimento microbiano, com reações químicas não desejadas e, também, com a textura dos alimentos. A determinação da Aa em um alimento não fornece uma estimativa totalmente real da quantidade de água livre, entretanto, pode-se predizer a velocidade de seu crescimento microbiano, bem como de outras reações de deterioração, sendo, portanto, um indicador útil para prever a estabilidade de um produto e sua segurança microbiológica. Por não estar ligada a nenhum componente do alimento, a água livre é muito mais volátil do que a água ligada e, por esse motivo, é ela quem evapora para atingir uma umidade relativa de equilíbrio (URE) em um determinado ambiente, a uma dada temperatura. Portanto, o parâmetro Aa pode ser definido como a razão existente entre a pressão parcial do vapor da água da amostra de um alimento e da pressão parcial do vapor da água pura, em uma determinada temperatura. Ou seja, é a pressão necessária para que as moléculas de água livre do alimento e da água pura entrem em estado de vapor em dada temperatura, podendo ser resumida como a mobilidade da água até entrar em equilíbrio com o meio. Veja essa relação na figura a seguir. 17 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Pressão parcial de vapor de amostra de alimento Pressão parcial de vapor da água pura Atividade de água = Pressão parcial de vapor de amostra de alimento Pressão parcial de vapor da água pura Figura 7 – Representação da definição de atividade de água nos alimentos Na pressão atmosférica ao nível do mar (1 atm), sob temperatura de 25 °C, a água pura é uma medida de estado padrão, sendo sua Aa igual a 1,00. Já nos alimentos, a Aa sempre será menor que 1,00 (veja a tabela a seguir), pois seus componentes diminuem a mobilidade da água. Além disso, substâncias como o sal e o açúcar podem ser intencionalmente adicionadas a um alimento visando a redução da sua Aa, diminuindo a água disponível para o metabolismo microbiano e, consequentemente, estendendo sua validade. A disponibilidade da água livre em um alimento também pode ser reduzida por meio do processo de desidratação (remoção completa da água) e do congelamento, estratégias frequentemente utilizadas pelas indústrias de alimentos. Tabela 1 – Valores de atividade de água (Aa) em alguns alimentos Alimentos Aa Frutas frescas e vegetais > 0,97 Aves e pescados frescos > 0,98 Carnes frescas > 0,95 Pão ~ 0,96 Queijo parmesão ~ 0,76 Carnes curadas ~ 0,95 Geleia ~ 0,80 Gelatina ~ 0,94 Arroz cozido ~ 0,87 Farinha de trigo ~ 0,87 Mel ~ 0,75 Cereais ~ 0,20 Açúcar ~ 0,10 Adaptada de: Franco; Landgraf (2008, p. 14). 18 Unidade I Os microrganismos exigem um mínimo de Aa para se multiplicarem e se desenvolverem em um alimento. Os valores mínimos relatados para alguns patógenos e microrganismos deteriorantes são representados na tabela a seguir. Tabela 2 – Valores mínimos de Aa exigidos por alguns patógenos alimentares e microrganismos deteriorantes para multiplicação em alimentos Microrganismo Mínimo de Aa para crescimento Bactérias deteriorantes ~ 0,90 Fungos deteriorantes ~ 0,62-0,85 Clostridium botulinum (causador do botulismo) 0,94-0,97 Escherichia coli (um dos principais causadores de gastroenterite) ~ 0,93 Salmonella (um dos principais causadores de gastroenterite) ~ 0,94 Listeria monocytogenes (um dos principais causadores de gastroenterite) ~ 0,92 Staphylococcus aureus (causador de toxinfecção alimentar) ~ 0,85 Vibrio cholerae (causador da cólera) ~ 0,97 Adaptada de: Franco; Landgraf (2008, p. 108). É importante dizer que a Aa de um alimento não é um valor fixo e pode variar durante a estocagem ou dependendo dos nutrientes presentes. No entanto, de modo geral, quanto mais elevada for a Aa de um determinado alimento, mais rápido os microrganismos serão capazes de crescer. Portanto, conhecer a Aa de um alimento é fundamental para que as indústrias alimentícias consigam prever e propor a melhor estratégia de conservação que possa prevenir o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis. Isso inclui projetos de embalagens que protejam o produto contra a umidade do ambiente, a estimativa do prazo de validade e a definição das condições ideais de armazenamento durante a estocagem ou durante o consumo. Além disso, para aqueles produtos alimentícios que utilizam microrganismos em sua produção, como a cerveja e o queijo, por exemplo, é necessário garantir um ambiente com Aa adequada para seus desenvolvimentos. Observação Uma alta concentração de açúcar é tradicionalmente utilizada para a conservação de produtos que contenham frutas, como geleias e conservas, pois, quanto maior a concentração de solutos, maior a interação com as moléculas de água livre que as tornam menos disponíveis para o desenvolvimento dos microrganismos. Com esse mesmo objetivo, o sal também é frequentemente utilizado para estender o prazo de validade de peixes e carnes, bacalhau e carne seca, por exemplo. 19 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Também é importante reforçar que a Aa é apenas um dos fatores que devem ser avaliados para garantir a preservação dos alimentos, pois ainda há de se considerar outros fatores importantes, que serão detalhados nos itens a seguir. 2.1.2 pH Os microrganismos possuem preferências específicas em relação ao pH do meio, onde poderão crescer e multiplicar. Dentro de uma faixa de pH, haverá um valor mínimo em que determinado microrganismo poderá crescer, um valor ótimo, o qual favorecerá seu ritmo de multiplicação,e um valor máximo, que representa uma condição extrema à qual esse microrganismo poderá estar presente. De modo geral, uma faixa de pH entre 6,5 e 7,5, ou seja, valores de pH neutro, é a mais propícia para a maioria dos microrganismos. No entanto, observa-se que, quando comparados com bactérias, os bolores e leveduras são mais tolerantes a extremos de pH e, portanto, são predominantes sob essas condições. Entre o grupo das bactérias, as patogênicas são as mais exigentes em relação a esse fator. A tabela a seguir demonstra os valores de pH exigidos para o crescimento de microrganismo de importância alimentar. Tabela 3 – Valores de pH para multiplicação de alguns microrganismos de interesse à área de alimentos Microrganismo pH Mínimo Ótimo Máximo Bactérias Clostridium botulinum 4,8-5,0 6,0-8,0 8,5-8,8 Escherichia coli 4,3-4,4 6,0-8,0 9,0-10,0 Salmonella spp. 4,5-5,0 6,0-7,5 8,0-9,6 Staphylococcus aureus 4,0-4,7 6,0-7,0 9,5-9,8 Lactobacillus spp. 3,0-4,4 5,5-6,0 7,2-8,0 Leveduras Saccharomyces cerevisiae 2,0-2,4 4,0-5,0 10,0-10,5 Bolores Aspergillus niger 1,2 3,0-6,0 10,0 Penicillium spp. 1,9 4,5-6,7 9,3 Fusarium spp. 2,1 6,7-7,2 10,0 Adaptada de: Franco; Landgraf (2008, p. 17). Esses valores não podem ser tomados como regras, pois, assim como o que foi discutido com a Aa, o crescimento dos microrganismos pode ser afetados por outros fatores que agem simultaneamente. No entanto, conhecer as condições de preferências de crescimento dos principais patógenos alimentares é bastante útil para prever em que alimentos eles poderão se proliferar, já que os alimentos também possuem seus respectivos pHs. 20 Unidade I Na tabela a seguir, está exposto o pH aproximado de alguns alimentos: Tabela 4 – Valores de pH de alguns alimentos Alimento pH Vegetais Alface 5,0 Azeitona 3,6-3,8 Batata 5,3-5,6 Berinjela 4,5 Brócolis 6,5 Cenoura 4,9-6,0 Feijão 4,6-6,5 Milho 7,3 Tomate 4,2-4,3 Frutas Banana 4,5-4,7 Laranja (suco) 3,6-4,3 Maçã 2,9-3,3 Melão 6,3-6,7 Uva 3,4-4,5 Carnes Bovina moída 5,1-6,2 Frango 6,2-6,4 Presunto 5,9-6,1 Pescado Atum 5,2-6,1 Camarão 6,8-7,0 Salmão 6,1-6,3 Laticínios Leite 6,3-6,5 Manteiga 6,1-6,4 Queijo 4,9-5,9 Alimentos prontos para o consumo Omelete 6,6-7,0 Arroz branco cozido 4,5-5,2 Feijão cozido 5,3-6,4 Frango xadrez 5,3-6,4 Maionese de legumes 3,7-4,4 Picles < 3,5 Adaptada de: Franco; Landgraf (2008, p. 18). 21 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Segundo Franco e Landgraf (2008), considerando seus respectivos pHs, os alimentos são classificados em três grupos: os alimentos com baixa acidez, que possuem pH superior a 4,5; os alimentos ácidos, que são aqueles que possuem pH entre 4,0 e 4,5; e os alimentos muito ácidos, que têm pH abaixo de 4,0. De modo geral, alimentos de baixa acidez são os mais suscetíveis à contaminação microbiana, seja por patógenos ou deteriorantes. Nos alimentos ácidos, os fungos são predominantes, mas bactérias pertencentes ao grupo das ácido-láticas, comumente encontrada em queijo e manteigas, por exemplo, também podem crescer. Já os alimentos muito ácidos, limitarão o crescimento de bactéria, porém, as espécies de leveduras e fungos serão favorecidas, já que se adaptam muito bem a essas condições. É importante ressaltar que determinado alimento pode possuir inicialmente um pH que não favoreça o crescimento de bactérias, mas esse valor pode ser alterado por produtos do metabolismo de fungos e pode permitir o crescimento bacteriano. 2.1.3 Potencial oxidação-redução Os processos de oxidação e de redução de um alimento, também conhecido como potencial redox ou simplesmente pelo símbolo Eh, estão, basicamente, relacionados com a facilidade com que um substrato ganha ou perde elétrons. Para isso, precisamos recordar que um elemento que perde elétrons é conhecido como oxidado, e o que ganha elétrons, reduzido. Quando esses elétrons são transferidos de um elemento para outro, há a criação de uma diferença de potencial elétrico que pode ser medida por um equipamento apropriado denominado medidor de ORP, cuja sigla deriva do termo em inglês oxidation reduction potential, que demonstra o valor obtido em volts (V) ou milivolts (mV). Segundo Franco e Landgraf (2008), quanto mais positivo é o valor de um potencial elétrico de determinada substância, mais oxidada ela está (presença de O2). Em contrapartida, quanto mais negativo for o potencial elétrico de um composto, mais reduzido estará. As indústrias de alimentos se preocupam e monitoram constantemente os potenciais de oxirredução de seus produtos com o auxílio do medidor de ORP, pois uma série de compostos podem afetar o potencial redox dos alimentos, sendo que o oxigênio atmosférico presente no ambiente de armazenamento é o composto que interfere de forma mais significativa para o aumento desse parâmetro nos alimentos, os quais ficam sujeitos a contaminações microbianas. Os microrganismos apresentam variações no grau de sensibilidade ao potencial de oxirredução e podem ser divididos como exposto a seguir. • Microrganismos aeróbicos: aqueles que necessitam da presença de oxigênio para crescer, portanto, alimentos com potencial de oxirredução positivo. Assim sendo, quanto mais oxidado estiver o alimento, mais predisposto ele estará a contaminações por esse microrganismo. Nesse grupo, está inclusa a maioria das espécies de bolores e leveduras, além de bactérias deteriorantes, como os gêneros Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter e Flavobacterium. Algumas espécies de patógenos também se enquadram nesse grupo, como o Bacillus cereus. De modo geral, os microrganismos aeróbicos requerem um potencial de oxirredução entre +350 e +500 mV. • Microrganismos anaeróbicos: exigem a ausência completa ou parcial de oxigênio para se multiplicarem, portanto, se desenvolverão prioritariamente em alimentos com potencial de oxirredução negativo, normalmente inferiores a −150 mV. Estão inseridos nesse grupo algumas 22 Unidade I espécies de bactérias patogênicas, como o Clostridium botulinum e também agentes deteriorantes, como o Desulfotomaculum nigrificans, bactéria associada à deterioração de alimentos enlatados, que produz gás sulfídrico (H2S) e que penetra para dentro do alimento, causando seu escurecimento e cheiro de ovo podre. Observação A presença de O2 para o grupo dos anaeróbicos costuma ser mais nociva do que o potencial positivo de um alimento. Isso acontece porque, na presença de O2, produz-se como produto do metabolismo a água oxigenada (H2O2). Diferentemente dos microrganismos aeróbicos, os anaeróbicos não possuem a enzima catalase, a qual degradaria esse composto tóxico em água e CO2. Assim, ocorre o acúmulo de H2O2, levando esses microrganismos à morte. Microrganismos anaeróbicos facultativos: podem crescer tanto na presença como na ausência de O2 e, por esse motivo, conseguem se multiplicar em alimentos com potencial de oxirredução negativo ou positivo. A esse grupo pertencem, por exemplo, algumas espécies de leveduras fermentativas e algumas bactérias da família das enterobactérias. Microrganismos microaerofílicos: são aqueles que preferem condições bastante reduzidas de O2 para a multiplicação, portanto, alimentos com potencial de oxirredução baixo são os favoritos dessa classe de microrganismos. As bactérias láticas são exemplos desse grupo. A figura a seguir ilustra o crescimento dos microrganismos dependendo das suas preferências em relação às concentrações de O2 atmosférico. Microrganismos aeróbicos Microrganismos anaeróbicos facultativos Microrganismos anaeróbicos Microrganismos microaerofílicos Figura 8 – Efeito do O2 no crescimento dos microrganismos 23 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS A tabela a seguir demonstra o potencial de oxirredução de alguns alimentos. No entanto, é preciso dizer que a determinação do valor de potencial de oxirredução de um alimento não é uma tarefa fácil, já que pode ocorrer a interação da tensão de O2, que envolve o alimento com os seus componentes químicos,interferindo nos valores da medição. Tabela 5 – Potencial de oxirredução de alguns alimentos Alimento Potencial de oxirredução em mV Leite Variando entre +300 a +340 Queijo cheddar Variando entre +300 a −100 Manteiga Variando entre +290 a +350 Carne em pedaços in natura ~ −200 Carne moída ~ +300 Carnes enlatadas Variando entre −20 a −150 Batata ~ −150 Suco de uva +409 Suco de limão +383 Adaptada de: Baptista; Venâncio (2003, p. 45). É interessante notar que carnes em pedaços grandes possuem potencial de oxirredução em torno de −200 mV. No entanto, quando moídas, podem apresentar elevada concentração de O2, com valores de aproximadamente +300 mV, o que facilita a sua contaminação por microrganismos aeróbicos. Ainda sobre as carnes, os músculos dos animais, após abate, têm potencial de oxirredução de aproximadamente +250 mV. Entretanto, cerca de 30 horas após o abate, esse valor pode ser reduzido para −250 mV, propiciando a multiplicação da microbiota anaeróbia da carne. Possuir o conhecimento sobre os valores de potencial de oxirredução dos alimentos em suas diferentes formas de apresentação é de fundamental importância para as indústrias alimentícias para que tenham condições de prever os microrganismos mais suscetíveis e, então, serem capazes de propor embalagens mais adequadas que possam garantir a comercialização de um produto com características ideais de qualidade. 2.1.4 Composição nutricional A quantidade e os tipos de nutrientes presentes em um alimento são fatores muito importantes para a multiplicação de microrganismos, pois, para que possam crescer, é necessário que o alimento possua em sua composição: água; fonte de energia; fontes de nitrogênio; vitaminas e sais minerais. A influência da água para o crescimento dos microrganismos nos alimentos já foi demonstrada anteriormente quando abordamos a Aa. No caso das fontes de energia, os microrganismos utilizam, geralmente, açúcares (preferencialmente, açúcares simples, como a glicose), álcoois e aminoácidos. Há, ainda, um seleto grupo de microrganismos que utiliza fontes de energia não tão usuais, como aqueles que consomem lipídeos. Em relação às fontes de nitrogênio, as principais são os aminoácidos, que são provenientes de proteínas. Sobre as fontes de vitaminas, aquelas pertencentes ao complexo B, a biotina 24 Unidade I e o ácido pantotênico são as mais frequentemente utilizadas pelos microrganismos, pois funcionam como coenzimas envolvidas em diversas reações metabólicas. Por fim, os sais minerais, que, embora sejam requeridos em quantidades muito pequenas, são fundamentais para que ocorra a multiplicação microbiana, como o zinco, o manganês e o sódio, que participam em várias reações enzimáticas. Em resumo, quanto mais rico em nutrientes for um determinado alimento, mais predisposto ele estará para ocorrências de contaminação microbiana. 2.1.5 Presença de substâncias naturalmente antimicrobianas Você já percebeu que alguns alimentos têm uma estabilidade maior do que de outros? Claro que isso pode estar atrelado a vários fatores, como a quantidade livre de água, como já vimos anteriormente. Ou seja, quanto maior a Aa, maior a probabilidade de contaminações. No entanto, alguns alimentos possuem espécies de conservantes naturais, que retardam ou impedem o ataque de microrganismos, aumentando a estabilidade do alimento em questão. Esse é o caso de condimentos e temperos, pois muitos possuem óleos essenciais que exercem efeito antimicrobiano contra diversos microrganismos. O óleo essencial extraído da canela, por exemplo, possui o cinamaldeído, com efeito antimicrobiano importante contra diferentes espécies do gênero Salmonella, um dos principais patógenos alimentares. Esse mesmo efeito contra Salmonella também é observado pelos óleos essenciais extraídos do orégano e do tomilho, os quais possuem, respectivamente, as substâncias carvacrol e timol. Outro bom exemplo é o alho, que detém em sua composição a alicina. Essa substância apresenta ação antiviral, antifúngica e antibiótica, além de possuir considerável teor de selênio, o que nos permite dizer que o alho também possui propriedades antioxidantes. Outra substância antimicrobiana que tem recebido crescente destaque é bacteriocina. Trata-se de um peptídeo com ação bactericida ou bacteriostática, que é produzido, principalmente, por bactérias láticas, ou seja, bactérias naturalmente presentes em laticínios fermentados. Essa substância tem sido amplamente estudada nas últimas décadas e apresenta-se como uma potencial alternativa na conservação de alimentos em substituição ao conservantes químicos, além de ser especialmente vantajosa por não promover alterações nas qualidades sensoriais do produto alimentício. De fato, essa substância já está comercialmente disponível e se chama nisina. Descoberta em 1925, ela só foi autorizada para uso em alimentos em 1969, pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura. No entanto, no Brasil, o Ministério da Saúde autorizou sua aplicação em alimentos apenas em 1996, sendo atualmente largamente utilizada como bioconservantes de produtos lácteos e cárneos embutidos, como salsichas. Além dessas substâncias com efeito antimicrobiano, outras estruturas funcionam como barreiras físicas contra a penetração de microrganismos e também precisam ser consideradas. Esse é o caso da casca de nozes, casca de frutas e da casca dos ovos, bem como a pele dos animais e a película que envolve as sementes. 25 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 2.1.6 Presença de microbiota natural Ao utilizar os componentes do alimento para se multiplicar, um determinado microrganismo tende a produzir substâncias que podem inibir o crescimento de outros microrganismos, como uma estratégia para se sobressair em uma competição por espaço e nutrientes. Isso é o que ocorre com os alimentos fermentados por bactérias lácticas. Esse grupo de microrganismo, ao se multiplicar em um produto lácteo, produz ácido lático como metabólito, o que resulta na diminuição do pH desse alimento, tornando-o ácido demais para a sobrevivência da maioria dos microrganismos. Por outro lado, os fungos são bastante adaptados para essas condições e podem utilizar dessa oportunidade para se multiplicarem. Se essa situação ocorrer, esses fungos podem produzir uma enzima denominada descarboxilase, que interage com os componentes do alimento, resultando na formação de compostos alcalinos, como as aminas. Como consequência, ocorre o aumento do pH do alimento, que anteriormente estava muito ácido. Nessa ocasião, os microrganismos que antes não conseguiam crescer, agora estarão aptos a se proliferar. Um exemplo prático desse acontecimento são as leveduras que degradam o ácido lático dos produtos fermentados, tornando-os favoráveis para o crescimento e a produção de toxinas por Clostridium botulinum, um importante patógeno alimentar que será discutido em detalhes mais à frente neste livro. A interação entre os microrganismos também pode ser uma eficiente forma para o controle do desenvolvimento de patógenos em alimentos. Bactérias benéficas, também tradicionalmente denominadas como probióticos, podem ser intencionalmente adicionadas a um produto alimentício, estimulando uma competição com a microbiota inicialmente presente. Quando isso ocorre, as bactérias patogênicas podem acabar sendo desfavorecidas, sendo eliminadas ou tendo suas populações reduzidas. Esse processo é chamado de exclusão competitiva e vem sendo bastante utilizado no controle da contaminação de granjas, principalmente pelos patógenos Salmonella e Campylobacter. Nessa interessante estratégia, as aves, desde a fase neonatal até a fase adulta, recebem alimentação rica em probióticos. Essa ação promove a colonização da superfície do epitélio do trato gastrointestinal dessas aves, o que impede que microrganismos indesejáveis se instalem e causem as patologias associadas. Além disso, muitas espécies de bactérias probióticas possuem a vantagem adicionalde produzir ácidos orgânicos e bacteriocina, o que lhes garante predomínio durante a competição contra patógenos (ver figura). Bactérica patogênica Bactérica probiótica Ácidos orgânicos Bacteriocina Célula epitelial do intestino Figura 9 – Representação esquemática da exclusão competitiva entre bactérias probióticas e patogênicas nas células epiteliais do intestino 26 Unidade I Saiba mais Para saber mais sobre os efeitos benéficos das bactérias probióticas em humanos e animais, leia: OLIVEIRA, M. N. et al. Aspectos tecnológicos de alimentos funcionais contendo probióticos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 38, n. 1, p. 1-21, 2002. 2.1.7 Aula prática Vimos o quanto os fatores intrínsecos dos alimentos podem influenciar no crescimento dos microrganismos, favorecendo-os ou inibindo-os. Nas práticas a seguir, analisaremos dois fatores intrínsecos muito determinantes para a caracterização de um alimento: a atividade de água e a presença de substâncias naturalmente antimicrobianas. Exemplo de aplicação Análise da atividade de água (Aa) A determinação de atividade de água nos alimentos pode ser feita utilizando-se equipamento específico (analisador/medidor de atividade de água) ou utilizando dessecadores com solução saturada de sais. Esse último método possui baixo custo e é facilmente executado, sendo especialmente vantajoso em relação ao método por meio de equipamentos. Nos dessecadores, fechados hermeticamente com auxílio de bomba a vácuo, as soluções saturadas de sais geram uma atmosfera de umidade relativa, ou atividade de água, já muito bem estabelecida e conhecida. Assim, uma amostra de alimento colocada dentro desse ambiente trocará de umidade com esse ambiente de umidade relativa conhecida, de modo que entrem em um equilíbrio após determinado período. A tendência em perder ou absorver a água do ambiente com a atmosfera conhecida poderá ser observada na variação do peso dos alimentos analisados. Objetivo: observação do efeito da atividade de água nos alimentos. Procedimento: preparar, ao menos, três dessecadores adicionando, a cada um deles, uma das soluções saturada de sal da tabela a seguir. É importante reforçar que sejam selecionados sais com valores bem distintos de Aa. Por exemplo, no primeiro dessecador adicionar ácido sulfúrico (Aa = 0,00); no segundo adicionar carbonato de potássio (Aa = 0,43); no terceiro adicionar sulfato de sódio (Aa = 0,93). 27 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Tabela 6 Sal UR % (a 25 °C) Aa Ácido sulfúrico 0,00 0,00 Hidróxido de potássio – KOH 8,23 0,08 Acetato de potássio – KC2H3O2 22,51 0,23 Cloreto de magnésio – MgCl2 32,8 0,33 Iodeto de sódio – NaI 38,2 0,38 Carbonato de potássio – K2CO3 43,16 0,43 Nitrato de magnésio – Mg(NO3)2.6H2O 52,89 0,53 Brometo de sódio – NaBr 57,6 0,58 Iodeto de potássio 68,9 0,68 Cloreto de sódio – NaCl 75,7 0,76 Sulfato de amônio – (NH4)SO4 80,9 0,81 Cloreto de potássio – KCl 84,34 0,84 Sulfato de sódio – Na2SO4 . 10 H2O 93,0 0,93 Pesar três béqueres de 50 mL, anotando as respectivas massas. Adicionar a cada um desses béqueres 5 g de um determinado alimento. Sugerimos amostras de bolacha água e sal, café em pó e molho de tomate. Colocar em cada um dos dessecadores, já contendo uma das soluções saturadas de sal, um dos conjuntos de béquer + amostra. Após sete dias, verificar a aparências dos alimentos. Após o período de sete dias, se seguirmos o exemplo quanto à seleção dos sais e às amostras de alimento no dessecador contendo ácido sulfúrico, a amostra de bolacha, de água e de sal tenderá a permanecer crocante, já que a troca de água com o ambiente será mínima. Espera-se que não haja contaminações nessa amostra. O café em pó, nesse ambiente, tenderá a manter sua característica original e também não deverá apresentar contaminações. Já o molho de tomate ficará seco, pois ele possui uma Aa elevada, e em um ambiente com Aa nula, a tendência é que ele libere água para essa atmosfera buscando a umidade relativa de equilíbrio. Em uma situação extrema, se tomarmos como base um dessecador contendo uma solução de sulfato de sódio, a amostra de bolacha ficará murcha, pois com uma umidade relativa tão elevada desse ambiente, a tendência é que absorva a água dessa atmosfera. O café, seguindo o mesmo raciocínio, se tornará uma massa pastosa. Já o molho de tomate sofrerá pouco ou nenhum efeito, pois tanto a atmosfera quanto a amostra desse alimento possuem elevados valores de Aa. Diferentemente do exemplo anterior, sob essa atmosfera, espera-se que após sete dias todas as amostras de alimentos estejam contaminadas. 28 Unidade I 2.1.7.1 Análise da presença de substâncias antimicrobianas naturais Alguns alimentos possuem em sua composição algumas substâncias com potencial de inibir o crescimento de alguns microrganismos. Isso é uma propriedade bastante interessante, pois atribui a esses alimentos um período maior de tempo de prateleira. Exemplo de aplicação Objetivo: checar se determinados alimentos possuem atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. Procedimento: em uma placa de Petri contendo o meio de cultura sólido TSB ou BHI, semear, com o auxílio de um swab, uma solução contendo Staphylococcus aureus previamente crescido em meio de cultura líquido TSB ou BHI. Faça movimentos em zigue-zague de forma que toda a superfície da placa seja coberta com a solução da bactéria em questão. Enquanto aguarda a solução na placa secar por alguns minutos, triture, se for necessário, em gral e pistilo, os alimentos que serão testados. Sugerimos alho, canela, cravo e tomilho ou orégano (frescos). Com o auxílio de uma espátula, de preferência estéril, coloque uma pequena porção das amostras de alimento sob a superfície do meio de cultura sólido cultivado com Staphylococcus aureus. Coloque para incubar em estufa bacteriológica a 35 °C por 24-48 horas. Após esse período, é esperado que haja a formação de halos de inibição ao redor das amostras de alimentos, pois eles possuem em sua composição, substâncias que exercem atividade antimicrobiana contra determinados microrganismos. Esses halos de inibição supostamente formados, representam o não crescimento do Staphylococcus aureus, pois a substância antimicrobiana se difundiu, matando os microrganismos que estavam ao redor das amostras de alimento. 2.2 Fatores extrínsecos Quando falamos de fatores extrínsecos que interferem no crescimento de microrganismos em alimentos, estamos nos referindo às condições ambientais às quais esse alimento foi exposto, seja durante seu armazenamento ou durante a sua produção. Entre os fatores extrínsecos mais relevantes estão a umidade e a temperatura do ambiente, além da composição química da atmosfera que envolve o alimento. Esses fatores serão discutidos em detalhes a seguir. 29 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 2.2.1 Umidade relativa do ambiente Esse parâmetro está estritamente relacionado com a Aa de um alimento e a umidade relativa do ambiente. É importante dizer que a Aa dos alimentos também pode ser dita como umidade relativa (UR). Para isso, deve-se multiplicar a Aa por 100, visto que a UR é dada em porcentagem. Por exemplo, se a Aa de um alimento for 0,3, então sua UR será 30%. Já a umidade relativa do ambiente indica a porcentagem de umidade no ar a uma dada temperatura. Em um deserto, por exemplo, a UR do ar pode chegar a 15%, no entanto, a UR da maioria das atmosferas costuma ser, em média, 60%. Quanto ao armazenamento dos alimentos, considera-se que é um parâmetro muito importante, pois pode alterar a Aa de um alimento e, consequentemente, sua predisposição a contaminações microbianas. Se armazenarmos um alimento de baixa Aa, ou seja, baixa UR, em um ambiente com alta UR, a Aa do alimento aumentará, pois o alimento tenderá a absorver a água daquele ambiente. O contrário também ocorre, ou seja, o armazenamento de um alimento de alta Aa (alta UR) em um ambiente seco (baixa UR), fará com que esse alimento dessorva água, ou seja,libere água para a atmosfera na tentativa de atingir o equilíbrio (umidade relativa de equilíbrio – URE) e, portanto, tenderá ao ressecamento. Para exemplificar as situações mencionadas, imagine uma bolacha de água e sal. A Aa desse produto varia em torno de 0,40, ou seja, UR de 40%. Se essa bolacha for deixada por um determinado período de tempo em um ambiente com UR atmosférica de 60%, em temperatura ambiente, a tendência é que esse produto fique murcho. Isso ocorre porque a bolacha irá absorver a água presente no ar desse ambiente e, portanto, apresentará essa característica final, a qual desagrada o consumidor e predispõe esse alimento a contaminações microbianas. Na situação oposta, se um molho de tomate, o qual possui uma Aa média de 0,80, for exposto ao mesmo ambiente, sob a mesma temperatura, a tendência é que ele libere sua água livre para o ambiente, também na tentativa de atingir a URE. Nesse caso, o molho de tomate terá sua Aa reduzida e ficará ressecado. Uma Aa baixa limita o crescimento de bactérias, no entanto, favorece a multiplicação de fungos deteriorantes, os quais conseguem se proliferar em Aa baixas. Observação Temperatura do ambiente: entre os fatores extrínsecos, a temperatura ambiente (faixa entre 15 °C e 30 °C), talvez seja o fator mais determinante para a multiplicação dos microrganismos em alimentos. Apesar de conseguirem se multiplicar em diferentes temperaturas, os microrganismos possuem preferências para atingir seus máximos de proliferação. Com foco nos contaminantes de alimentos e seus ótimos de temperatura, os microrganismos podem ser divididos em três principais grupos: os psicrotróficos; os mesófilos e os termófilos. 30 Unidade I Ve lo ci da de d e cr es ci m en to Ótimo de temperatura para os psicrotróficos Ótimo de temperatura para os mesófilos Temperatura °C 0 10 20 30 40 50 60 70 Ótimo de temperatura para os termófilos Figura 10 – Crescimentos dos microrganismos psicrotróficos, mesófilos e termófilos em diferentes temperaturas Detalhando cada um desses grupos, os psicrotróficos têm ótimos de crescimento geralmente entre 20 °C a 25 °C, não crescem além dos 30 °C e o grande diferencial é que conseguem crescer sob baixas temperaturas, que são as mesmas utilizadas em geladeiras. Dessa forma, os microrganismos desse grupo serão os principais responsáveis pela contaminação de alimentos refrigerados, especialmente carnes, pescados, ovos e frango. Os psicrotróficos conseguem deteriorar lentamente os alimentos, os quais, muitas vezes, se apresentam sob a forma de micélios fúngicos ou limo na superfície, ocasionando a sua alteração de sabor, odor e/ou cor. Os microrganismos mesófilos, com temperaturas ótimas de crescimento entre 25 °C a 40 °C, são os microrganismos mais comuns. A grande preocupação das indústrias e estabelecimentos envolvidos nos processos de produção e manipulação de alimentos são esses microrganismos, pois correspondem à grande maioria dos patógenos alimentares. Tais microrganismos têm ótimos de crescimento sob temperaturas em torno de 37 °C, correspondente à temperatura corpórea de humanos e animais mamíferos, o que justifica sua capacidade de boa adaptação nesses hospedeiros. Já os termófilos são microrganismos capazes de crescer sob altas temperaturas. A grande maioria dos microrganismos pertencentes a esse grupo têm ótimos de crescimento sob temperaturas em torno de 50 °C a 60 °C, podendo, inclusive, resistir até a 90 °C. Para que se possa ter uma ideia, a temperatura ideal de multiplicação desses microrganismos representa a média da temperatura da água que sai de torneiras aquecidas. As bactérias termófilas de maior importância aos alimentos pertencem ao gênero Bacillus, incluindo tanto espécies deteriorantes, como Bacillus coagulans, como também patogênicas, como o Clostridium botulinum e o Clostridium perfringens. Sabe-se que esses microrganismos são formadores de endósporos, também conhecidos como esporos bacterianos, que representam estruturas de 31 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS resistência. A grande preocupação é que, se o tratamento térmico aplicado ao processo de produção de enlatados e compotas não for realizado corretamente e eles ficarem submetidos a altas temperaturas de armazenamento, esses esporos podem germinar, resultando no crescimento do microrganismo que causa a sua deterioração, ou ainda serem veículo de DTAs, como é o caso do botulismo alimentar causado por Clostridium botulinum. 2.2.2 Composição química do ambiente A composição química do ambiente diz respeito aos gases que estão ao redor do alimento, dentro de suas embalagens, ou seja, oxigênio (O2), dióxido de carbono (CO2), nitrogênio, etileno, entre outros. A composição gasosa que envolve um produto alimentício determina os tipos de microrganismos que poderão crescer nele. A presença de oxigênio, por exemplo, favorece a proliferação de microrganismos aeróbicos, representados pela grande maioria dos agentes deteriorantes de alimentos e patógenos causadores de DTA. Já na ausência de O2, predominarão, prioritariamente, os microrganismos anaeróbicos, um grupo mais restrito e com metabolismo lento. Portanto, a modificação na composição química dos gases que envolvem os alimentos dentro das embalagens dita os microrganismos que sobrevivem e os que se multiplicam. O O2 é responsável por muitas reações indesejadas nos alimentos, como a oxidação e rancificação de óleos e gorduras, amadurecimento acelerado de frutas e verduras, alterações na coloração e aspecto dos alimentos, além da deterioração ocasionada pelo crescimento de microrganismos aeróbicos. Devido a esses efeitos, as indústrias alimentícias tendem a utilizar embalagens específicas com um sistema denominado de “atmosfera modificada”. A embalagem a vácuo foi a primeira forma de embalagem com atmosfera modificada comercialmente disponível. Nessa condição, utilizam-se as embalagens impermeáveis a gases, que têm o ar retirado para impedir o crescimento de organismos deteriorantes e patogênicos. O O2 residual dentro das embalagens a vácuo é consumido pela microbiota naturalmente presente, produzindo CO2 e fazendo com que o potencial de oxirredução, assunto anteriormente discutido nesta unidade, tenda a ficar negativo, resultando na supressão do crescimento microbiano e impedindo, portanto, as modificações indesejadas nos alimentos. É importante ressaltar que tal condição atmosférica não resulta na “esterilização” do alimento, pois, em condições onde há a escassez de O2, ocorre o predomínio de microrganismos anaeróbicos, de velocidade metabólica lenta, que atrasam a deterioração do alimento embalado sob essas condições. Por outro lado, é preciso observar que alguns patógenos alimentares, como o Clostridium botulinum, são anaeróbicos e poderiam ter o crescimento favorecido pela exclusão absoluta de O2. Por esse motivo, a presença de algumas moléculas desse gás dentro das embalagens é imprescindível para que ocorra o crescimento da microbiota residente, que funcionará como competidora desses importantes agentes patogênicos. Além das embalagens a vácuo, também temos aquelas que atuam com atmosfera modificada, que visam a estender o tempo de vida útil dos alimentos e que também podem ser obtidas mediante a substituição, total ou parcial, do O2 por outros gases. Embalagens contendo misturas entre oxigênio, nitrogênio e CO2 são as mais utilizadas pelas indústrias de alimentos, embora misturas com outros gases como monóxido de carbono, óxido nitroso e dióxido de enxofre também sejam utilizadas. As figuras a seguir ilustram as embalagens no modelo a vácuo e também aquelas que são obtidas por substituição de gases. 32 Unidade I A) Embalagens a vácuo B) Embalagens por atmosfera modificada Figura 11 – Representação de embalagens de alimentos por sistema a vácuo e por atmosfera modificada O aumento do prazo de validade dos produtos embalados sob atmosfera modificada é possível, pois, além de limitar a quantidade deO2 e seus efeitos indesejados, o CO2 naturalmente resultante ou artificialmente inserido dentro das embalagens desempenha efeito bacteriostático contra diferentes espécies microbianas. É importante dizer que esse efeito pode ser influenciado pela carga bacteriana inicial e pelo tipo de produto embalado, sobretudo seu aspecto relacionado à quantidade de água livre, ou seja, Aa. O mecanismo inibitório desse gás dependerá, principalmente, de sua dissolução no produto embalado e na quantidade ali encerrada. Quando o CO2 se dissolve na água livre do alimento, acaba acidificando-o. Essa acidificação, aliada ao efeito antimicrobiano do CO2, impede o crescimento de diversos microrganismos, como já demonstrado anteriormente. Considera-se importante também que as temperaturas reduzidas ajam sinergicamente com o CO2, contribuindo com a ação bacteriostática. É por esse motivo que alimentos embalados a vácuo ou sob atmosfera modificada são armazenados, frequentemente, sob refrigeração. Mais recentemente, as indústrias alimentícias estão se interessando em buscar novas tecnologias disponíveis e adaptá-las aos seus produtos como as “embalagens inteligentes” e as “embalagens ativas”. Além das funções propostas pela embalagem com atmosfera modificada, que são a de fornecer uma barreira física para conter as contaminações microbiológicas e a de prevenir os processos de deterioração, como a oxidação. As embalagens ativas possuem alguns sistemas que, de certa forma, se comunicam com o alimento e liberam substâncias antimicrobianas durante sua validade. Outra funcionalidade dessas embalagens é a de modificar alguns inconvenientes naturais do alimento, por meio de enzimas específicas que são adicionadas ao material da embalagem e que interagem diretamente com o produto, deixando-o com um sabor mais aceitável e eliminando, por exemplo, sabores amargos. Já as embalagens inteligentes funcionam como indicadoras de qualidade do produto embalado. Essa é uma vantagem bastante interessante, pois, quando um alimento está em processo de deterioração, reações bioquímicas estão acontecendo e, muitas vezes, são imperceptíveis aos olhos do consumidor, já que o alimento pode manter sua aparência de produto fresco. 33 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Imagine a seguinte situação: você está em um supermercado e, olhando através da embalagem, consegue visualizar e saber, com precisão, se as frutas que se encontram embaladas nela estão muito maduras ou se encontram muito próximas de se estragarem; ou ainda, em outra situação, consegue saber se uma carne foi recentemente embalada ou se está prestes a se tornar imprópria para o consumo. São situações que parecem futuristas, mas que, na verdade, já são realidade nas indústrias alimentícias que estão implantando e investindo cada vez mais em novas tecnologias para minimizar os desperdícios e, consequentemente, seus custos financeiros. Por meio de seus rótulos ou etiquetas, as embalagens inteligentes funcionam detectando a mudança de pH do alimento embalado, resultante da deterioração microbiana, ou seja, quando os microrganismos que estão presentes nessa embalagem crescem e se desenvolvem no alimento, eles tendem a liberar, como produto de seus metabolismos, ácidos orgânicos, como ácidos lático, butírico e acético, que irão acidificar o produto embalado. Assim, essa etiqueta ou o rótulo interagem com o conteúdo interno e muda de cor indicando o grau de deterioração do produto. No caso de embalagens inteligentes para frutas, existem sensores presentes na etiqueta que detectam o gás etileno, que é liberado naturalmente durante o processo de maturação desses alimentos. De acordo com a quantidade desse gás dentro da embalagem, é possível saber o estágio de maturação da fruta embalada e, dessa forma, o consumidor sabe exatamente quando o alimento ainda está firme, maduro ou completamente maduro. A embalagem inteligente da empresa neozelandesa Ripesense® é um exemplo (ver figura a seguir). Figura 12 – Embalagem inteligente desenvolvida pela empresa Ripesense®, que indica o grau de maturação de frutas embaladas mediante um sensor de produção de gás etileno O círculo de coloração vermelha presente na embalagem indica que a fruta está fresca, a cor laranja quer dizer que a fruta está madura, enquanto o círculo de cor amarela indica que a fruta está passada e serve, preferencialmente, para a preparação de sucos. 34 Unidade I Outro exemplo interessante dessa tecnologia é dado pela empresa inglesa Timestrip®, que desenvolveu um rótulo que indica o período em que um determinado produto está aberto. Ao acionar o botão de ativação, o tempo começa a ser monitorado pela etiqueta que mudará da coloração branca do indicador para a cor vermelha (ver figura a seguir). Antes da ativação Ativação manual Ativado e próximo do fim do período de monitoramento Figura 13 – Etiqueta de monitoração do tempo, especialmente útil para embalagens de alimentos Essa empresa também possui etiquetas que monitoram a temperatura de armazenamento ou transporte de alimentos. Se houver violação do limite de temperatura estabelecido, ela será apontada pela etiqueta (ver figura seguir). O mecanismo de funcionamento é relativamente simples: a etiqueta contém um líquido azul que se move por capilaridade por uma membrana porosa branca, a menos que a temperatura seja violada. O progresso do líquido azul pode ser rastreado em relação aos marcadores de tempo na janela de visualização. Se a temperatura é violada, o líquido se solidifica e para de se mover. Cada avanço é irreversível e, portanto, o tempo acumulado de todas as violações de temperatura é mostrado pela distância que a mistura azul se move ao longo dos marcadores de tempo. Inativado Monitoramento após ativado Indicação de violação de temperatura durante 4 horas Figura 14 – Etiqueta de monitorização de temperatura, especialmente útil para checar a violação da temperatura limite de produtos refrigerados e congelados Ambas as etiquetas são bastante propícias para produtos refrigerados e congelados. 35 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Aqui no Brasil, tais tecnologias ainda não são muito comuns de serem encontradas, mas, considerando o avanço crescente que esse mercado vem globalmente apresentando, a expectativa é que as indústrias alimentícias brasileiras considerem essa possibilidade dentro dos próximos anos, já que as vantagens beneficiam tanto os consumidores quanto as empresas envolvidas na cadeia de produção, contribuindo para a sustentabilidade e economia dos negócio. Lembrete Os fatores intrínsecos e extrínsecos ditam o ritmo em quem os microrganismos irão se proliferar nos alimentos. Esses fatores são inerentes ao alimento, como por exemplo, pH, acidez, e atividade de água. Já os fatores extrínsecos estão relacionados com ambiente em que os alimentos são expostos, como umidade relativa do ar e temperatura. 2.3 Teoria dos obstáculos de Leistner Conhecer os fatores intrínsecos e extrínsecos dos alimentos e os efeitos que eles exercem sobre o crescimento de microrganismos permite prever seu tempo de validade, ou também, tradicionalmente chamado de “vida de prateleira”, com especial atenção aos patógenos alimentares. Apesar de os fatores anteriormente mencionados afetarem de forma específica os alimentos, é pouco útil o conhecimento das respectivas características isoladamente, pois existe uma interação entre os fatores, sejam eles intrínsecos ou extrínsecos. Essa inter-relação entre os fatores pode ser do tipo aditivo, sinérgico ou, até mesmo, antagônico e é isso que deu origem ao conceito da teoria dos obstáculos de Leistner. Leistner foi um pesquisador que descreveu em seus trabalhos que a estabilidade e a segurança microbiológica dos alimentos são obtidas pela ação combinada dos fatores intrínsecos e extrínsecos, resultando na diminuição de contaminações microbianas, intoxicações alimentares, economia de energia e dinheiro pelas indústrias alimentícias, bem como a redução do impactoambiental gerado pelo desperdício de alimentos. Essa teoria se baseia na utilização conjunta de mais de um tipo de mecanismo de controle microbiano, dificultando a proliferação desses agentes. Para entender essa teoria, é preciso ter em mente que os alimentos podem conter uma carga inicial de microrganismos, os quais podem se multiplicar até o momento do seu consumo, podendo reduzir o tempo de prateleira do alimento, ou até mesmo causar danos ao consumidor. Esses microrganismos poderão ou não ser barrados por uma ou mais barreiras de conservação. O conceito da teoria dos obstáculos de Leistner é apresentado na figura a seguir, que ilustra sete exemplos da intensidade de atuação dos fatores intrínsecos e extrínsecos sobre o controle do crescimento microbiano em um determinado alimento, melhorando a estabilidade e, consequentemente, sua qualidade. 36 Unidade I Temperatura Atividade da água Atividade da água Atividade da água Atividade da água Atividade da água Atividade da água Efeito sinérgico entre as barreiras Meio rico em nutrientes Microrganismos injuriados Atividade da água pH pH pH pH pH pH Potencial de oxirredução Potencial de oxirredução Conservante Conservante Conservante Conservante Conservante Conservante Conservante pH Potencial de oxirredução Potencial de oxirredução Potencial de oxirredução Potencial de oxirredução Potencial de oxirredução Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 Exemplo 4 Exemplo 6 Exemplo 5 Exemplo 7 Figura 15 – Teoria dos obstáculos de Leistner 37 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS No primeiro exemplo, os fatores Conservante de processamento da matéria-prima, sua Aa, seu pH, o potencial de oxirredução e o conservante químico adicionado ao produto final contribuem igualmente para impedir o crescimento microbiano, representado pela seta, até que seja completamente inibido. Essa é a situação mais desejada, mas trata-se de um modelo teórico, de ocorrência pouco provável. No caso do exemplo 2, a Aa do alimento exerceu importante barreira, entretanto, não foi suficiente para impedir o crescimento microbiano, necessitando de mais três barreiras até que fosse completamente inibido pelo conservante químico, que precisou ser adicionado em elevada concentração. No entanto, pode-se observar que, se a carga microbiana fosse baixa, apenas a Aa seria necessária para se obter a segurança microbiológica do alimento em questão, que é o que se pode observar no exemplo 3. Por outro lado, vemos no exemplo 4 que, se a concentração inicial de microrganismos fosse bastante elevada, provavelmente, devido às más condições de higiene durante o processamento do alimento, as quatro barreiras presentes seriam insuficientes para impedir o desenvolvimento microbiológico, necessitando, portanto, da adição de outro fator para bloquear eficientemente o crescimento da população microbiana. Apenas com essas quatro barreiras, o produto teria tempo de prateleira curto ou poderia causar uma intoxicação alimentar. No exemplo 5, temos a situação em que foram acrescidos mais nutrientes ao alimento, resultando em um efeito do tipo trampolim no crescimento microbiano. Nessa situação, a intensidade das quatro barreiras precisa ser aumentada. Por exemplo, se estamos falando de um produto cárneo, então o efeito antimicrobiano que a Aa pode exercer precisa, com certeza, ser intensificado, diminuindo consideravelmente a quantidade de água livre ali presente. Além disso, seria preciso intensificar o efeito do pH, acidificando ou basificando o meio, embalar o produto em uma atmosfera modificada ou a vácuo e adicionar uma concentração mais elevada de conservantes. Também existem situações em que o microrganismo se encontra injuriado, fraco, pouco adaptado às condições ambientais atuais. Nesse caso, ilustrado no exemplo 6, menos barreiras são necessárias para conter o crescimento do microrganismo em questão, já que seu metabolismo está consideravelmente prejudicado. O último exemplo ilustra uma situação que merece uma atenção especial referente à preservação dos alimentos por combinação de fatores, pois a ação dos diferentes fatores pode ter não apenas um efeito aditivo na estabilidade, mas também pode atuar sinergicamente. O efeito sinérgico entre os fatores pode ser esperado quando cada um deles têm alvos diferentes dentro das células microbianas. Por exemplo: um fator afeta a parede celular e o outro dificulta a assimilação de nutrientes. Isso perturbará o crescimento dos microrganismos em vários aspectos, dificultando que agentes deteriorantes e patogênicos superem tal situação, tendo o crescimento retardado e, por consequência, morrendo. Assim sendo, empregar diferentes obstáculos na preservação dos alimentos deve ser vantajoso, já que não é necessário intensificar os obstáculos para alcançar a estabilidade microbiana. E por que devemos conhecer os fatores intrínsecos e extrínsecos de cada alimento e saber como eles interagem? Porque assim será possível estabelecer seu tempo de vida útil e as melhores condições de armazenamento. Isso é realizado frequentemente por meio de ensaios laboratoriais, que podem 38 Unidade I demandar um longo período e altos custos associados, ou, alternativamente, utilizando o que chamamos de modelos matemáticos. Esses modelos são fundamentados em equações matemáticas que calculam a probabilidade de crescimento de determinado microrganismo em um produto alimentício baseado em seus fatores intrínsecos e extrínsecos. Trata-se de um método inovador bastante vantajoso, pois, além de apresentarem resultados que se correlacionam muito bem com aqueles realizados com ensaios laboratoriais, permite realizar estimativas de tempo de prateleira dos alimentos de forma rápida e econômica. 2.4 Deteriorações dos alimentos por microrganismos Quando a microbiota inicial de um alimento sobrevive às barreiras impostas por ele ou pelo seu armazenamento, ou então, quando um patógeno acidentalmente se instala devido às condições inadequadas de higiene, esses microrganismos alterarão as características físicas e químicas desse produto alimentício, que é o processo conhecido como deterioração. 2.4.1 Alterações físicas dos alimentos causadas por contaminação microbiana As alterações físicas mais importantes, causadas pela presença de microrganismos, são as modificações de viscosidade, turbidez, coloração, sabor e odor dos alimentos. Sobre a alteração da viscosidade, alguns microrganismos sintetizam polissacarídeos. Como exemplo, podemos citar os microrganismos Bacillus subtilis e Escherichia coli, que utilizam os açúcares sacarose e maltose para a produção de dextrana e amilose (ver figuras a seguir). Essas substâncias formam uma espécie de limo na superfície dos alimentos sólidos ou aumentam a viscosidade dos alimentos líquidos ou semissólidos. Sabe aquela carne fresca que você comprou no supermercado, esqueceu guardada na geladeira por dias e quando se lembrou de consumi-la, observou uma limosidade sobre sua superfície? Trata-se de microrganismos que produzem esses polissacarídeos e, consequentemente, modificam a característica original do alimento. OO OO OO OO nn nn OO OO OO OO OO OO OO 44 44 44 44 11 11 666666 11 11 11 11 11 11 αα αα αα αα αα αα CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2 CH2 CH2 OOOO OODextrana HOH Amilose HOH Figura 16 – Estrutura linear dos polissacarídeos dextrana e amilose 39 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Sobre as mudanças do aspecto turbidez, um exemplo bastante interessante são as bactérias láticas, mais especificamente as dos gêneros Lactobacillus e Pediococcus. Bactérias pertencentes a esses gêneros são consideradas as mais prejudiciais para as indústrias cervejeiras e são responsáveis pela maioria dos incidentes de deterioração bacteriana nesse tipo de bebida. A cerveja é um meio bastante hostil para a maioria das bactérias, com elevada acidez (pH entre 3,8 a 4,7), considerável concentração de etanol (geralmente entre 4% a 5%), alta concentração de dióxidode carbono e baixa concentração de O2, que a torna um meio quase anaeróbico. No entanto, alguns microrganismos, como os citados anteriormente, são capazes de se adaptarem a essas condições e de estragar as cervejas. Além de deixá-las com uma turbidez bastante intensa, podem alterar o sabor dessa bebida devido à produção de metabólitos, como o ácido lático, que a deixará mais ácida, e o diacetil, que irá conferir às cervejas contaminadas um sabor desagradável de manteiga. As alterações da coloração ocorrem devido à contaminação dos alimentos por gêneros bacterianos produtores de pigmentos e, quando hidrossolúveis, se dispersam pela água livre do alimento, podendo ter mudanças na coloração original do alimento não apenas no local de início da contaminação, mas também em outros pontos (ver figura a seguir). No entanto, se o pigmento produzido for do tipo lipossolúvel, então, só serão observadas as alterações da coloração nos pontos onde houver contaminação. Figura 17 – Mudança de coloração de carne crua ocasionada por contaminação microbiana No quadro a seguir, apresentamos alguns gêneros bacterianos produtores de pigmentos, bem como as respectivas características desses pigmentos. Quadro 1 – Alguns exemplos de microrganismos produtores de pigmentos Gênero bacteriano Características do pigmento Serratia Pigmento lipossolúvel que varia entre a coloração rósea e vermelha (ver figura a seguir) Flavobacterium Pigmento lipossolúvel que varia entre as colorações amarela, laranja e vermelha Chromobacterium Produz violaceína, pigmento violeta lipossolúvel Halococcus e Halobacterium Gêneros capazes de crescer em alimentos com alta concentração de sal, importantes na deterioração de carnes e pescados desidratados e salgados. Produzem bactorubeína, pigmento com cor que varia entre rosa e vermelho Pseudomonas Pigmentos hidrossolúveis que variam entre a coloração amarelo-esverdeada (ver a figura do filé de peixe) até a verde-fluorescente Adaptado de: Franco; Landgraf (2008). 40 Unidade I Figura 18 – Pedaço de bolacha tipo água e sal contaminada pela espécie bacteriana Serratia marcescens Peixe fresco antes da contaminação por Pseudomonas aeruginosa Peixe após a contaminação por Pseudomonas aeruginosa Figura 19 – Alteração da coloração de filé de peixe fresco ocasionada pela contaminação por Pseudomonas aerugionosa Perceba que, até este momento, falamos apenas de modificações físicas ocasionadas por espécies bacterianas. No entanto, bolores e leveduras também causam deteriorações, resultando em alterações químicas e físicas dos produtos alimentícios. O crescimento de bolores em alimentos, que ocorre mediante formação de micélios, torna esse produto inapropriado para o consumo. O micélio é um conjunto de hifas que apresentam diferentes aspectos: seco, pulverulento, úmido, gelatinoso, com aparência de algodão e de coloração com tonalidade variando entre amarelo, vermelho, preto, verde-acinzentado e castanho. 41 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Os bolores, de modo geral, são agentes responsáveis por perdas massivas na produção de frutas, legumes e verduras, pois são fitopatogênicos. Há, ainda, dois outros grupos de bolores especialmente importantes: aqueles que deterioram grãos e cereais estocados, também chamados de “bolores de armazenamento”, e aqueles que são psicrotróficos, que causam a deterioração de produtos refrigerados e que estamos bastante habituados a ver em nosso dia a dia quando deixamos alguns alimentos guardados por muito tempo na geladeira. Sobre os bolores de armazenamento, existem alguns gêneros (principalmente Aspergillus, Penicillium e Fusarium) produtores de algumas espécies de micotoxinas, das quais damos destaque às aflatoxinas. Essas substâncias são consideradas metabólitos, produzidos durante o crescimento da espécie de determinado fungo em frutas secas, cereais e sementes, especialmente o amendoim, em condições combinadas de umidade e temperatura elevadas, constituindo um risco à saúde humana, devido aos seus efeitos tóxicos. Além disso, a presença de bolores em produtos industrializados ainda intactos indicam utilização de matéria-prima de má qualidade ou falha nos protocolos de segurança microbiológica durante o processamento. Saiba mais Para saber mais sobre as micotoxinas, suas subclassificações, as principais espécies produtoras, bem como os efeitos e as dosagens tóxicas, leia: MAZIERO, M. T.; BERSOT, L. S. Micotoxinas em alimentos produzidos no Brasil. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, v. 12, n. 1, p. 89-99, 2010. Disponível em: https://bit.ly/3fdJIBA. Acesso em: 27 out. 2020. 2.4.2 Alterações químicas dos alimentos causadas por contaminação microbiana Os microrganismos, de modo geral, utilizam os nutrientes presentes nos alimentos como fontes de energia para o bom funcionamento de seus metabolismos, para que, consequentemente, consigam crescer e se multiplicar nesse meio. Falaremos nos próximos itens sobre as principais transformações químicas ocasionadas pela contaminação microbiana dos alimentos a partir da degradação de carboidratos, proteínas e lipídeos. 2.4.2.1 Carboidratos O consumo dos carboidratos pelos microrganismos pode ocorrer na presença ou ausência de O2. Em sua presença, há o predomínio de bactérias aeróbicas ou anaeróbicas facultativas e, nesse caso, ao consumir os carboidratos, os microrganismos produzirão como metabólitos finais moléculas de H2O e CO2. Já na ausência de O2, também chamado de metabolismo fermentativo, os microrganismos 42 Unidade I anaeróbicos consomem os carboidratos do alimento e produzem substâncias como ácidos orgânicos diversos, como pirúvico, lático, acético, propiônico, butírico, succínico, fórmico; além de etanol, CO2, H2S, acetaldeído e diacetil, que podem afetar as características organolépticas do alimento em questão. 2.4.2.2 Proteínas Relembrando, as proteínas são cadeias de aminoácidos ligadas por ligações peptídicas (ver figura a seguir). NH2 R COOHCH Grupo amino Grupo carboxilo Aminoácidos Aminoácidos Grupo R Phe Leu Ser Cys Figura 20 – Organização estrutural de proteínas Os microrganismos não conseguem utilizar como fonte de energia uma proteína intacta. Eles precisam hidrolisá-la com a ajuda de enzimas (proteases ou peptidases) e, assim, utilizar as moléculas menores resultantes, os peptídeos ou aminoácidos. Importantes patógenos alimentares, como Clostridium, Bacillus e Pseudomonas, secretam essas enzimas, que rapidamente “quebram” as proteínas dos alimentos em peptídeos solúveis e aminoácidos. Ao conseguirem utilizar as proteínas como fonte de energia para seus crescimentos, os microrganismos causam a biodeterioração proteica, mais conhecida como putrefação. Nessa reação, ocorre formação de substâncias com odores bastante desagradáveis e, em consequência das rupturas das moléculas de proteínas, também podem ocorrer alterações da textura, entre outras imperfeições no alimento. A degradação dos aminoácidos pode ocorrer de diferentes maneiras, dependendo dos microrganismos, da temperatura do meio, da quantidade de O2 disponível e das substâncias antimicrobianas presentes. • Desanimação oxidativa ou redutora: a primeira (desaminação oxidativa) ocorre quando, a partir do aminoácido glutamato, o microrganismo produz amônia e o alfa-cetoácido correspondente, 43 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS e os utiliza como fonte de energia. Já no caso da desaminação redutora, só ocorre se houver contaminação por microrganismos anaeróbicos, que produzirão no lugar do alfa-cetoácido, os ácidos orgânicos. Isso é importante de ser observado, pois a deterioração de pescados pode ser identificada pela análise de ácidos fórmico, acético, propiônico, entre outros. • Desaminação oxidativa e redutora, ocorrendo simultaneamente: os microrganismos do gênero Clostridium metabolizam o aminoácido L-alanina, por meio da desaminação oxidativa, e, de forma combinada, fazem a desaminação redutora de outro aminoácido, como a glicina, gerandoprodutos como ácido acético, amônia e CO2. • Descarboxilação: nesse tipo de putrefação, os microrganismos possuem a capacidade de produzir uma enzima, a descarboxilase, que realiza a remoção do grupamento carboxílico (ver figura anterior), presente nos aminoácidos. Em anaerobiose, a descarboxilação resulta na produção de aminas do tipo histamina, cadaverina e putrescina, a partir dos aminoácidos histidina, lisina e ornitina, respectivamente, as quais são voláteis e são utilizadas como indicadores da qualidade de pescados. • Produção de H2S: quando ocorre a degradação de aminoácidos contendo enxofre em sua composição, como a cisteína, produz-se o gás H2S, conhecido por seu odor característico de ovo podre. Entre as bactérias produtoras dessa substância estão as deteriorantes de produtos enlatados ou envasados, sendo a Desulfotomaculum nigrificans a espécie mais frequente.Também é interessante ressaltar que a produção de H2S em produtos cárneos pode resultar em uma alteração física desses alimentos, modificando sua coloração vermelha para tons de verde, marrom ou cinza. Isso ocorre quando carnes frescas são acondicionadas em embalagens a vácuo ou naquelas que não permitem a entrada de gases e que ficam armazenadas sob refrigeração entre 1 °C a 5 °C. Nessa situação, o H2S reage com o mioglobina, responsável pela coloração avermelhada da carne, formando a sulfomioglobina, que possui coloração esverdeada (ver figura a seguir). Figura 21 – Pontos esverdeados em carne acondicionada em embalagem do tipo atmosfera modificada, consequência da produção de H2S por microrganismos contaminantes 44 Unidade I • Decomposição do radical do aminoácido: nesse tipo de deterioração, os microrganismos produzem, a partir da decomposição do grupo R (ver figura 20) dos aminoácidos, compostos característicos, como o indol a partir da decomposição do radical do aminoácido triptofano, sendo essa substância também utilizada como indicadora da qualidade de pescados. É importante deixar claro que, diferentemente do que acontece na deterioração de carboidratos, em que há a redução do pH devido à produção de diversos ácidos orgânicos, na putrefação verifica-se a elevação do pH. Analisar o pH e constatá-lo ácido ou básico dará indícios do tipo de degradação que ocorreu em determinado alimento. 2.4.2.3 Lipídeos Os lipídeos mais abundantes nos alimentos são os triacilgliceróis, ou também denominados como triglicerídeos, em que a formação estrutural é resultado da esterificação de uma molécula de glicerol com três de ácidos graxos (ver figura a seguir). CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 + + + 3 H2O + águatriacliglicerolglicerol3 ácidos grasos CH2 CH2 CH2 OH O OH O OH O HO HO HO H H H H H H C C C C C C C C C C C C O O O O O O H H HH ... ... ... ... ... ... Figura 22 – Formação de uma molécula de triacilglicerol a partir do processo de esterificação entre três moléculas de ácidos graxos e uma de glicerol A degradação das moléculas de triacilgliceróis presentes em um determinado alimento dependerá do tipo de microrganismo responsável pela contaminação, mas, de modo geral, os microrganismos lipolíticos produzem lipases que irão “quebrar” as ligações entre as moléculas de ácidos graxos e glicerol. Ao realizar esse feito, poderá ocorrer a rancificação hidrolítica, processo em que, a partir da degradação dos triacilgliceróis de um alimento, há a liberação de ácidos graxos livres de cadeia curta, como o ácido butírico, caproico e caprílico, que, além de tornarem os lipídeos mais suscetíveis à oxidação, são voláteis e, portanto, emprestam odores desagradáveis ao alimento, popularmente chamado de “ranço”. Em alguns queijos essa reação é desejável, mas na maioria dos alimentos não. 3 MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS Em um mundo considerado perfeito, espera-se sempre que os microrganismos não tenham acesso ao alimento, mas, na prática, isso pode ser considerado impossível. Assim sendo, é necessária a adoção de práticas de conservação. 45 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Os métodos de conservação dos alimentos se relacionam com o controle do desenvolvimento de microrganismos com o intuito de eliminar os riscos associados à saúde do consumidor, além de prevenir ou prorrogar as modificações químicas e físicas, que foram discutidas nos itens anteriores. Esses métodos visam à eliminação total ou parcial dos microrganismos indesejáveis por meio da modificação ou suspensão de um ou mais fatores (intrínsecos ou extrínsecos), tornando o meio inaceitável para a proliferação desses agentes. Essa proteção do alimento também pode ser conseguida mediante o uso de substâncias químicas, que impedirão o crescimento de microrganismos. Os métodos de conservação dos alimentos terão como princípios: • Prevenir ou retardar a decomposição microbiana impedindo o acesso e o crescimento de microrganismos nos alimentos utilizando-se baixas temperaturas, desidratação, embalagem com condições atmosféricas desfavoráveis ou adição de conservantes químicos. Pode-se conseguir os mesmos efeitos destruindo os microrganismos, utilizando-se métodos que apliquem calor ou radiação. • Prevenir ou retardar a autodecomposição do alimento destruindo e inativando enzimas, como por meio do branqueamento, em que o alimento é imerso em água fervente, cozido por um tempo breve e, logo em seguida, resfriados com água gelada. Ainda, pode-se evitar a autodecomposição, impedindo que reações químicas ocorram, como a prevenção das oxidações dos lipídeos utilizando-se um antioxidante. • Evitar que insetos ou outros animais causem danos aos alimentos. Você já deve ter percebido que existem vários métodos de conservação. Discutiremos, individualmente, os principais deles nos itens a seguir. 3.1 Conservação por agentes químicos Um conservante químico é uma substância química adicionada intencionalmente a um alimento para garantir que ele não seja contaminado por microrganismos deteriorantes ou patogênicos, ou que a deterioração seja o máximo possível prorrogada. O número de substâncias com propriedade conservante é limitado, visto que, como serão ingeridos com os alimentos, precisam comprovar segurança para não comprometer a saúde do consumidor. Organizações internacionais (Codex Alimentarius, programa conjunto a Food and Agriculture Organization e OMS) e nacionais (Ministério da Saúde, por meio da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA) regularizam os aditivos permitidos, os alimentos que podem conter conservantes, bem como a dose diária aceitável, que significa a máxima concentração dessa substância, que pode ser ingerida diariamente sem ser nociva à saúde. Entre os conservantes químicos que são autorizados para o uso em produtos alimentícios, os mais utilizados são o ácido ascórbico e seus derivados, o ácido benzoico e o propiônico e seus respectivos sais, o dióxido de enxofre e seus derivados, os ácidos orgânicos (lático, acético e cítrico) e os nitritos e nitratos. 46 Unidade I Daremos enfoque a essas duas últimas substâncias, pois existe grande polêmica que correlaciona sua presença, principalmente em produtos cárneos, e a carcinogênese. Saiba mais Para conhecer mais detalhadamente sobre os principais conservantes químicos, leia: FANI, M. Os conservantes mais utilizados em alimentos. Aditivos e Ingredientes, v. 1, n. 123, p. 40-46, 2015. Disponível em: https://bit.ly/34a2686. Acesso em: 27 out. 2020. O nitrato de sódio (NaNO3) e o nitrito de potássio (KNO3) são comumente utilizados em solução para obtenção de carnes curadas, já que possuem a capacidade de estabilizar a cor vermelha quando entra em reação com a mioglobulina, formando as nitrosaminas. Também são inibidores de alguns agentes deteriorantes e patogênicos, especialmente a espécie Clostridium botulinum, além de melhorarem as características organolépticas desses produtos alimentícios. Sobre seu efeito contra o Clostridiumbotulinum, ele ocorre pela inibição do crescimento das células desse microrganismo durante o armazenamento e pela prevenção da germinação dos esporos de resistência que possam ter resistido ao processo térmico aplicado. Para que isso aconteça, a quantidade de nitrito deve ser maior do que aquela utilizada para melhorar a cor e o sabor dos produtos cárneos curados. Apesar da sua fundamental importância nesses tipos de alimento, o uso de nitritos e nitratos têm seus inconvenientes. O grande problema reside na reação dessas substâncias com aminas secundárias formando as nitrosaminas, as quais, de modo geral, são carcinogênicas. Saiba mais Para saber um pouco mais sobre as nitrosaminas e seus riscos à saúde pública, acesse: AVALIAÇÃO DO risco de nitrosaminas: por quê? [S. l.: s. n.], 2020. 1 vídeo (2min44). Publicado pelo canal Fernanda Waechter. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=q61px5EOhlc. Acesso em: 27 out. 2020. Existem outros importantes compostos químicos que também agem como conservantes e que são utilizados desde os tempos remotos, com o objetivo de estender o tempo de prateleira dos alimentos. 47 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Já parou para pensar em como nossos antepassados faziam para preservar os produtos perecíveis, como carnes e pescados, por exemplo? Uma das maneiras que o homem pré-histórico encontrou para preservar e garantir a qualidade de seus alimentos foi utilizando a salga. Há ainda relatos de povos que conseguiam esse mesmo efeito utilizando o mel. Mas qual é o modo de ação dessas substâncias? Tanto o sal como o açúcar do mel agem pelo mesmo mecanismo, ou seja, em altas concentrações, esses compostos provocam a desidratação tanto do alimento como dos microrganismos pertencentes à microbiota residente. Os microrganismos possuem água em seus interiores e, quando são colocados em solução hipertônica, a água tende a sair da célula microbiana, com o objetivo de equilibrar/solubilizar a grande quantidade de soluto (no caso, açúcar ou sal) do ambiente externo (ver figura a seguir). Esse fenômeno chama-se plasmólise e também ocorre com as células de carnes e frutas, ocasionando a desidratação desses alimentos. MembranaSoluto Parede celular Água Solução isotônica: observa-se semelhante concentração de soluto tanto dentro quanto fora da célula bacteriana, havendo, portanto, um equilíbrio da movimentação da água. Solução hipertônica: há maior concentração de soluto fora da célula bacteriana, portanto a água se move para fora da célula, causando o encolhimento do citoplasma – plasmólise. Citoplasma Figura 23 – Demonstração ilustrativa da plasmólise de uma célula bacteriana A defumação também é uma prática bastante antiga para conseguir prolongar a validade dos alimentos. A fumaça, além de contribuir para a melhoria do sabor e cor dos alimentos, possui substâncias com atividades antimicrobianas, como o formaldeído, por exemplo, que atua causando a desnaturação das proteínas dos microrganismos pela sua reação com os grupamentos amina, prejudicando a proliferação. Em função da necessidade do calor para obtenção da fumaça, a segurança microbiológica dos produtos defumados também pode ser atribuída à destruição térmica de microrganismos da superfície, além da desidratação. Outras substâncias químicas, mais frequentes nos tempos atuais, são os gases utilizados em embalagens de produtos alimentícios processados, como comentamos no item “Composição química do ambiente”, desta unidade. 3.2 Conservação por agentes físicos Diferentemente dos métodos químicos, que possuem um número consideravelmente pequeno de substâncias permitidas para serem utilizadas na conservação dos alimentos, os agentes físicos são inúmeros. A seguir, falaremos sobre os principais e mais utilizados métodos físicos de conservação de produtos alimentos: 48 Unidade I 3.2.1 Métodos de remoção Falaremos, inicialmente, sobre alguns dos métodos de conservação dos alimentos por remoção dos microrganismos presentes, que são: lavagem; sedimentação/centrifugação e filtração. A lavagem, como o próprio nome diz, consiste em lavar o alimento como etapa prévia ao envasamento, congelamento ou consumo de um alimento cru, como frutas e legumes, por exemplo, com o objetivo de se removerem não apenas microrganismos, mas também poeira e resquícios de pesticidas. Já a sedimentação consiste em uma das primeiras etapas do sistema de tratamento de água para torná-la potável, em que partículas mais pesadas, como as células dos microrganismos, tenderão a se depositar no fundo dos tanques de tratamento. A centrifugação possui o mesmo embasamento de separação de partículas, no entanto, o processo é acelerado mediante o uso de um equipamento chamado centrífuga, que rotaciona de forma bastante veloz e permite a separação de partículas de maior densidade, que se depositarão no fundo de um tubo em formato cônico. Nas indústrias produtoras de leite, esse processo é realizado para remover partículas indesejadas que ficam suspensas na superfície. Entre os métodos de remoção, a filtração é o único método que remove completamente os microrganismos, mas que, ao mesmo tempo, é inconveniente por ser limitado apenas a alimentos líquidos. Nesse processo, o líquido é filtrado, sob pressão de uma bomba a vácuo, por uma membrana com poros micrométricos, permitindo que o líquido resultante seja completamente livre de microrganismos (estéril). É uma técnica bastante utilizada para garantir esterilidade de sucos de frutas, refrigerantes, água, vinho e cerveja. A figura a seguir ilustra os processos de centrifugação e filtração. Células ou elementos mais pesados se depositam no fundo do tubo Centrífuga Filtração Centrifugação Figura 24 – Processos de centrifugação e filtração 49 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 3.2.2 Métodos de conservação por altas temperaturas O uso desses métodos está baseado no efeito destrutivo que o calor exerce sobre os microrganismos, mais especificamente, causando a desnaturação de suas proteínas e inativação de enzimas, fundamentais para o bom funcionamento de seus metabolismos. Os alimentos podem ser tratados termicamente por dois tipos de processos: pasteurização e esterilização. Pasteurização Esse método é utilizado principalmente pela indústria de laticínios para a obtenção do leite pasteurizado. Tem como principal objetivo a destruição de todos os microrganismos patogênicos, mas também acaba por reduzir o número de microrganismos deteriorantes, resultando na extensão do tempo de prateleira, sobretudo quando o produto é armazenado sob refrigeração, o que garante uma barreira a mais a ser superada pelos microrganismos. Bastante versátil, a pasteurização também é utilizada para garantir a segurança microbiológica de outros produtos, como iogurtes, sorvetes, cervejas, vinhos e vinagres. Nessa técnica, duas combinações de tempo e temperatura podem ser aplicadas: 63 °C por 30 minutos (baixa temperatura por longo tempo) ou 72 °C por 15 minutos, de uso ainda mais frequente. Esse último processo também é conhecido como HTST, do inglês high-temperature short-time pasteurization, que traduzido significa “pasteurização por alta temperatura por curto tempo”. É importante reforçar que essa técnica não permite destruir esporos bacterianos, como aqueles produzidos pela espécie Clostridium botulinum, por exemplo, ou, ainda, algumas bactérias resistentes ao calor. Portanto, quando se deseja a remoção completa de qualquer forma de vida em alimento, recorre-se à esterilização. Observação Por volta de 1864, um grupo de comerciantes procuraram o cientista francês Louis Pasteur pedindo que ele descobrisse o porquê de os vinhos e cervejas azedarem tão rápido, instando-lhe que desenvolvesse um método que impedisse esse acontecimento. O cientista descobriu que um tipo de fungo, chamado levedura, convertia o açúcar do vinho e da cerveja em etanol na ausência de ar, processo hoje conhecido como fermentação. Quando essas bebidas eram expostasao ar, bactérias contaminantes transformavam o álcool em vinagre (ácido acético). Pasteur então propôs o aquecimento das cervejas e vinhos por tempo e temperatura suficientes para matar as bactérias que causavam esse inconveniente. Hoje, esse método é conhecido como pasteurização. 50 Unidade I Esterilização A esterilização, por definição, destrói todas as formas de vida microbiana, incluindo os esporos bacterianos. Normalmente, esse processo ocorre por meio do uso de autoclaves (ver figura), em que, sob uma pressão de 1 atmosfera acima da pressão do nível do mar, a água pode ser aquecida a 121 °C e o vapor úmido gerado entra em contato com os microrganismos, causando a coagulação das proteínas e levando-os à morte. Um período de 15 minutos já é o suficiente para alcançar esse objetivo. A esse processo damos o nome de esterilização completa. Figura 25 – Autoclave comum, muito utilizada em laboratórios de pesquisa e ensino No entanto, nas indústrias de alimentos, emprega-se o termo “esterilização comercial”, sendo esse método frequentemente utilizado para alimentos enlatados. Costuma-se pensar que os alimentos enlatados são completamente livres de microrganismos, ou seja, estéreis. A verdade é que a temperatura empregada na esterilização absoluta (121 °C) é muito alta e poderia degradar os nutrientes do alimento. Assim sendo, os alimentos enlatados são submetidos apenas a uma temperatura suficiente para destruir os esporos de resistência produzidos por Clostridium botulinum, produtores da toxina botulínica, responsáveis por causar o botulismo alimentar. Esse processo se refere à esterilização comercial e, diferentemente da esterilização completa, utiliza-se um equipamento chamado retorta (ver figura a seguir), ainda que funcione baseado nos mesmos princípios da autoclave. 51 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Figura 26 – Equipamento retorta utilizado no processo de esterilização de alimentos enlatados A figura a seguir ilustra o processo de esterilização comercial de alimentos enlatados. Nessa primeira etapa, realiza-se uma lavagem ou branqueamento do alimento utilizando vapor ou água quente visando amolecer o alimento para que a lata seja preenchida mais facilmente. Esse tratamento também reduz a população microbiana e desativa enzimas que podem alterar cor, textura e sabor do alimento. As latas são completamente preenchidas, deixando o mínimo espaço vazio. O vapor é utilizado para esgotar ou expulsar o ar ainda presente. Nessa etapa, as Iatas são então vedadas. As latas são esterilizadas por meio de vapor pressurizado dentro da retorta. Em seguida, as latas são resfriadas por submersão em banho de água ou por pulverização de água. Por fim, as latas são etiquetadas, estocadas e liberadas para a comercialização. Figura 27 – Processo de esterilização comercial de alimentos enlatados 52 Unidade I Saiba mais Para entender melhor as etapas do processo de enlatamento dos alimentos industrializados e ver como isso funciona na prática, assista ao vídeo: ENLATADOS (ESTERILIZAÇÃO comercial) – fábrica de conserva de pescados (atum enlatado). [S. l.: s. n.], 2019. 1 vídeo (9min27). Publicado pelo canal Inspeção e bem-estar animal online. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=3ZNhuGUtX2o. Acesso em: 28 out. 2020. Falamos sobre leites pasteurizados, mas você já ouviu falar sobre leite tipo “longa vida” ou “UHT”? O termo UHT vem da denominação em inglês ultra high temperature e significa tratamento sob temperaturas elevadas. Esse termo é utilizado quando o leite é submetido a temperaturas entre 140 °C e 150 °C por quatro segundos e, posteriormente, é rapidamente resfriado em uma câmara a vácuo, garantindo a esterilidade da bebida. Quando a embalagem está intacta, ou seja, não foi aberta pelo consumidor, esse tipo de leite pode ser armazenado sem refrigeração por vários meses, sem alteração de suas características organolépticas. 3.2.3 Métodos de conservação por desidratação O processo para desidratar os alimentos, junto à conservação por salgas, são os métodos mais milenares entre os sistemas de preservação dos alimentos. A conservação por desidratação se fundamenta no fato de que todos os microrganismos e enzimas precisam de água para serem ativos. Assim sendo, nesse método se reduz a quantidade de água até certo ponto em que os microrganismos deteriorantes e patogênicos não encontrem condições de se multiplicarem nesse meio. É importante reforçar que, prioritariamente, com esse método, deseja-se prevenir a contaminação microbiana. No entanto, outros efeitos podem ser obtidos, como a prevenção de alterações químicas e físicas no alimento, favorecidas pelo excesso de água, além de que, quanto mais reduzido for o tamanho de determinado alimento pela remoção da água, menor espaço ele ocupará, reduzindo, portanto, os custos associados com armazenamento, embalagens e transporte. Como o processo de conservação por desidratação é realizado? Na Antiguidade, a desidratação dos alimentos era feita de forma natural, expondo o produto ao sol e ao vento, sendo importante observar que as temperaturas precisavam ser elevadas e o ar estar seco para que não houvesse, posteriormente, a contaminação microbiana. Atualmente, em ambientes industriais, ainda que se realize o processo de secagem natural devido a seu baixo custo, a desidratação de forma controlada é mais frequente e pode ser feita por algumas técnicas descritas a seguir: 53 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS • Secagem a vácuo, em que o alimento é acondicionado dentro de uma câmara na qual o vácuo é produzido e a água se evapora mediante a aplicação de baixas temperaturas. • Secagem em túneis, a qual empregam-se túneis por onde bandejas contendo os alimentos são movimentadas paralelamente ou contra uma corrente de ar (ver figura). Fornalha Duto para levar ar quente à câmara Câmara de secagem Figura 28 – Figura esquemática demonstrando a secagem por túneis • Secagem por liofilização, que é a eliminação da água por sublimação. Para isso, o alimento precisa ser primeiramente congelado rapidamente. Logo após, é colocado em um equipamento chamado liofilizador (ver figura a seguir), onde, sob vácuo, é realizada a desidratação do produto. Frutas secas são frequentemente produzidas por esse sistema. Figura 29 – Liofilizador industrial utilizado para secagem de alimentos • Secagem por atomização, ou também conhecida pelo termo em inglês spray drying, é quando um alimento líquido ou semissólido é colocado por um bico atomizador dentro de uma câmara de secagem. O produto sai do bico atomizador como uma névoa e, com isso, aumenta sua superfície 54 Unidade I de contato com o ar quente da câmara, resultando em sua desidratação (ver figura a seguir). O leite em pó foi um dos primeiros produtos a ser produzido por esse sistema. Líquido Ar aquecido Separador Bico atomizador Câmara de secagem Pó Figura 30 – Demonstração esquemática do processo de secagem por spray drying 3.2.4 Métodos de conservação por baixas temperaturas Entre os fatores extrínsecos, a temperatura com certeza é um dos parâmetros mais determinantes na atividade metabólica dos microrganismos. Quanto mais reduzida a temperatura, menor será a atividade metabólica microbiana. Nesse sentido, o resfriamento e o congelamento dos alimentos são os métodos que irão conservá-los por meio de baixas temperaturas. Esses métodos são frequentemente utilizados para a conservação de alimentos perecíveis e visam impedir o crescimento de todos os microrganismos, em especial, aqueles pertencentes aos grupos dos psicrotróficos, já mencionados anteriormente nesta unidade. A seguir, falaremos detalhadamente sobre a refrigeração e o congelamento. 3.2.4.1 Refrigeração A temperatura ideal dos refrigeradores deve estar entre 2 °C a 8 °C. Essa temperatura debilita o metabolismo da grande maioria dos microrganismos, o que atribui ao resfriamento um efeito bacteriostático.Até mesmo os psicrotróficos, que são capazes de se desenvolver em tais condições, terão seu metabolismo bastante reduzido e crescerão lentamente nos alimentos armazenados sob a temperaturas dos refrigeradores, o que, ao longo dos dias, resultará em alterações da cor e sabor dos alimentos. Por esse motivo, a refrigeração é considerada um método de conservação temporário, necessitando de métodos complementares. Por exemplo, carnes e pescados são alimentos que podemos armazenar em refrigerador por alguns dias, no entanto, a vida útil desses alimentos poderia ser estendida se fossem envasados em embalagens com atmosfera modificada, representando uma barreira adicional a ser superada pelos microrganismos deteriorantes e patogênicos. 55 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Outra observação importante a ser feita a respeito da refrigeração é que os alimentos devem ser refrigerados em porções pequenas, de forma que seja possível serem completamente resfriados em um curto período de tempo, não dando margem para a proliferação dos microrganismos psicrotróficos. 3.2.4.2 Congelamento A baixa temperatura alcançada pelo congelamento (normalmente, -18 °C) permite a esse método maior eficiência quando comparado com a refrigeração em relação à redução da deterioração que é causada por microrganismos, enzimas e O2, pois, quanto menor a temperatura de armazenamento, maior será o prolongamento do tempo de prateleira dos alimentos, além de ser adicionalmente vantajoso para manutenção da sua cor, aparência e aroma. Existem dois tipos de processos para o congelamento dos alimentos: o rápido, em que a temperatura é diminuída a aproximadamente -20 °C em 30 minutos, e o lento, em que a temperatura de congelamento é atingida em 72 horas (processo que ocorre em nossos congeladores domésticos). Daremos um enfoque ao congelamento rápido, pois apresenta mais vantagens em relação à qualidade do produto, sendo especialmente interessante por não permitir a adaptação dos microrganismos àquela baixa temperatura, o que aconteceria durante o congelamento lento. Além disso, os cristais de gelo formados durante o processo de congelamento não destroem mecanicamente as células dos alimentos, o que acontece durante o congelamento rápido devido à formação de cristais grandes. É importante dizer que o método de conservação por congelamento não é esterilizante, apesar de haver uma considerável redução populacional. A parcela de microrganismos destruídos por esse método morre, principalmente, pelo congelamento da água livre, que é um componente vital, pela desnaturação das proteínas e enzimas celulares, devido a suas lesões pelos cristais de gelo, por alteração nos lipídeos de membrana, dificultando a permeabilidade celular, e pela perda de gases citoplasmáticos como O2, por exemplo, que, para os microrganismos aeróbicos, resulta no impedimento das reações respiratórias. Observação Você saberia dizer por que não é recomendado que se congele e descongele produtos cárneos sucessivas vezes? A maioria das razões está associada a modificações da textura, sabor e da qualidade nutricional. No entanto, a segurança microbiológica pode ser comprometida. Quando se recongelam produtos de origem animal, as células liberam enzimas que podem degradar as macromoléculas desse alimento em compostos mais simples, os quais são mais fáceis de serem utilizados pelos microrganismos remanescentes, favorecendo sua proliferação e, consequentemente, a deterioração do produto. 56 Unidade I 3.2.5 Método de conservação por radiação ionizante A radiação tem efeitos diversos nas células microbianas que dependem do comprimento de onda, da intensidade de emissão da radiação e do período de exposição. Para a conservação de alimentos, a radiação com comprimento de onda mais curto (raios gama e raios X) são de maior interesse, pois são mais nocivos aos microrganismos (ver figura). Figura 31 – Espectro de energia radiante O principal efeito da radiação ionizante sobre os microrganismos é a formação de radicais hidroxila (OH−), que é altamente reativa, a partir da ionização de seu conteúdo citoplasmático aquoso. Esses radicais, por sua vez, acabam interagindo com componentes orgânicos da célula microbiana, especialmente com o DNA, mediante à desestabilização de pontes de hidrogênio e de duplas ligações. O uso da radiação ionizante para prolongar o tempo de prateleira dos alimentos data de 1929, por uma patente protocolada nos Estados Unidos. Nos últimos anos, tem recebido crescente destaque, pois, como destrói os microrganismos sem haver o aumento significativo da temperatura, a qualidade nutricional do alimento permanece praticamente intacta, desde que respeitadas as doses de radiação. A dose de radiação é medida em Grays (em homenagem a um dos primeiros radiologistas). Para falar de milhares de Grays, utiliza-se a abreviação kGy. Para eliminar ou reduzir a carga microbiana em carnes bovinas e de aves, utiliza-se uma dose de 1 kGy a 10 kGy, também conhecida como “dose de pasteurização”. Nos Estados Unidos, os alimentos tratados por esse método recebem um símbolo chamado “radura” (ver figura a seguir), que muitas vezes tem sido interpretado como advertência, o que gera certa insegurança ao consumidor, apesar de possuir segurança garantida pelos órgãos competentes. É importante reforçar que os alimentos irradiados não são radioativos, e para isso basta imaginar a mesa 57 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS de raio X de uma unidade de radiologia que não se torna radioativa após exposições frequentes de radiações ionizantes. Figura 32 – Símbolo Radura utilizado pelos Estados Unidos para indicar que alimentos foram tratados com radiação ionizante No Brasil, esse método também é permitido pelas autoridades legais que obrigam que os alimentos processados dessa maneira recebam em seus rótulos a seguinte descrição: “alimento tratado por processo de irradiação”. Apesar disso, há uma preocupação de que as indústrias possam estar usando esse método de forma abusiva, camuflando as condições precárias de higiene dos alimentos, além de já haver evidências da presença de traços de compostos causadores de câncer, após determinados alimentos terem sido tratados por radiação ionizante. 4 UTILIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS PARA A PRODUÇÃO DE ALIMENTOS Existe uma forte tendência em pensarmos nos microrganismos como vilões, associando-os sempre a doenças, contaminações e deteriorações. No entanto, é preciso esclarecer que muitas espécies microbianas são fundamentais na produção de diversos alimentos e bebidas, além de outros produtos de interesse industrial, como enzimas e antibióticos, por exemplo. O uso de microrganismos para a produção de alimento é um costume bastante antigo e, em tempos remotos, era feito de forma inconsciente e sem muito controle. Hoje, sabe-se que nossos antepassados iniciaram a produção de alimentos e bebidas através do processo de fermentação. Mas, afinal, o que é fermentação? Para produzir energia (ATP) para o seu metabolismo, os microrganismos necessitam consumir os nutrientes do meio. A fonte de energia mais facilmente consumida por eles é a glicose, que pode ser utilizada por dois processos: a respiração e a fermentação, sendo essa última o foco do nosso assunto. 58 Unidade I Sob condição anaeróbica, a fermentação ocorre quando a glicose é quebrada em duas moléculas de ácido pirúvico, que, por sua vez, recebe elétrons e íons hidrogênio da coenzima NADH, sendo convertidos em produtos finais da fermentação, que podem ser diversos, dependendo do microrganismo que estiver realizando o processo. A figura a seguir ilustra o processo de transformações bioquímicas na fermentação, bem como os produtos metabólicos finais que podem ser obtidos por diferentes microrganismos. Organismo Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus Saccharomyces (levedura) Proplonibacterium Clostridium Escherichia, Salmonella Enterobacter Produto(s) final(is) da fermentação Ácido láctico Etanol e CO2 Ácido propiônico,ácido acético, H2 e CO2 Ácido butírico, butanol, acetona, álcool isopropílico e CO2 Etanol, ácido láctico, ácido succínico, ácido acético, CO2 e H2 Etanol, ácido láctico, ácido fórmico, butanodiol, acetoína, CO2 e H2 Ácido pirúvico Glicólise Glicose 2 NDA+ 2 NADH 2 ADP 2 NADH 2 ATP 2 NAD+ 2 Ácido pirúvico Ácido pirúvico (ou derivado) Formação de produtos finais de fermentação Figura 33 – Esquema ilustrativo do processo de fermentação e a produção de diferentes substâncias dependendo dos microrganismos que realizam o processo São esses produtos finais que transformarão, por exemplo, trigo em pão, leite em queijo ou iogurte, uvas em vinho, malte em cerveja, arroz japonês em saquê, cana-de-açúcar em cachaça etc. A seguir, discutiremos em detalhes como algumas dessas transformações acontecem. 59 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 4.1 Produção de queijos O processo de fabricação de queijo ocorreu muito ocasionalmente, quando, na Antiguidade, muitos anos antes de Cristo, um comerciante árabe, em uma de suas viagens, armazenou leite em uma espécie de bolsa produzida com estômago de bezerro. Dentro de alguns dias depois, ele percebeu que o leite havia desaparecido e, em seu lugar, encontrava-se uma pasta semissólida e um líquido amarelado. Para ele, a situação era um completo desastre, mas nascia ali um dos alimentos mais consumidos, o queijo. A explicação desse incidente é muito simples. Durante a ordenha, bactérias da pele do animal “contaminaram” o leite, dentro de um recipiente praticamente anaeróbico, as bactérias se proliferaram e, como produto de seus metabolismos, produziram o ácido lático. Nesse meio ácido, enzimas presentes na bolsa feita de estômago de bezerro (resina e/ou pepsina) contribuíram com o processo, precipitando as proteínas do leite e dando origem ao que chamamos de coalho (parte semissólida do queijo), que se separa da parte líquida (soro de leite). Hoje, temos um domínio muito maior sobre esse processo e sabemos que a partir da lactose (açúcar do leite), adiciona-se uma pequena porcentagem de bactérias ácido-láticas selecionadas, principalmente pertencentes aos gêneros Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus e Streptococcus, que produzirão o ácido lático auxiliando na formação do coalho, além de exercer uma efetiva inibição do crescimento de microrganismos indesejados. As bactérias ácido-láticas também são fundamentais durante o processo de maturação/cura dos queijos, pois morrerão e liberarão enzimas intracelulares, que, por sua vez, continuarão atuando nos componentes do queijo para dar-lhes as características peculiares de sabor, aroma, corpo e textura. Saiba mais Para conhecer os detalhes da produção industrial de queijos, acesse ao vídeo: INCRÍVEIS MÁQUINAS de fabricação de queijo e satisfatórias que estão em um novo nível. [S. l.: s. n.], 2020. 1 vídeo (10min5). Publicado pelo canal TechZone. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=aoC08-0ezMo. Acesso em: 28 out. 2020. 4.2 Produção de outros produtos lácteos A partir do leite ainda é possível produzir outros diversos produtos fermentados. A manteiga é um deles. A manteiga é produzida a partir de uma espécie de creme de leite (tipo uma nata), que é fermentada com uma mistura de espécies de bactérias ácido-láticas, geralmente composta pelos gêneros Lactococcus e Streptococcus. Esses microrganismos aumentarão a viscosidade do creme e produzirão diacetil, uma combinação de duas moléculas de ácido acético, responsável pelo sabor e aroma característico desse produto. 60 Unidade I Por fim, esse creme fermentado será processado em uma batedeira, etapa da fabricação em que se tem, de fato, a formação da manteiga. Nessa etapa, com a agitação, glóbulos de gordura se unirão formando aglomerados cada vez maiores, havendo a separação de uma parte líquida, o lentelho ou o soro de manteiga, o qual costuma ser desprezado. Outro produto lácteo fermentado que faz parte do nosso dia a dia é o iogurte. Em um processo industrial, o iogurte é preparado a partir da evaporação de um quarto da água do leite, deixando-o mais concentrado, utilizando uma panela a vácuo. Forma-se um leite espesso, ao qual adiciona-se as bactérias ácido-láticas, mais comumente uma mistura de Streptococcus thermophilus, principal produtor de ácido lático, e Lactobacillus bulgaricus, que produz substâncias que contribuem com o sabor e o aroma desse laticínio. Mais recentemente, outro fermentado lácteo tem recebido crescente destaque: o kefir. Essa bebida láctea é resultado da fermentação do leite por uma comunidade de bactérias e leveduras que se organizam em grãos (ver figura a seguir). Figura 34 – Grão de kefir Um estudo avaliou a composição microbiológica de um kefir e identificou 359 espécies de microrganismos, havendo a predominância de bactérias ácido-láticas com propriedades probióticas, o que atribui a essa bebida diversos benefícios à saúde, entre os quais, verifica-se com maior frequência o auxílio em distúrbios gastrointestinais. 4.3 Produção de pão Outro alimento fermentado que está muito presente diariamente em nossas mesas é o pão, produzido a partir da fermentação do trigo moído. O consumo de pães data de dez mil anos antes de Cristo e, naquela época, esse alimento era produzido apenas pela mistura de farinha de trigo e água, formando uma massa que era cozida em pedras quentes. Como não havia a presença de fermento (microrganismos), esse pão não crescia e apresenta-se achatado e duro. Com o passar dos tempos, o homem foi aprimorando seu modo de produção, e hoje sabe-se que não há pão se não houver a fermentação da farinha de trigo pela espécie de levedura chamada Saccharomyces cerevisiae, presente no fermento. 61 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS De forma resumida, a produção industrial dos pães envolve três etapas de fermentação. Na primeira ocorrerá a fermentação principal com produção de CO2, resultando na formação de bolhas de ar, que ficarão retidas na massa, dobrando ou até triplicando seu volume inicial. Após essa etapa, realiza-se o boleamento, operação manual ou mecânica que tem por objetivo eliminar a pegajosidade da massa, dando-lhe ao mesmo tempo uma forma regular. Posteriormente, haverá uma segunda fermentação para recuperar a extensibilidade perdida no boleamento. Logo após, ocorre a moldagem, etapa em que é dada a forma característica aos pães, que ficarão “descansando” por, aproximadamente, duas horas. Durante o descanso, ocorrerá a terceira fermentação, em que os pães recuperarão o tamanho adequado. Por fim, ocorre a cocção. É importante ressaltar que o CO2 não é o único metabólito formado durante a fermentação. Há também a produção de etanol, que, durante a cocção, em conjunto com a água, evapora-se gerando uma crosta dourada, tão apreciada e desejada quando compramos os pãezinhos. 4.4 Produção de bebidas alcoólicas e vinagre Você sabia que a maioria das bebidas alcoólicas é produzida a partir da fermentação por microrganismos? A cerveja, por exemplo, é produzida por espécies de leveduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae, a partir da fermentação do amido de cereais (malte de cevada, principalmente) em grandes tanques de fermentação (ver figura a seguir). É preciso esclarecer que as leveduras não conseguem consumir diretamente o amido do malte. É preciso realizar o processo de moagem dos grãos secos, conhecido como maltagem. Durante esse processo, as enzimas que degradam o amido (amilase) são liberadas e o converterão nos açúcares simples glicose e maltose. Somente dessa maneira, as leveduras serão capazes de utilizarem essas substâncias como fonte de energia, produzindo como metabolismo final o etanol e o CO2. Figura 35 – Tanques de fermentação onde ocorre a produção de cerveja 62 Unidade I Observação Por curiosidade, já existem no mercado as cervejas light, ou seja, de baixa caloria. Durante a produção dessas cervejas, adiciona-se intencionalmente a enzima amilase ou, então, utilizam-se linhagensde leveduras que convertem maior quantidade do amido da cevada em glicose e maltose, resultando em menor quantidade de carboidrato e mais álcool. Depois, a cerveja só precisará ser diluída até atingir a porcentagem alcoólica habitual. Outra bebida fermentada bastante consumida é o vinho, bebida preparada exclusivamente pela fermentação de uvas maduras ou frescas prioritariamente por leveduras, porém, bactérias ácido-láticas podem ser utilizadas quando o vinho é feito de uvas ácidas por conta da presença de altas concentrações de ácido málico. Nesse caso, tais bactérias transformam esse ácido málico em ácido lático, que é mais fraco, resultando em um vinho menos ácido, com sabor mais delicado. É importante dizer que pode ocorrer a produção de vinho por outras frutas, mas, de acordo com a legislação brasileira, na embalagem dessas bebidas é obrigatório que se coloque, após a denominação vinho, o nome da fruta de origem, por exemplo, vinho de maçã, vinho de abacaxi etc. Outro detalhe importante é que a obtenção dos vinhos tinto e branco dependerá do tipo de uva. Para vinho branco, utilizam-se uvas brancas (do tipo Chardonnay, Pinot Blanc, Moscatel, entre outras) ou só a polpa das uvas tintas. Para vinho tinto, é necessário usar as uvas tintas com pele (do tipo Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinot Noir, entre outras), que liberarão compostos fenólicos, como antocianinas, flavonas, taninos, que contribuirão para os atributos sensoriais e, principalmente, para a coloração característica do vinho tinto. As etapas da produção de vinhos estão representadas na figura a seguir: 63 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS As uvas colhidas são cuidadosamente selecionadas. Sulfito é adicionado para eliminar microrganismos indesejáveis. A levedura que participa da fermentação é adicionada. As uvas são maceradas e o bagaço é retirado. O vinho é filtrado. É envelhecido em barris. Ocorre a fermentação. Por fim, o vinho é engarrafado. Em tonéis específicos, o vinho torna-se mais límpido devido à decantação de alguns sólidos remanescentes. O fermentado resultante é prensado para separar os sólidos do vinho. Figura 36 – Etapas da produção de vinho Quando o vinho é intencionalmente exposto ao ar livre, ocorre a contaminação pelas bactérias aeróbicas, como as do gênero Acetobacter e Gluconobacter. Essas bactérias converterão o etanol do vinho em ácido acético, resultando no vinagre. Você deve estar se perguntando, mas e as bebidas alcoólicas destiladas? São também obtidas a partir de fermentações? E a resposta é sim. Nas bebidas como uísque, vodca, cachaça e rum, por exemplo, são utilizados cereais, tubérculos e melaço como substrato fermentável para diversas bactérias que produzirão o etanol como produto final de seus metabolismos. O etanol é, então, destilado para que possa ser utilizado em bebidas alcoólicas concentradas. Lembrete A presença de microrganismos nos alimentos está quase sempre associada a doenças, no entanto, é preciso sempre lembrar que existem muitas espécies de microrganismos que são utilizadas para se produzir alimentos, com especial destaque à espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae, para a produção de cervejas e de pão. As bactérias lácteas também merecem o devido destaque, visto que sem elas não teríamos o queijo e nem o iogurte que consumimos diariamente. 64 Unidade I Resumo Nesta unidade você aprendeu sobre a influência dos microrganismos nos alimentos. Primeiramente, abordamos seu aspecto negativo quando estão presentes de forma indesejada, estragando os alimentos ou até mesmo causando doenças (DTA) por meio de manifestações do tipo infecção ou intoxicação, ou ambas ao mesmo tempo (toxinfecções). Isso acontece porque os microrganismos encontram nos alimentos todos os nutrientes de que precisam para crescerem e se multiplicarem. Sabendo disso, em seguida, discutimos como os fatores intrínsecos (Aa, pH, composição nutricional, potencial de oxirredução, presença de substâncias antimicrobianas e microbiota natural) e extrínsecos (umidade relativa, temperatura e composição química do ambiente ou do armazenamento) dos alimentos podem atuar beneficiando ou impedindo o crescimento e a multiplicação de determinadas espécies, sendo que, quando presentes, a concentração de microrganismos dependerá da intensidade desses fatores, que podem atuar contra os microrganismo de forma individual sinérgica (barreiras de Leistner). Vimos também que, de uma forma ou outra, os microrganismos sempre estarão presentes nos alimentos como microbiota inicial. Quando esses microrganismos sobrevivem às barreiras impostas pelos fatores intrínsecos e extrínsecos, eles alterarão as características físicas e químicas dos produtos alimentícios, causando deteriorações, que podem ser percebidas pelos consumidores, pois sofrem modificações na coloração, no sabor e no odor dos alimentos. Por outro lado, dependendo do agente contaminante, essas modificações nem sempre ocorrem ou, então, não são facilmente percebidas pelos consumidores. Por esse motivo, as indústrias alimentícias estão cada vez mais focadas em produzir embalagens inteligentes que ajudam a identificar produtos estragados. Ainda nesta unidade, vimos que as indústrias alimentícias utilizam diversos métodos de conservação, com o objetivo de prolongar o tempo de prateleira dos alimentos, especialmente aqueles considerados perecíveis. Entre os quais, podemos citar a esterilização comercial, a pasteurização, a salga e a desidratação. Por fim, vimos o aspecto positivo da presença dos microrganismos nos alimentos e pudemos perceber que determinadas espécies são essenciais para a produção de diversos alimentos, como os laticínios (queijos, manteiga, iogurte e kefir), o pão, as bebidas alcoólicas, especialmente vinho e cerveja, e também o vinagre. 65 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Exercícios Questão 1. (Enade 2016, adaptada) Leia o texto a seguir. “A indústria de lácteos tem utilizado bactérias lácticas nos mais variados produtos, como culturas iniciadoras ou adjuntas em leites fermentados e queijos, pois elas favorecem características sensoriais e tecnológicas, além de promover a conservação, inibindo a competição da microbiota deteriorante e de agentes patogênicos. Esses produtos devem também atender aos padrões de identidade e qualidade, que garantem ao consumidor um alimento padronizado, seguro e de qualidade.” WENDLING, L. K; WESCHENFELDER, S. Probióticos e alimentos lácteos fermentados: uma revisão. Rev. Inst. Laticínios Cândido Tostes, v. 68, n. 395, p. 49-57, 2013 (com adaptações). No contexto apresentado, avalie as afirmativas e a relação proposta entre elas. I – O leite não é meio adequado para a multiplicação de microrganismos probióticos, o que torna a produção de leite fermentado probiótico um grande desafio para a indústria. porque II – A multiplicação de bactérias probióticas em leite como meio de cultivo é lenta, em virtude, principalmente, da ausência de atividade proteolítica, podendo ser necessária a incorporação de nutrientes, como peptídios e aminoácidos, e de outros fatores de crescimento, para se reduzir o tempo de fermentação. A respeito dessas afirmativas, assinale a opção correta. A) As afirmativas I e II são verdadeiras, e a II é uma justificativa correta da I. B) As afirmativas I e II são verdadeiras, e a II não é uma justificativa correta da I. C) A afirmativa I é verdadeira, e a II é falsa. D) A afirmativa I é falsa, e a II é verdadeira. E) As afirmativas I e II são falsas. Resposta correta: alternativa A. 66 Unidade I Análise da questão Para resolver a questão, devemos lembrar de alguns pontos importantes sobre probióticos e sobre aspectos tecnológicos de interesse para a sua produção, como os expostos a seguir. Probióticos são microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal. Várias cepas de lactobacilos e bifidobactérias destacam-se entre os microrganismos probióticos mais utilizados.Entre os efeitos benéficos atribuídos aos lactobacilos, temos o auxílio na digestão da lactose em indivíduos intolerantes, a redução da constipação e da diarreia infantil, o auxílio na resistência a infecções por salmonela, a prevenção da “diarreia do viajante” e o alívio da síndrome do intestino irritável. Às bifidobactérias são atribuídos os efeitos de estimulação do sistema imunológico, a produção de vitamina B, a inibição da multiplicação de patógenos, a redução da concentração de amônia e colesterol no sangue e o auxílio no restabelecimento da microbiota normal, depois de tratamentos com antibióticos. Entre os aspectos a serem considerados na utilização de culturas probióticas na tecnologia de obtenção de produtos alimentícios, temos a exigência de que sejam selecionadas cepas para uso humano, e que as culturas a serem utilizadas apresentem boas propriedades tecnológicas, ou seja, devem mostrar boa multiplicação no leite e conferir as características sensoriais adequadas ao produto, além de manter estabilidade e viabilidade durante o seu processamento e armazenamento. Análise das afirmativas I – Afirmativa verdadeira. Justificativa: existe grande desafio na produção de leite fermentado probiótico, já que, apesar de ser rico do ponto de vista nutricional, ele não é um meio adequado à multiplicação desses microrganismos. Em função principalmente da ausência de atividade proteolítica, o leite é um meio de cultivo que causa a multiplicação lenta dos microrganismos probióticos. II – Afirmativa verdadeira. Justificativa: em função, principalmente, da ausência de atividade proteolítica, o leite é um meio de cultivo que causa a multiplicação lenta dos microrganismos probióticos. O recurso para resolver os problemas da lentidão de crescimento e da inviabilidade dos probióticos no leite é a incorporação de micronutrientes, como peptídios e aminoácidos, além de outros fatores de crescimento (o que causa redução no tempo de fermentação e possibilita a viabilidade dos microrganismos probióticos). Relação entre as afirmativas: além de a afirmativa II ser verdadeira, ela explica corretamente a proposição contida na afirmativa I, que também é verdadeira. 67 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Questão 2. Leia o texto e observe o gráfico a seguir. “Surtos de DTA no município de São Paulo Surtos de diarreia ou de doenças transmitidas por alimentos (DTA) são definidos quando dois ou mais casos apresentam diarreia aguda e/ou gastroenterite aguda relacionados em tempo e espaço ou por uma fonte comum de contaminação (água ou refeição/alimento comum). No gráfico a seguir, temos a distribuição dos surtos de DTA no município de São Paulo (MSP) segundo o mês de notificação e o comparativo entre os anos de 2015 a 2019, com dados atualizados até 30/08/2019.” Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez 82016 8 26 11 5 7 5 5 3 5 1 4 22018 2 13 7 2 6 2 6 6 4 2 8 222015 0 5 10 15 20 25 30 12 28 8 5 7 8 8 11 7 7 2 22017 14 9 7 4 5 2 8 13 12 0 1 52019 10 11 11 7 2 2 6 Mês de notificação n. su rt os d e DT A Figura 37 Disponível em: https://www.prefeitura.sp.gov.br/cidade/secretarias/upload/ saude/boletim_epidemiologico_DTA_outubro_2019.pdf. Acesso em: 28 set. 2020 (com adaptações). Com base na leitura, analise as afirmativas. I – O número de surtos notificados foi maior nos anos de 2015 e 2016. II – Os meses de verão concentram o maior número de surtos notificados no período analisado. III – Em 2015, foi notificado mais do que o dobro do número de surtos notificados em 2018. 68 Unidade I É correto o que se afirma em: A) I, apenas. B) II, apenas. C) I e III, apenas. D) I e II, apenas. E) I, II e III. Resposta correta: alternativa E. Análise da questão A partir da análise do gráfico, os números de surtos notificados ao ano, de 2015 a 2019 (somando-se os números, mês a mês, no quadro anexo ao gráfico), foram os apresentados a seguir: 2015: 125 casos. 2016: 68 casos. 2017: 77 casos. 2018: 58 casos. 2019 (de janeiro a agosto): 54 casos. O número de surtos é maior nos meses de verão. Análise das afirmativas I – Afirmativa correta. Justificativa: isso pode ser visto no gráfico e nos números mostrados no quadro adjacente. II – Afirmativa correta. Justificativa: o maior número de notificações ocorreu no mês de março, fim do verão. III – Afirmativa correta. Justificativa: em 2015, foram notificados 125 surtos e, em 2018, 58. Portanto, em 2015, tivemos mais do que o dobro dos valores de 2018, pois 125 : 58 = 2,15.