Extração líquido-líquido com sistemas de duas fases aquosas ( Adriene, Sandywellen e Leocir- TP1)

Prévia do material em texto

Extração líquido-líquido com sistemas de duas fases aquosas 
 
 
 
Docente: Prof. Cristina Cabral 
 
 
 
Adriene Oliveira – 35762 
Sandywellen Almeida – 38717 
Leocir Alcochete – 45285 
 
 
 
Ano letivo 2022/2023 
 
 
Índice 
1. Introdução ...................................................................................................................................... 3 
2. Materiais e reagentes ...................................................................................................................... 4 
3. Medidas e Observações.................................................................................................................. 6 
4. Tratamento de resultados ............................................................................................................... 8 
4.1. Cálculo da concentração de proteína em cada fase ................................................................................................ 8 
4.2. Volume das fases .................................................................................................................................................. 11 
4.3. Percentagem de recuperação ................................................................................................................................ 11 
4.4. Coeficiente de partição......................................................................................................................................... 12 
4.5. Percentagem de PEG e de fosfato no sistema ...................................................................................................... 12 
5. Conclusão e discussão de resultados .............................................................................................. 15 
6. Bibliografia ..................................................................................................................................... 16 
 
3 
 
 
1. Introdução 
 
Em sistemas de duas fases aquosas, uma solução aquosa pode ser composta por dois polímeros 
hidrofílicos ou um polímero e sais. Quando a concentração desses componentes ultrapassa um valor 
crítico, a solução deixa de ser homogênea e ocorre a separação em duas fases distintas e a causa dos 
polímeros serem imiscíveis é devido a fórmula molecular de cada um, resultando numa repulsão 
mútua. Em cada fase resultante, um dos componentes predominará, enquanto o outro predominará na 
outra fase. Geralmente, a fase orgânica fica na parte superior, sendo assim a fase aquosa fica na parte 
inferior do tubo (exceto em casos em que a fase orgânica é mais densa do que a fase aquosa). 
Os sistemas de duas fases mais comumente utilizados são compostos por PEG e dextrano, e PEG e 
fosfato de potássio (combinação que utilizamos na nossa prática laboratorial). Essas combinações são 
especialmente interessantes em operações industriais devido ao baixo custo do sal em comparação 
com o dextrano purificado. A distribuição de um bioproduto entre as fases de um sistema de duas 
fases aquosas é descrita pelo coeficiente de partição, K, que representa a relação entre as 
concentrações do bioproduto na fase superior e na fase inferior. O coeficiente de partição é constante 
em uma ampla faixa de concentrações, desde que não ocorram fenómenos de dissociação entre as 
moléculas. Cada molécula se concentra na fase que permite o máximo de interações, distribuindo-se 
entre as fases de forma a minimizar a energia do sistema. A partição de proteínas, outras moléculas e 
partículas em sistemas de duas fases aquosas é influenciada por vários fatores relacionados ao sistema 
bifásico e ao bioproduto a ser separado. Alguns parâmetros importantes desse sistema incluem a 
massa molecular e o tipo de polímero, a concentração de polímeros ou sais (que determina o 
comprimento da linha de equilíbrio no diagrama de fases), temperatura, pH, tipos de iões presentes 
no sistema, força iônica e a presença de grupos específicos ligados ao polímero. Através da criação 
das duas fases aquosas promovido pelo sal, por meio da otimização dos parâmetros do sistema, é 
possível realizar uma extração seletiva de uma proteína específica para uma das fases e as 
características da biomolécula influenciarão na fase para a qual ela migrará. 
Sobre as propriedades do bioproduto a separar que podem influenciar na partição temos: carga, 
hidrofobicidade, tamanho ou área superficial, conformação e a presença de ligandos bioespecíficos. 
Este trabalho experimental tem como objetivo o estudo do peso molecular do polímero e o efeito do 
comprimento da “Tie line”. 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
2. Materiais e reagentes 
 
Tabela 1 - Materiais usados durante a aula prática. 
Micropipetas 1000 μL, 200 μL, 100 μL 
Pipeta graduada 20 mL, 5 mL 
Pipeta volumétrica 20 mL 
Pompete - 
Tubos de ensaio 50 mL 
Cubeta de plástico - 
Espectrofotômetro UV-Vis - 
Centrífuga 2000 G 
Balão volumétrico 200mL, 50 mL, 25 mL, 
Vareta - 
Suporte - 
Balanca analitica - 
 
 
Tabela 2 - Reagentes usados durante o experimento prático. 
PEG 400, 1500, 1500*, 4000, 10000 
H2O destilada - 
KH2PO4 1M 
K2HPO4 2M 
*Solução PEG 65% (p/v) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
Métodos 
 
Método de Bradford 
 
6 
 
 
3. Medidas e Observações 
 
No laboratório preparamos 5 tubos de ensaio para construir o sistema bifásico. Foi necessário calcular 
as massas das PEG´s 50% e 65% a serem pesadas. 
 
Para PEG 50%: 
Vf= 25mL de H2O 
𝑚𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑎𝑃𝐸𝐺 =
25𝑚𝐿 (𝐻2𝑂) × 50𝑔 (𝑃𝐸𝐺)
100𝑚𝐿 (𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜)
= 12,5𝑔 
 
Para PEG 65%: 
Vf = 25mL de H2O 
𝑚𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑎𝑃𝐸𝐺 =
25𝑚𝐿 (𝐻2𝑂) × 65𝑔 (𝑃𝐸𝐺)
100𝑚𝐿 (𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜)
= 16,25𝑔 
 
Tabela 3 – Massa teórica calculada e a massa real de PEG pesada no laboratório para a preparação 
dos 5 tubos de ensaio 
PEG Massa teórica (g) Massa real (g) 
PEG 400/fosfato 12,5 12,503 
PEG 1500/fosfato 12,5 12,575 
PEG 1500/fosfato* 16,25 16,254 
PEG 4000/fosfato 12,5 12,505 
PEG 10000/fosfato 12,5 12,520 
 
 
Tabela 4 – Massas dos tubos, com PEG e sistema total. 
Sistema 
Massa do 
tubo (g) 
Tubo + PEG 
(g) 
Tubo+ 
sistema (g) 
1 16,0168 18,0853 21,9200 
2 15,7659 17,5879 21,4856 
3 15,9286 17,5777 21,7647 
4 15,8168 17,5759 21,4892 
5 15,7084 17,5095 21,6407 
 
 
7 
 
 
 
Cálculo do volume inicial para as preparações das soluções de concentrações conhecidas: 
 
𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓   ↔  𝑉𝑖 =
𝐶𝑓 × 𝑉𝑓
𝐶𝑖
 
 
Tabela 5 – Valores da concentração inicial e do volume final. 
Concentração inicial (mg/mL) Volume final (mL) 
2,0 0,1 
 
Tabela 6 – Apresentação da concentração e volume presentes nas diluições de cada tubo. 
 
Tubos Concentração final 
(mg/mL) 
Volume inicial 
(mL) 
1 0,05 0,0025 
2 0,10 0,0050 
3 0.20 0,0100 
4 0,40 0,0200 
5 0,60 0,0300 
6 0,80 0,0400 
7 1,00 0,0500 
*Perfez-se cada tubo até 0,1 mL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
 
4. Tratamento de resultados 
 
4.1. Cálculo da concentração de proteína em cada fase 
 
Para calcular a concentração da proteína em cada fase, procedeu-se primeiramente a construção de 
uma reta de calibração na qual queríamos 0,1 𝑚𝐿 de soluções de concentrações 
conhecidas(0,05;  0,1;  0,2;  0,4;  0,6;  0,8;  1 
𝑚𝑔
𝑚𝐿
) em tubos de ensaio. Sabendo as concentrações, isso 
nos permitiu calcular absorvância e obter uma reta de calibração. Juntamente foi calculado o volume 
inicial que teríamos de adicionar para preparar essas soluções, ou seja, que volume teríamos de 
adicionar aos tubos, partindo de uma concentração inicial de 2,0
𝑚𝑔
𝑚𝐿
 para termos nos tubos 0,1 𝑚𝐿 de 
soluções de concentrações conhecidas. 
NOTA: Foram feitos dois ensaios para a reta de calibração de forma a escolher o melhor valor de R2. 
 
Tabela 7 – Concentrações e absorvâncias a 595nm. 
[BSA] (mg/mL) Ensaio 1 Ensaio 2 Média 
0,05 0,087 0,085 0,086 
0,1 0,135 0,123 0,129 
0,2 0,237 0,269 0,253 
0,4 0,672 0,455 0,5630,6 0,666 0,680 0,673 
0,8 0,844 0,859 0,851 
1 0,960 0,966 0,963 
 
No ensaio 1 retirou-se o ponto 4, para obter uma melhor reta de calibração, devido a um baixo valor 
de R2. No ensaio 2, o ponto 7 também foi excluído por razoes semelhantes. Quanto mais próximo o 
valor de R2 estiver de 1 indica uma alta correlação entre a concentração e a absorvância, sugerindo 
que a reta de calibração é um modelo confiável. Por outro lado, um valor baixo de R2 indica que os 
pontos experimentais não estão bem ajustados a reta, apontando uma correlação mais fraca ou 
influencia de outros fatores. Sendo assim, para melhorar a precisão da relação removeu-se os pontos 
discrepantes, resultando numa reta de calibração mais confiável. 
 
 
9 
 
 
Gráfico 1 – Relação entre a concentração e a média dos ensaios das absorvâncias. 
 
𝐴𝑏𝑠 = 1,0351[𝐵𝑆𝐴] + 0,0362 
R2=0,09987 
 
A realização de mais de um ensaio para a determinação da absorvância na solução é importante devido 
a possibilidade de variações experimentais e aleatórias. Ao realizar múltiplos ensaios e calcular a 
média das absorvâncias obtidas, é possível reduzir o efeito dessas variações e obter um resultado mais 
confiável e preciso. Isso aumenta a confiabilidade dos dados e fornece uma estimativa mais precisa 
da absorvância da solução desconhecida. Em ordem a obtermos um R2 superior a 0,995 retiramos os 
pontos de concentrações 0,4 e 1 mg/mL. 
 
Tabela 8 – Absorvância da amostra de BSA de concentração desconhecida 
Ensaio Absorvância 
1 0,457 
2 0,403 
Media 0,430 
 
A partir da reta de calibração obtida anteriormente, realizou-se os cálculos para obter a concentração 
inicial de BSA desconhecida da solução mãe. 
𝐴𝑏𝑠 =  1,0351[𝐵𝑆𝐴] +  0,0362 
0,430 = 1,0351[BSA]+0,0362 
[BSA] = 0,3804 mg/mL 
 
10 
 
Como a solução mãe tinha sido obtida a partir de uma diluição, multiplicamos o valor da 
concentração por 10: 
 
[𝐵𝑆𝐴] = 0,3804
𝑚𝑔
𝑚𝐿
× 10 
[𝐵𝑆𝐴] = 3,804
𝑚𝑔
𝑚𝐿
 
 
Soluções de PEG 50%: 
50𝑔 𝑑𝑒 𝑃𝐸𝐺  →  100𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐻2𝑂  
𝑥  →  25𝑚𝐿 𝑑𝑒  𝐻2𝑂  
𝑥 =  12,5𝑔 𝑑𝑒 𝑃𝐸𝐺  
 
Soluções de PEG 65%: 
65𝑔 𝑑𝑒 𝑃𝐸𝐺  →  100𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐻2𝑂  
𝑥  →  25𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐻2𝑂  
𝑥 =  16,25𝑔 𝑑𝑒 𝑃𝐸𝐺 
 
Através da mesma reta de calibração obtida através do Método de Bradford, podemos obter as 
concentrações de [BSA] nas soluções de PEG. 
𝐴𝑏𝑠 = 1,0351[𝐵𝑆𝐴] + 0,0362 
Tabela 9 – Concentração e absorvância comparativa entre a fase inferior e superior considerando o 
fator diluição 1:10. 
PEG 
Inferior Superior 
Abs [BSA] (mg/mL) Abs [BSA] (mg/mL) 
400 0,120 0,80958 0 -0,34972 
1500 0,378 3,30209 0,492 4,40344 
 1500* 0,197 1,55347 0,562 5,07970 
4000 0,411 3,62091 0 -0,34972 
10000 0,256 2,12347 0,579 5,24394 
 
A fase com maior seletividade será a fase que terá o produto de interesse, nesse caso o BSA. 
No caso do PEG 400 houve uma baixa diferença de densidade entre as fases, sendo mais difícil 
diferenciar onde o BSA se encontrava. 
 
 
11 
 
4.2. Volume das fases 
 
Após a centrifugação dos tubos, conseguimos observar 2 fases (exceto no tubo com PEG 400). E 
abaixo foram calculados os volumes dessas fases. Por se tratar de um tubo cilíndrico, usamos: 
 𝑉𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑑𝑟𝑜 = 𝜋 ⋅ 𝑟
2 ⋅ ℎ  
 
Devido a superfície concava do tubo de ensaio na parte inferior, não foi possível utilizar a altura da 
fase inferior para determinar seu volume. Portanto, foi necessário adotar uma abordagem alternativa: 
 
 𝑉𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿 =  𝑉𝑓𝑎𝑠𝑒  inf 𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 + 𝑉𝑓𝑎𝑠𝑒  sup 𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟  
 𝑉𝑓𝑎𝑠𝑒  inf 𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 =  𝑉𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿 − 𝑉𝑓𝑎𝑠𝑒  sup 𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 
 
NOTA: 𝑉𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿 corresponde ao volume de PEG + H2O + KH2PO4 + K2HPO4 adicionados para a 
construção das 2 fases. 
 
 
Tabela 10 - Valores dos volumes calculados para as fases superior e inferior. 
Tubos 
Altura fase 
superior (cm) 
Volume fase 
superior (mL) 
Volume total 
(mL) 
Diâmetro 
(cm) 
Volume fase 
inferior (mL) 
1 - - 4,802 × 103 1,3 - 
2 1,3 1,725 × 103 4,801 × 103 1,3 3076 
3 1,3 1,725 × 103 4,698 × 103 1,3 2973 
4 1,5 1,990 × 103 4,892 × 103 1,3 2902 
5 1,5 1,990 × 103 4,892 × 103 1,3 2902 
NOTA: Como o tubo 1 não apresenta uma fase, consideramos apenas o volume total. 
 
4.3. Percentagem de recuperação 
 
% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜 =
[𝐵𝑆𝐴]𝑒𝑛𝑠𝑎𝑖𝑜
[𝐵𝑆𝐴]𝑠𝑜𝑙. 𝑚ã𝑒  
× 100 
 
[𝐵𝑆𝐴]𝑠𝑜𝑙.𝑚ã𝑒 = 3,804
𝑚𝑔
𝑚𝐿
 
 
12 
 
Tabela 11- Percentagem de recuperação das fases superior e inferior. 
Sistema 
% 
Recuperação 
fase inferior 
% 
Recuperação 
fase superior 
% 
Recuperação 
total 
1 21,282 0 21,282 
2 86,806 115,758 202,564 
3 40,838 133,536 174,374 
4 95,187 0 95,187 
5 55,822 137,853 193,675 
 
NOTA: Pelo facto de as concentrações das fases superiores dos sistemas 1 e 4 serem negativas 
([𝐵𝑆𝐴]𝑒𝑛𝑠𝑎𝑖𝑜), nós consideramos como 0. 
 
4.4. Coeficiente de partição 
𝐾 =
𝐶𝐿
𝐶𝐻
 
Onde K é o coeficiente de partição, CL é a [BSA] na fase orgânica (fase do extrato) e CH é a [BSA] 
na fase aquosa (fase do refinado). 
 
Tabela 12 – Relação entre a [BSA] da fase inferior e superior para obter o coeficiente de partição, K. 
PEG 
[BSA] (mg/mL) 
K 
Superior Inferior 
400 0 0,80958 0 
1500 4,40344 3,30209 1,3335 
1500* 5,07970 1,55347 3,2699 
4000 0 3,62091 0 
10000 5,24394 2,12347 2,4695 
 
4.5. Percentagem de PEG e de fosfato no sistema 
 
Cálculo da massa de fosfato: 
Tabela 13- Dados do Hidrogenofosfato de Potássio e do Dihidrogenofosfato de Potássio. 
K2HPO4 KH2PO4 
MM (K2HPO4) = 174,2 g/mol MM (KH2PO4) = 136,086 g/mol 
[K2HPO4] = 2M [KH2PO4] = 1M 
MM (PO4) = 94,97g/mol 
 
13 
 
Exemplo de cálculo para PEG 400: 
Para Dihidrogenofosfato de Potássio: 
𝑛  = 𝐶 × 𝑉  =  1𝑀 × 0,277 𝑚𝑙  = 277 × 10−6 
𝑚 = 𝑛 × 𝑀  =  277 × 10−6 × 136,086  = 0,038 𝑔 
 
0,038 𝑔  →  136,086 
𝑔
𝑚𝑜𝑙
 
 
𝑥 𝑔  →  94,97 
𝑔
𝑚𝑜𝑙
   →  𝑥 = 0,026 𝑔 𝑃𝑂4 
 
Para Hidrogenofosfato de Potássio: 
𝑛  = 𝐶 × 𝑉  = 2 × 2475 × 10−6 = 4950 × 10−6 
𝑚  = 𝑛 × 𝑀  = 4950 × 10−6 × 174,2  = 0,862 𝑔 
0,862 𝑔  →  174,2 
𝑔
𝑚𝑜𝑙
 
𝑥 𝑔  →  94,97 
𝑔
𝑚𝑜𝑙
   →  𝑥 = 0,469 𝑔 𝑃𝑂4 
 
 
Cálculo da massa de PEG: 
Para PEG 50%: 
𝑚𝑃𝐸𝐺 400 = 
𝑉𝑃𝐸𝐺 400 × 50 
100 𝑚𝐿
 
 
𝑚𝑃𝐸𝐺 400 =
2,04 × 50
100
= 1,02 𝑔 
 
Para PEG 65%: 
𝑚𝑃𝐸𝐺 1500 = 
𝑉𝑃𝐸𝐺 1500 × 65 
100 𝑚𝐿
 
 
 
14 
 
𝑚𝑃𝐸𝐺 1500 =
1,66 × 65
100
= 1,079 𝑔 
 
Tabela 14- Massas de fosfatos e de PEG total, em gramas. 
PEG 
Massa de PO4 
em KH2PO4(g) 
Massa de PO4 em 
K2HPO4 (g) 
Massa total de 
fosfato (g) 
Massa de PEG 
(g) 
PEG 400 0,026 0,470 0,496 1,020 
PEG 1500 0,026 0,455 0,480 0,990 
PEG 1500* 0,028 0,501 0,530 1,079 
PEG 4000 0,021 0,376 0,397 0,850 
PEG 10000 0,021 0,376 0,397 0,850 
* Solução PEG 65% (p/v) 
 
 
Cálculo da % de PEG e fosfato no sistema: 
Usando a massa total de fosforo e PEG podemos calcular as percentagens destes. 
 
𝑚𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙= 𝑚𝑃𝐸𝐺+ 𝑚𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 
𝑚𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙  𝑔  →  100% 
𝑚𝑃𝑂4  𝑔  →  𝑥%   
 
 
Tabela 15- Percentagens de fosfato e de PEG. 
PEG % Fosfato % PEG 
PEG 400 32,73 67,27 
PEG 1500 32,65 67,34 
PEG 1500* 32,92 67,08 
PEG 4000 31,85 68,15 
PEG 10000 31,85 68,15 
* Solução PEG 65% (p/v) 
 
15 
 
 
5. Conclusão e discussão de resultados 
 
Relativamente a percentagem de recuperação, chegamos a conclusão que o sistema 2, 3 e 5 não são 
muito plausíveis para saber para onde a proteína se deslocou mais e para saber se houve perdas da 
nossa proteína. Isto porque esses sistemas apresentaram um valor de percentagem superior a 100% que 
poderia ser devido a erros laboratoriais. O sistema 1 apresentou uma fase inferior com proteína (21% ), 
e uma fase superior sem proteína, logo a proteína deslocou-se para a fase inferior, e como a 
percentagem total é inferior à 100% é porque houve uma perda de 79% da proteína. O sistema 4 
apresentou uma fase inferiorcom proteína (95% ) e uma fase superior sem proteína, logo a proteína 
deslocou-se para a fase inferior, e como a percentagem total é inferior à 100% é porque houve uma 
perda de 5% . 
Relativamente ao coeficiente de partição, quando K < 1, significa que a BSA sofreu maior partição 
para a fase inferior. Por outro lado, quando K > 1, significa que a BSA sofreu maior partição para a 
fase superior. Analisando os valores obtidos de coeficiente de partição constatamos que no sistema 2 
(PEG 1500) obtivemos um 𝐾 > 1 (1,3335) que nos possibilitou concluir que a proteína tem maior 
afinidade para a fase superior. No sistema 3 (PEG 1500∗) obtivemos um 𝐾 > 1 (3,2699) que nos 
possibilitou concluir que a proteína tem maior afinidade para a fase superior. No sistema 5 (PEG 
10000) obtivemos um 𝐾 > 1 (2,4695) que nos possibilitou concluir que a proteína tem maior 
afinidade para a fase superior. Nos demais sistemas (1 e 4) não podemos concluir nada, porque 
obtivemos valores de K= 0. 
Concluímos que a proteína apresentou maior afinidade para a fase com PEG na maioria dos sistemas. 
Os PEGs de maior peso molecular são mais hidrofóbicos, facilitando a formação do ABS (aqueous 
biphasic systems), uma vez que esses polímeros apresentam menor afinidade pelas moléculas de água. 
A partição da BSA para a fase rica em sal (inferior) é fortemente favorecida em sistemas com maior 
massa molar de PEG, devido ao aumento da natureza hidrofóbica do PEG com massa molar. 
O valor do coeficiente de partição tende a diminuir com o aumento da concentração de PEG, devido 
à diminuição do volume livre disponível para a proteína acomodar na fase rica em PEG. A BSA é de 
natureza hidrofílica, as interações repulsivas entre o polímero e a proteína tornam-se mais fortes à 
medida que a massa molecular do polímero é aumentada, resultando em uma distribuição da proteína 
para a fase inferior, porque a hidrofobicidade relativa da fase inferior é muito baixa. 
 
O comprimento da tie line é outro aspeto que influencia, porque dependendo da tie line podemos não 
conseguir distinguir as duas fases (plait-point) e ser difícil de separar a biomolécula ou o contrário e 
conseguir distinguir. Comparando o PEG 1500 de 50% (p/v) e o PEG 1500 de 65% (p/v), podemos 
ver que o de 65% (p/v) seria mais fácil de isolar a proteína, porque apresenta uma tie line mais longe 
do plait-point. 
 
16 
 
 
6. Bibliografia 
 
• Ahuja, S. (Ed.). (2000). Handbook of Bioseparations (1st ed.). June 5, 2000. 
• Juan A. Asenjo, Barbara A. Andrews, Aqueous two-phase systems for protein separation: Phase 
separation and applications, Journal of Chromatography A, Volume 1238, 2012. 
• Yin Hui Chow, Yee Jiun Yap, Mohd. Shamsul Anuar, Bimo Ario Tejo, Arbakariya Ariff, Pau 
Loke Show, Eng-Poh Ng, Tau Chuan Ling, Interfacial partitioning behaviour of bovine serum 
albumin in polymer-salt aqueous two-phase system, Journal of Chromatography B, Volume 
934, 2013.