Glutationa total e reduzido

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Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
Protocolo: Glutationa (GSH) _ Griffith (1980) / Anderson (1985) 
 
Determinação do Glutationa (reduzido e total) {[GSX] = [GSH] + 2* [GSSG]} 
1. Princípio do método 
A Glutationa é um tripeptídeo com ação antioxidante que pode se apresentar na forma reduzida 
(GSH) ou na forma oxidada, glutationa disulfeto (GSSG). Sua determinação baseia-se na redução do DTNB 
pelo GSH, em meio levemente básico (pH = 7,4). Procedimento de reciclagem de DTNB-GSSG redutase, ou 
seja, a GSH é oxidada pelo 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) para obter GSSG com formação 
estequiométrica de ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB) produz uma coloração amarelada, que tem absorbância 
máxima no comprimento de onda de 412 nm. O coeficiente de extinção do TNB é 14,15 mM cm-1. Para a 
determinação de glutationa, é realizada uma reação com a enzima GR dependente de NADPH para reduzir 
GSSG a GSH. 
 
2. Material 
 Espectrofotômetro (visível); cubeta de 1 mL ou placa, centrífuga refrigerada; almofariz e pistilo; 
balança analítica; becker; provetas; balões volumétricos; tubos de ensaio comuns; bastão de vidro; massa 
magnética; agitadores magnético e de tubos de ensaio. 
 
3. Reagentes 
Para Griffith (1980) - Extração 
• TCA 5%; (5 mL TCA 100% completar para 100 mL com água) 
Reagentes para mancha analítica 
• Tampão fosfato de sódio 150 mM, pH=7,4 + EDTA 6,3 mM + 2-vinylpiridina 1mM; ( dissolver 
10,3493 g Fosfato de sódio monobásico em 300 mL de água e 1,1726 g de EDTA em 150 mL de água, 
ajusta o pH para 7,4 e completar o volume para 500 mL); 
• NADPH 0,3 mM (0,0063 g completar para 25 mL com Tampão fosfato de sódio 150 mM, pH=7,4 + 
EDTA 6,3 mM) (Sensível a luz/ perecível) 
• DTNB 6 mM; (0,0595 g completar para 25 mL com Tampão fosfato de sódio 150 mM, pH=7,4 + 
EDTA 6,3 mM) (Sensível a luz/ perecível) 
• 2-Vinilpiridina 97% (Aldrich, cat. Nº 132292) 
• Trietanolamina ≥ 98% (Sigma, cat. no. T1377) 
• Glutationa redutase 1U mL-1. 
 
4. Marcha analítica 
Extração por Griffith (1980) 
a) Proceder a extração mediante a homogeneização de 0,5 mg do material vegetal com nitrogênio 
líquido, seguida pela homogeneização com 5 mL de solução de TCA a 5%, a 4 °C. Em seguida, 
centrifugar a 12.000 × g, por 15 min, e coletar o sobrenadante. (se necessário armazenar em 
ultrafreezer -80°C, mas as amostras para determina GSSG devem ser tratadas antes) 
 
Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
Protocolo: Glutationa (GSH) _ Griffith (1980) / Anderson (1985) 
 
Tratamento da amostra (apenas para determinar GSSG) 
a) Reservar em um eppendorf 500 μL de extrato adicionar 10 μL de 2-Vinilpiridina 97% (Aldrich, 
cat. Nº 132292) a aguarde a reação por 1 h a temperatura ambiente [Deve ser feito na capela e o 
2-vinilpiridina deve ser adicionada o mais rápido possível, pois ocorre oxidação do GSH no 
GSSG in vitro rapidamente nos tecidos rompidos] 
b) Adicionar 30 μL Trietanolamina ≥ 98% (Sigma, cat. no. T1377) e agitar vigorosamente os tubos 
e aguarde 10 min para reação de neutralização do excesso de 2-Vinilpiridina na amostra. (se 
necessário armazenar em ultrafreezer -80°C) 
Glutationa reduzida (fazer triplicata para cada amostra) 
a) A reação para glutationa reduzida é feita em um tubo de ensaio (Placa) adicionando-se 100 (10) 
μL de extrato; 300 (30) μL de solução-tampão fosfato de potássio a 150 mM, pH=7,4 + EDTA 
6,3 mM; 500 (50) μL da solução enzimática (GR a 1 U mL-1); 500 (50) μL de NADPH a 0,3 
mM; 
b) A mistura deve ser incubada a 30 °C por 10 min e depois adicionada de 100 (10) μL de solução 
de DTNB 6 mM mantendo a mistura por mais 15 min a 30 °C antes de proceder com a leitura 
espectrofotométrica 412 nm. 
c) Calcular os teores de Glutationa reduzida e total foram realizados mediante formação de 5-thio-
2-nitrobenzoic acid (TNB) usando nos cálculos ƐTNB = 14,15 mM 
-1 cm 
-1. Note que para 
determinação em placa o l = 0,416 cm. 
 
5. Cálculo 
Glutationa Total (GSx) 
ABS[Amostra não tratada] - ABS[branco] / 14,15 mM 
-1 cm 
-1 = [GSx] (mM) * 1,5/1000 * 5000/100 = GSx (mmol) 
* 1/0,5 = GSx (mmol/ g MF) * (100 – Umidade %)/100 = GSx (mmol/ g MS) 
Glutationa oxidada (GSSG) 
ABS[Amostra tratada] - ABS[branco] / 14,15 mM 
-1 cm 
-1 = [GSH] (mM) * 1,5/1000 * 5000/100 * 108/100 (fator 
de correção devido adição de reagente para tratamento da amostra) = GSH (mmol) * 1/0,5 = GSH (mmol/ g 
MF) * (100 – Umidade %)/100 = GSH (mmol/ g MS) / 2 = GSSG (mmol/ g MS) 
Glutationa reduzida (GSH) 
[GSH] = [GSX] - 2* [GSSG] = GSH (mmol/ g MS) 
Referências 
Griffith, O.W. (1980) Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 
2-vinylpyridine. Analytical Biochemistry, 106, pp. 207-212. 
Anderson, M. E. (1985). Determination of glutathione and glutathione disulfide. Methods Enzymol, 113, 548-
555.