Protocolo Enzimas Antioxidativas (SOD,CAT,APX,G-POD)

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Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
 
 
 
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PREPARO DO EXTRATO ENZIMÁTICO BRUTO PARA DETERMINAÇÃO DAS 
ATIVIDADES DAS ENZIMAS: APX, G-POD, CAT e SOD. 
1. Material necessário: 
Balança analítica, espátula, becker 1L, bastão de vidro ou massa magnética, funil de 
transferência, pisseta, balão volumétrico de 1L, agitador magnético e medidor de pH, 
almofariz e pistilo, gelo, pipetas de 5000 e 1000µL, tecido de náilon de malha fina, cápsula 
de porcelana, tubos eppendorf (1,5mL), centrífuga refrigerada para tubos eppendorf. 
 
2. Preparo da solução tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0): 
 
Fosfato de potássio (PM=136,09): 
136,09g _____1000 mM_____1000mL 
 X_____100 mM_____1000mL  X = 13,609 g ->450 mL 
 
Ácido Etilenodiaminotetraacético 0,1mM (EDTA - Sal disódico). 
EDTA (PM=372,24): 
372,24g_____1000mM_____1000mL 
 X_____0,1mM_____1000mL  X = 0,0372 g ->450 mL 
 
Unir as soluções, corrigir pH, completar volume para 1L 
3. Marcha de extração: 
a) Pesar 0,5 g tecido liofilizado ou 1g de tecido fresco, transferir para almofariz de 
porcelana acondicionado em bloco de gelo ou gelo moído; 
b) Macerar com nitrogênio líquido. 
c) Adicionar 5mL de Tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0) gelado, e 
homogeneizar por 10min; 
d) Filtrar o homogeneizado em tecido de náilon de malha fina, manter sempre as amostras 
a 4oC. 
e) Transferir ≅ 1mL do homogeneizado para 5 tubos eppendorf de 1,5mL e centrifugar a 
12000 x g durante 15min a 4oC; 
f) Para oleaginosas obs.: retirar sebo formado com espátula e pipetar sobrenadante e 
centrifugar novamente. 
g) Armazenar sobrenadante em freezer a -80oC dividido em 5 tubos eppendorf de 1,5mL 
para utilização nos testes de atividade enzimática. 
 
 
 
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ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA PEROXIDASE DO ASCORBATO (APX, EC 1.11.1.11) 
1. Equação da reação da APX: 
 
H2O2 + 2 ascorbato (ASC) → 2H2O + 2 monodesidroascorbato (DHAR) 
2. Reagentes: 
• Solução tampão fosfato de potássio 0,05M c/ EDTA 0,05mM (pH 6,0). 
Fosfato de potássio (PM=136,09): 
136,09g_____1000mM_____1000mL 
 X_____50mL_____1000mL  X = 6,8045 g 
 
Ácido etilenodiaminotetraacético 0,05mM (EDTA - Sal disódico, PM=372,24): 
372,24g_____1000mM______1000mL 
 X_____0,05mM______1000mL  X = 18,612 mg 
 
• Ácido ascórbico (0,015M) - Dissolver 0,2642g de ácido ascórbico em cerca de 70mL 
de água deionizada, transferir para balão volumétrico de 100mL e completar o volume. 
[Dura ≅ 2 meses] 
C6H8O6 ➔ Massa molar = 176,13g/mol m = M x PM x V 
Para 100mL (0,1L) de solução 0,015M: 
m = 0,015 x 176,13 x 0,1  m = 0,2642g C6H8O6 
 
• Peróxido de hidrogênio (0,03M) - Transferir 236L de H2O2 para balão volumétrico de 
100mL e completar o volume com água deionizada. [Dura ≅ 2 meses] 
H2O2 ➔ Massa molar = 34,0147g/mol; d = 1,4422g/mL (1442,2g/L); pureza = 30% 
1442,2g______100% 
 X______30%  X = 432,66 g H2O2 em 1L 
 
M = no de moles ou M = m (g)  M = 432,66 = 12,72M 
 V (L) PM x V (L) 34,0147 x 1 
P/ 100 mL de solução 
M1.V1 = M2.V2  12,72 x V1 = 0,03 x 100  V1 = 0,236mL ou 236L 
 
3. Marcha analítica: 
a) Adicionar 1100L (110L) de tampão fosfato de potássio 50mM c/ EDTA 50µM (pH 6,0) 
nos tubos de ensaio e, em seguida, transferi-los para banho-maria a 30oC; no caso de 
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uso de placa a encubação é realizada no próprio equipamento leitor de placa. 
b) Descongelar os extratos enzimáticos e manter em banho de gelo a 4oC; 
c) Adicionar aos tubos de ensaio, 200L (20L) do extrato enzimático (qualquer diluição 
necessária deve ser feita com o tampão de extração), 100L (10L) de H2O2 30mM e 
100L (10L) de ácido ascórbico 15mM; 
Obs.: É importante obedecer a esta ordem na preparação da mistura de reação. 
d) Disparar o cronômetro imediatamente após a adição do ácido ascórbico, agitar o tubo 
de ensaio e transferir a solução para cubeta; 
e) Fazer a leitura em espectrofotômetro UV à 290nm, no intervalo Linear (entre 15'' e 
10'15''); O intervalo linear é aquele onde o  absorbância não altera entre os intervalos. 
Obs.: Antes de iniciar as leituras, zerar o espectrofotômetro com água. 
f) De posse das leituras espectrofotométricas da amostra, proceder os cálculos da 
atividade enzimática total, expressando os resultados em mol de H2O2.min-1.g-1 de 
proteína. 
g) Utilizar para os cálculos, usar o coeficiente de extinção molar do ascorbato ( = 2,8.mM-
1.cm-1) e os resultados de proteína na amostra determinado pelo método de Bradford 
(1976). 
4. Procedimento para o cálculo da atividade total: 
[ASCORBATO] = ABS/ Ɛ L onde, ƐASC = 2,8 mM -1 cm -1, l = 1 cm ou 0,416 cm (placa) 
2 *[ASCORBATO] = [H2O2] obs: volume de extrato 200 ou 20 µL; fd = fator de diluição 
 
∆ABS[Amostra]/ tempo (s) *60 = ABS/min / 2,8 mM 
-1 cm 
-1 = [ASCORBATO] (mM min-1) / 2 = 
[H2O2] (mM min-1) * 5/1000 (ref. Volume de amostra) * 5000/200 (ref. Volume de extrato) * 1000 
* fd = Atividade da APX (µmol de H2O2 min-1) *1/1 (ref. Massa vegetal usada) = Atividade da 
APX (µmol de H2O2 min-1 g-1 de MF) / teor de proteína do extrato (mg de proteína g-1 de MF) * 1000 
= Atividade da APX (µmol de H2O2 min-1 g-1 de proteína). 
Obs.: A parte amarela pode ser feita sem necessidade da massa vegetal, válido para todas enzimas. 
Atividade da APX (µmol de H2O2 min-1) / teor de proteína do extrato (mg de proteína mL de extrato) 
* 5 (volume de extrato) * 1000 = Atividade da APX (µmol de H2O2 min-1 g-1 de proteína). 
Nakano Y, Asada K (1981) Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinash chloroplasts, 
Plant Cell Physiol 22:867-880. 
 
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ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA PEROXIDASE (G-POD, EC 1.11.1.7) 
1. Equação da reação: 
4 H2O2 + 4 guaiacol → 1 tetraguaiacol 
2. Reagentes: 
• Solução tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0). 
Fosfato de potássio (PM=136,09): 
136,09g_____1000 mM_____1000mL 
 X_____100 mM_____1000mL  X = 13,609 g 
 
Ácido Etilenodiaminotetraacético 0,1mM (EDTA - Sal disódico). 
EDTA (PM=372,24): 
372,24g_____1000mM______1000mL 
 X_____0,1mM_____1000mL  X = 37,224 mg 
 
• Guaiacol (0,02M) - Transferir 224l de guaiacol (98%) para balão volumétrico de 
100mL e completar o volume com água deionizada. [Dura ≅ 2 meses] 
Guaiacol (C7H8O2) ➔ Massa molar = 124,14g/mol; d = 1,129g/mL (1129g/L); pureza = 98% 
 
1129g/L______100% 
 X______98%  X = 1106,42g 
 
M = m (g)  M = 1106,42 = 8,9126M 
 PM x V (L) 124,14 x 1 
 
M1.V1 = M2.V2 8912,6mM x V1 = 20mM x 100mL V1 = 0,224mL ou 224L 
 
• Peróxido de hidrogênio (0,06M) - Transferir 472L de H2O2 para balão volumétrico de 
100mL e completar o volume com água deionizada. [Dura ≅ 2 meses] 
H2O2 ➔ Massa molar = 34,0147g/mol; d = 1,4422g/mL (1442,2g/L); pureza = 30% 
1442,2g_____100% 
 X______30%  X = 432,66 g H2O2 em 1L 
 
M = no de moles ou M = m (g)  M = 432,66 = 12,72M 
 V (L) PM x V (L) 34,0147 x 1 
 
M1.V1 = M2.V2 12,72M x V1 = 0,06M x 100mL V1 = 0,472mL ou 472L 
 
3. Marcha analítica: 
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a) Adicionar 950L (95L) de tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0) 
nos tubos de ensaio e, em seguida, transferi-los para banho-maria a 30oC; 
b) Descongelar os extratos enzimáticos e manter em banho de gelo a 4oC; 
c) Adicionar aos tubos de ensaio 500L (50L) de guaiacol (0,02M), 500L (50L) de H2O2(0,06M) e 50L (5L) do extrato enzimático (qualquer diluição necessária deve ser feita 
com o tampão de extração); 
Obs.: É importante obedecer a esta ordem na preparação da mistura de reação. 
d) Disparar o cronômetro imediatamente após a adição do extrato, agitar o tubo de ensaio 
e transferir a solução para cubeta; 
h) Fazer a leitura em espectrofotômetro UV à 470nm, no intervalo Linear (entre 15'' e 
10'15''); O intervalo linear é aquele onde o  absorbância não altera entre os intervalos. 
Obs.: Antes de iniciar as leituras, zerar o espectrofotômetro com água. 
g) De posse das leituras espectrofotométricas da amostra, proceder os cálculos da 
atividade enzimática total, expressando os resultados em mol de H2O2.min-1.g-1 de 
proteína. 
h) Utilizar para os cálculos, usar o coeficiente de extinção molar do tetraguaiacol ( = 
26,6.mM-1.cm-1) e os resultados de proteína na amostra determinado pelo método de 
Bradford (1976). 
 
4. Procedimento para o cálculo da atividade total: 
[TETRAGUAIACOL] = ABS/ Ɛ L onde, Ɛtetraguaiacol = 26,6 mM -1 cm -1, l = 1 cm ou 0,555 cm 
(placa) 
[TETRAGUAIACOL] = 4* [H2O2] obs: volume de extrato 50 ou 5 µL, fd = fator de diluição 
 
∆ABS[Amostra]/ tempo (s) *60 = ABS/min / 26,6 mM 
-1 cm 
-1 = [TETRAGUAIACOL] (mM min-1) 
*4 = [H2O2] (mM min-1) * 5/1000 (ref. Volume de amostra) * 5000/50 (ref. Volume de extrato) * 
1000 * fd = Atividade da G-POD (µmol de H2O2 min-1) *1/1 (ref. Massa vegetal usada) = Atividade 
da G-POD (µmol de H2O2 min-1 g-1 de MF) / teor de proteína do extrato (mg de proteína g-1 de 
MF) * 1000 = Atividade da G-POD (µmol de H2O2 min-1 g-1 de proteína). 
 
Urbanek H, Kuzniak-Gebarowska E, Herka K (1991) Elicitation of defense responses in bean leaves by Botrytis cinerea 
polygalacturonase. Acta Phys Plant 13:43–50. 
 
 
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ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CATALASE (CAT, EC 1.11.1.6) 
 
1. Equação da reação: 
2 H2O2 → 2 H2O + O2 
 
2. Reagentes: 
• Solução tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0). 
Fosfato de potássio (PM=136,09): 
136,09g_____1000 mM_____1000mL 
 X_____100 mM______1000mL  X = 13,609 g 
 
Ácido Etilenodiaminotetraacético 0,1mM (EDTA - Sal disódico). 
EDTA (PM=372,24): 
372,24g_____1000mM_____1000mL 
 X______0,1mM______1000mL  X = 37,224 mg 
 
• Peróxido de hidrogênio (0,5M) - Transferir 3,93mL (3931L) de H2O2 para balão 
volumétrico de 100mL e completar o volume com água deionizada. [Dura ≅ 3 meses] 
 
H2O2 ➔ Massa molar = 34,0147g/mol; d = 1,4422g/mL (1442,2g/L); pureza = 30% 
 
1442,2g______100% 
 X______30%  X = 432,66 g H2O2 em 1L 
 
M = no de moles ou M = m (g)  M = 432,66 = 12,72M 
 V (L) PM x V (L) 34,0147 x 1 
 
M1.V1 = M2.V2 12,72M x V1 = 0,5M x 100mL V1 = 3,93mL ou 3931L 
 
3. Marcha analítica: 
a) Adicionar 2300L (230L) de tampão fosfato de potássio 0,1M c/ EDTA 0,1mM (pH 7,0) 
nos tubos de ensaio e, em seguida, transferi-los para banho-maria a 30oC; 
b) Descongelar os extratos enzimáticos e manter em banho de gelo a 4oC; 
c) Adicionar aos tubos de ensaio 100L (10L) de H2O2 (0,5M) e 100L (10L) do extrato 
enzimático (qualquer diluição necessária deve ser feita com o tampão de extração); 
Obs.: É importante obedecer a esta ordem na preparação da mistura de reação. 
d) Disparar o cronômetro imediatamente após a adição do extrato, agitar o tubo de ensaio 
e transferir a solução para cubeta; 
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i) Fazer a leitura em espectrofotômetro UV à 240nm, no intervalo Linear (entre 15'' e 
10'15''); O intervalo linear é aquele onde o  absorbância não altera entre os intervalos. 
Obs.: Antes de iniciar as leituras, zerar o espectrofotômetro com água. 
i) De posse das leituras espectrofotométricas da amostra, proceder os cálculos da 
atividade enzimática total, expressando os resultados em mol de H2O2.min-1. g-1 de 
proteína. 
e) Utilizar para os cálculos, usar o coeficiente de extinção molar H2O2 ( = 36.M-1.cm-1), e 
os resultados de proteína na amostra determinado pelo método de Bradford (1976). 
 
5. Procedimento para o cálculo da atividade total: 
[H2O2] = ABS/ Ɛ L onde, ƐH2O2 = 36 mM -1 cm -1, l = 1 cm ou 0,694 cm (placa) 
obs: volume de extrato 100 ou 10 µL; fd = fator de diluição 
 
∆ABS[Amostra]/ tempo (s) *60 = ABS/min / 36 mM 
-1 cm 
-1 = [H2O2] (mM min-1) * 5/1000 (ref. 
Volume de amostra) * 5000/100 (ref. Volume de extrato) * 1000 * fd = Atividade da CAT (µmol 
de H2O2 min-1) *1/1 (ref. Massa vegetal usada) = Atividade da CAT (µmol de H2O2 min-1 g-1 de 
MF) / teor de proteína do extrato (mg de proteína g-1 de MF) * 1000 = Atividade da CAT (µmol 
de H2O2 min-1 g-1 de proteína). 
 
Beers RF, Sizer Jr IWA (1952) Spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by 
catalase. J Biol Chem 192:133–140. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA DISMUTASE DO SUPERÓXIDO (SOD, EC 1.15.1.1) 
 
1. Equação da reação: 
 
Riboflavina + O2 LUZ→ O2•- + NBT → Formazana (Reação sem enzima) 
2O2•- + 2H+ → H2O2 + O2 (Reação com enzima) 
 
2. Reagentes: 
• Solução tampão fosfato de potássio 0,05M (pH 7,8) c/ EDTA 0,1mM e metionina 
(19,5mM). [Dura ≅ 2 meses] 
Fosfato de potássio (PM=136,09): 
136,09g_____1000 mM_____1000mL 
 X______50 mM______1000mL  X = 6,8045 g 
 
Ácido Etilenodiaminotetraacético 0,1mM (EDTA - Sal disódico). 
EDTA (PM=372,24): 
372,24g_____1000mM______1000mL 
 X______0,1mM_____1000mL  X = 37,224 mg 
 
Metionina 19,5mM (PM=149,21) 
149,21g_____1000mM_____1000mL 
 X_____19,5mM_____1000mL  X = 2,909 g 
 
• Nitro Blue Tetrazolium 750µM (NBT) [Dura ≅ 2 meses e é sensível a luz] 
NBT (PM=817,65): 
817,65g_____1000mM_____1000mL 
 X_____0,75mM______50mL  X = 0,0307 g 
 
• Riboflavina 10µM (PM=376,37) - Transferir 0,5mL (500L) da solução estoque a 1mM 
para balão volumétrico de 50mL e completar o volume com água deionizada. [Dura ≅ 
2 meses e é sensível a luz] 
Solução estoque a 1mM 
376,37g_____1000mM______1000mL 
 X_____1mM______50mL  X = 1,8818 mg 
 
M1.V1 = M2.V2  1mM x V1 = 0,01mM x 50mL V1 = 0,5mL ou 500L 
 
3. Marcha analítica: 
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a) Adicionar 950L (95L) de tampão fosfato de potássio fosfato de potássio 0,05M (pH 
7,8) c/ EDTA 0,1mM e metionina (19,5mM) nos tubos de ensaio; 
Obs.: O ambiente deve ser escuro ou com pouca iluminação (luz difusa). 
b) Descongelar os extratos enzimáticos e manter em banho de gelo a 4oC; 
c) Em seguida, adicionar 150L (15L) de NBT 750µM, 300L (30L) de riboflavina 10µM 
Adicionar aos tubos de ensaio 100L (10L) do extrato enzimático (pode ser necessário 
diluir 5 vezes com tampão de extração); 
d) Transferir os tubos de ensaio para a câmara escura com lâmpadas fluorescente de 20W; 
e) Ligar as lâmpadas, disparar imediatamente o cronômetro e desligar após 15min; 
e) Fazer a leitura em espectrofotômetro à 560nm, tendo como “branco” um tubo de ensaio 
contendo o tampão de reação, o tampão de extração (tampão fosfato), NBT e 
riboflavina; Branco claro é o branco sob banho de luz e branco escuro é o branco 
protegido da luz. 
f) De posse das leituras espectrofotométricas da amostra, proceder os cálculos da 
atividade enzimática total, expressando os resultados em unidades de atividade (U) g-1 
proteína. 
 
5. Procedimento para o cálculo da atividade total: 
 
fd = fator de diluição; U = Unidade de atividade 
 
(ABS[Amostra] – ABS[Branco escuro]) / (ABS[Branco claro] – ABS[Branco escuro]) * 100 = % de inibição / 50 = 
U * 5000/100 (ref. Volumede extrato) * fd *1/1 (ref. Massa vegetal usada) / teor de proteína do 
extrato (mg de proteína g-1 de MF) * 1000 = U g-1 proteína. 
 
Giannopolitis CN, Ries SK (1977) Superoxide dismutases. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol 59: 309-314.