Técnicas Imunológicas - Importância e Parâmetros

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Kaiany Geller - ATM 2027.2
Técnicas Imunológicas: Importância e Parâmetros
Pode-se identificar o
anticorpo ou
antígeno.
Antígeno - pedaços
do microorganismo;
Padrão-ouro de
diagnóstico -
ESPECIFICIDADE;
PCR: identifica partes menores do antígeno.
Relação anticorpo - antígeno
Reação reversível;
Por ligações não-covalentes: pontes de H,
ligações iônicas, interações hidrofóbicas e de Van
der Waals.
Epítopos: locais de ligação Ag-Ac,
presentes na superfície do antígeno.
AFINIDADE: Força de interação
entre um único sítio de ligação
Ac-Ag;
AVIDEZ: Força das interações totais
entre Ac e Ag.
• Soma das afinidades de
todos epítopos envolvidos.
REAÇÃO CRUZADA: Dois antígenos diferentes
apresentam um epítopo idêntico;
• Anticorpos específicos para um epítopo se
ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas
similares.
Pode ocorrer quando liga-se à células
normais do corpo;
Característica da febre reumática.
Exemplo de
reatividade cruzada.
ESPECIFICIDADE: refere-se a especificidade dos sítios
combinatórios de um Ac. Quando o Ac reage
apenas com o Ag A, e não com o B, diz-se que ele é
específico.
anticorpos
IgA: presentes em secreções;
No colostro - proteção
do recém nascido. Bebês que
não recebem possuem
predisposição a desenvolver
alergias a alimentos;
IgG: presente no sangue;
Células da memória - doenças crônicas ou
já desenvolvidas antes.
Especificidade;
IgM: presente na superfície do linfócito B.
Não é muito específico;
IgE: alergias
IgD: função desconhecida;
Anticorpo antigo.
Importância dos testes sorológicos
• Elucidação de processos patológicos quando com
sintomas e sinais clínicos confundíveis.
• Diferenciação da fase da doença (IgM/IgG).
IgG materno: passa para o feto no 2º
trimestre de gestação;
IgG recém-nascido: inicia a produção no 3º
trimestre de gestação. Se continuar a aumentar,
significa que houve a infecção.
• Diagnóstico de doença congênita.
• Seleção de doadores de sangue.
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Triagem Laboratorial
- Tipagem sanguínea (grupo ABO e Rh);
- Testes de sífilis, doença de chagas, vírus HIV,
vírus HTLV I e II, vírus da hepatite B;
- Detecção de anticorpo para Hepatite C;
- Eletroforese para detectar Hb anormais.
HTLV I e II: vírus linfotrópico humano. Retrovírus que
causa paraparesia espástica tropical - deficiência
neurológica (desmielinização);
Transmitido por relação sexual, transfusão de sangue
e amamentação.
Linfomas de células T de adultos: forma
congênita
• Seleção de doadores e receptores de órgãos para
transplantes (HLA).
• Avaliação do prognóstico da doença (hepatite B).
• Avaliação da eficácia do tratamento (Sífilis).
• Avaliação da imunidade naturalmente ou
artificialmente adquirida (vacinas).
• Agravamento da patologia (Imunocomplexos).
Importância da Pesquisa de Anticorpos em inquéritos
soroepidemiológicos:
• Prevalência da doença.
• Erradicação da doença.
• Reintrodução de novos casos em áreas
consolidadas.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Fatores que interferem no diagnóstico
sorológico:
Resposta imune do hospedeiro
• Reação cruzada, resposta imune exacerbada ou
ausência de resposta imunológica;
Variações antigênicas do patógeno
• Ciclo biológico variante; formas do parasito/ vírus
mudam.
Teste ideal: caracteriza a presença ou ausência da
doença - “Gold Standard Test”;
Parâmetros sorológicos: rigorosamente analisados
para que a definição do processo infeccioso seja
mais próxima do verdadeiro estado clínico do
paciente.
Amostragem: indivíduos doentes e não
doentes.
VALIDADE INTRÍNSECA: É o desempenho do teste
quando comparado a um teste de referência.
É uma característica do teste, não da
população em estudo e fornece resultados
consistentes independente da prevalência da
doença.
Sensibilidade (porcentagem de pacientes com
determinada condição/doença para os quais, se o
teste é utilizado, se obtém resultados positivos). No
gráfico é a medida LR1.
Utilizado em bancos de sangue.
Verdadeiros positivos (VP).
Especificidade (porcentagem dos indivíduos que
não tem a condição/doença e ao utilizar-se o teste
apresenta resultados negativos).
Utilizado em laboratórios clínicos.
Verdadeiros Negativos (VN)
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LIMIAR DE REATIVIDADE
É a região de corte do teste sorológico; é
um valor acima do qual os resultados são
considerados + (DOENTES) e abaixo do qual os
resultados são considerados – (NÃO DOENTES).
Para a MÁXIMA SENSIBILIDADE o cut off seria no nº 20
do gráfico.
Aumentou o número de resultados FALSO
POSITIVOS e reduz os FALSOS NEGATIVOS.
Para a MÁXIMA ESPECIFICIDADE, o cut off seria no nº
80.
Aumentou o número de resultados FALSO
NEGATIVOS e reduz o de FALSO POSITIVOS.
VALIDADE EXTRÍNSECA: capacidade do teste em
detectar a real situação da população em relação
à doença que está sendo estudada. Também avalia
o desempenho do teste em uma dada população.
Precisão (determina a existência de concordância
dos resultados obtidos quando um mesmo teste é
feito várias vezes.
Mede o erro acidental do método, que
corresponde ao erro experimental acumulado (erro
aleatório).
Exatidão/ Acurácia (determina a capacidade do
teste em fornecer resultados muito próximos ao
verdadeiro valor do que se está medindo).
Mede o erro sistemático ou a tendência dos
resultados de se desviarem em uma dada direção e
proporção em relação ao valor real.
VP + VN / N
Reprodutibilidade (obtenção de resultados iguais em
testes realizados com a mesma amostra de material
biológico, quando feitos por pessoas diferentes em
locais variados e se garante quando a precisão e a
exatidão são sempre avaliadas).
É influenciada por diversos fatores que
variam desde a qualidade dos reagentes às
condições técnicas e operacionais dos laboratórios.
TIPOS DE REAÇÕES IMUNOLÓGICAS
REAGENTES NÃO MARCADOS: reação de
precipitação e de aglutinação.
Detectam/ quantificam as conseqüências
da ligação Ag –Ac;
Reação de Aglutinação: Células ou partículas
insolúveis + Ac.
Aglutinação Direta: Bactérias (Brucelose);
Hemácias (Sistema ABO); Hemácias (Vírus) não
sorológica;
Quando o
antígeno é insolúvel.
Aglutinação Indireta/
passiva: antígenos
solúveis necessitam
ser associados a
outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de
hemácias).
Ex: Monoteste, Reação de Paul Bunnel, Teste de
gravidez
Reação de
Precipitação: a
interação de
anticorpo -
antígeno
solúvel forma
uma rede que
pode se
precipitar.
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Ex.: proteína C reativa, fator reumatóide,
anti-estreptolisina O.
REAGENTES MARCADOS: Detectam / quantificam
diretamente a ligação Ag -Ac.
ELISA - Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima.
Anticorpos marcados com enzimas + AG + substrato = cor
▪Teste de alta sensibilidade.
▪ Permite quantificar Ag ou Ac das amostras.
▪ Seguros e de baixo custo.
INDIRETO - anticorpo
DIRETO - antígeno
Imunofluorescência - utiliza anticorpos marcados
com substância fluorescente para gerar o sinal da
reação antígeno-anticorpo.
DIRETA
INDIRETA
Imunohistoquímica - Baseia-se na conjugação de
distintos marcadores, com moléculas de
imunoglobulina, que com auxílio de um substrato
específico localiza o antígeno tecidual.
Combina Anatomia Patológica, Imunologia e
Bioquímica.
TÉCNICAS SOROLÓGICAS EMPREGADAS NA AUTOMAÇÃO
RADIOIMUNOENSAIO
• Um dos métodos mais sensíveis para a análise
quantitativa das reações Ag-Ac (ng-pg).
• Baixo custo, a vida média dos reagentes e o risco
operacional.
• A quantidade de reagente (Ag ou Ac) marcado
com radioisótopo quantifica o Ag ou Ac não
marcado na amostra.
• Radioisótopos: Iodo 125 ou Iodo 131
A medida da resposta é feita por contagem
radioativa.
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ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA
• Obtenção de energia luminosa através de uma
reação química – radical luminol.
• Sistema pode ser utilizado como sistema de
monitorização e amplificação de testes como
enzimaimunoensaio.
WESTERN BLOTTING
Determinação de proteínas específicas
reconhecidas por Acs sobre papel de nitrocelulose
ou nylon após transferência do gel de eletroforese.
• Eletroforese de proteínas
• Diferença de tamanho(PM)
• Mobilidade da proteína
• Detecção Ag ou Ac
HIV: • Positivo: 2 bandas gp ENV + uma banda Core
ou pol.
• Indeterminado:1 banda.
• Negativo: nenhuma banda.
Immuno-dot, Dot-ELISA
•
Utiliza membrana de nitrocelulose Amostras
aplicadas como gotas
PESQUISA DE ANTÍGENO - direto
PESQUISA DE ANTICORPOS - indireta
CITOMETRIA DE FLUXO
➢ Separação de células ativadas por fluorescência.
➢ Anticorpos contra moléculas de membrana ou
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD).
➢ Cada Ac é marcado com um fluorocromo
diferente.
➢ Teste qualitativo e quantitativo.