relatório 6 (p15 e p16) (1)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA PROFESSOR: ADRIANO GONÇALVES VIANA
CURSO: Bacharelado em Ciências Biológicas TURMA: B
DATA: 26/06/2023 e 03/07/2023
Equipe
1 Camila Coelho
2 Isabelle Troitiño
3 Maryele Klipan
4 Letícia Havrechaki
5 Priscila Sulviki
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
EXPERIMENTO 16 e 17: HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DO AMIDO
Durante o processo de digestão no organismo humano, o amido sofre três processos de
degradação, o primeiro ocorre no aparelho bucal, pela ação da α-amilase salivar, o segundo ocorre
no estômago por ação do ácido clorídrico presente no suco gástrico, e a terceira degradação
acontece no intestino delgado, com a ação da α-amilase pancreática.
Nos experimentos realizados, o objetivo foi reproduzir in vitro o processo de degradação
estomacal e oral pelas hidrólises ácidas e enzimáticas do amido.
PARTE I: HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO
Procedimento experimental
Foi adicionado 0,2 mL de HCl concentrado a 5 mL de amido em solução, e posteriormente
essa solução de amido + HCl foi incubadas a 100ºC, então, ao longo de 30 minutos, observou-se o
processo de degradação do amido pela retirada de duas alíquotas de 0,2 mL nas marcações de
tempo 0’,5’,10’,20’ e 30’. A cada duas alíquotas retiradas ao mesmo tempo, foram utilizadas as
metodologias do teste de DNS, e do lugol para cada uma.
O lugol caracteriza as interações do iodo com o polissacarídeo, então conforme ocorre a
hidrólise do amido, o amido é quebrado em seus monossacarídeos de glucose e quanto mais
degradado o amido estiver, menos interação ele terá com o iodo do lugol, ou seja quanto mais
degradado estiver o amido, menos coloração aparentará com o teste do lugol. O DNS a ser utilizado
na outra amostra de solução de 0,2mL da mesma alíquota irá dosar a quantidade de
monossacarídeos (glucose) remanescentes da hidrólise no tempo determinado.
Foram montados tubos de ensaio como indica a tabela abaixo.
Identificação
dos tubos
Tempo (em
minutos)
Solução de
amido (mL) H2O (mL) DNS (mL) Lugol (gotas)
D0 0' 0,2 1,3 1,0 -
D5 5' 0,2 1,3 1,0 -
D10 10' 0,2 1,3 1,0 -
D20 20' 0,2 1,3 1,0 -
D30 30' 0,2 1,3 1,0 -
L0 0' 0,2 10 - 3
L5 5' 0,2 10 - 3
L10 10' 0,2 10 - 3
L20 20' 0,2 10 - 3
L30 30' 0,2 10 - 3
Tabela 1: Reagentes das soluções preparadas para cada tubo de ensaio.
Em relação aos experimentos com o lugol, pode-se observar a diminuição da tonalidade da
solução em ordem crescente de tempo de incubação do amido. Isso acontece por que, como
mencionado anteriormente, o lugol interage com o polissacarídeo, e o amido da amostra incubada
sofreu hidrólise gradualmente com o tempo percorrido, restando seus monossacarídeos que não
interagem com o lugol.
Imagem 1:Tubos L0, L5, L10, L20 e L30 respectivamente (conferir “Tabela 1”).
Agora, em relação ao DNS, pode-se observar aumento da tonalidade da coloração em ordem
crescente do tempo de incubação da amostra de amido, pois voltando ao raciocínio anterior, o amido
hidrolisado se transforma em moléculas de glicose que interagem com o DNS, então quanto maior a
concentração de glicose, mais forte será a coloração dada pelo DNS.
Imagem 2:Tubos D0, D5, D10, D20 e D30 respectivamente (conferir “Tabela 1”).
E por fim, com as amostras contendo DNS foi possível quantificar a quantidade de glicose através do
espectrofotômetro a 540 nm, obtendo os seguintes resultados:
Gráfico 1: relação entre a absorbância e a solução de amido hidrolisado em frações de tempo (consultar “Tabela
1” para mais informações).
PARTE II: HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO
Procedimento experimental
A primeira etapa constituiu na obtenção da enzima α-amilase salivar que foi coletada a partir
da saliva dos membros da equipe, formando um “pool” de amostras em um béquer. Foi transferido
1mL da amostra da saliva em um tubo de ensaio (tubo 1) e em seguida adicionados 9 mL de solução
salina (NaCl 0,9%) ao mesmo para então homogeneizar a solução. Após obter a solução enzimática
(tubo 1), retira-se 0,2 mL da mesma e adiciona em um outro tubo de ensaio (tubo 2) contendo 5 mL
de amido em solução, então ocorre a homogeneização e depois essa solução (tubo 2) é levada ao
banho maria a 37º por 30 minutos, retirando duas amostras de 0,2 mL dessa solução nas alíquotas
de tempo 0’, 5’, 10’, 20’ e 30’. E, como no experimento anterior, a cada duas alíquotas retiradas ao
mesmo tempo, utilizou-se DNS, e Lugol para cada uma.
Foram preparados os seguintes tubos de ensaio a partir da amostra do tubo 1:
Identificação
dos tubos
Tempo (em
minutos)
Amostra de
amido + solução
enzimática (mL) H20 (mL) DNS (mL) Lugol (gotas)
D1 0' 0,2 1,3 1 -
D2 5' 0,2 1,3 1 -
D3 10' 0,2 1,3 1 -
D4 20' 0,2 1,3 1 -
D5 30' 0,2 1,3 1 -
L1 0' 0,2 10 - 3
L2 5' 0,2 10 - 3
L3 10' 0,2 10 - 3
L4 20' 0,2 10 - 3
L5 30' 0,2 10 - 3
Tabela 2: Reagentes das soluções preparadas para cada tubo de ensaio.
Para os testes com lugol, foram observados os resultados visíveis na imagem abaixo.
Imagem 3:Tubos L0, L5, L10, L20 e L30 respectivamente (conferir “Tabela 2”).
Nota-se que a partir do minuto 5 as enzimas α-amilase já haviam hidrolisado grande parte do amido
da amostra, visto que o lugol só torna nítida a coloração da solução com maior teor do
polissacarídeo.
Após preparar os tubos contendo DNS, todos esses foram levados para banho em 100°C por
5 minutos, logo após foi adicionado 7,5mL de H2O e finalmente levadas as amostras para o
espectrofotômetro a 540 nm, julgando os resultados através deste gráfico:
Gráfico 2: relação entre a absorbância e a solução de amido hidrolisado em frações de tempo (consultar “Tabela
2” para mais informações).
COMPARATIVO
Foram observados resultados de dois agentes diferentes que promovem a hidrólise do
amido, o ácido e o enzimático. Dessa forma foi possível comparar os resultados com auxílio do
gráfico abaixo.
O ácido clorídrico tem capacidade de hidrolisar qualquer ligação glicosídica e a enzima
α-amilase consegue quebrar apenas as ligações α-1,4.
Sabendo que o amido é formado pela amilose de ligações glicosídicas α-1,4, formando uma
cadeia linear; e também pela amilopectina, com ligações α-1,4 e α-1,6, de estrutura ramificada,
pode-se concluir que o HCl é mais eficiente para a degradação total do amido.
Referência bibliográfica: LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª
Edição, 2014. Ed. Artmed.