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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
Curso
Diagnóstico de Tuberculose -
Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2
Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
Expediente
Produzido por
Núcleo de Doenças Infecciosas da 
Universidade Federal do Espírito Santo 
(NDI/UFES) - Vitória / ES
Equipe responsável
Moisés Palaci
Solange Alves Vinhas
Eunice Atsuko Totumi Cunha
Luiz Guilherme Schmidt Castellani
Rosalia Maia
Adaptação pedagógica
Lucy Maria Bez Birolo Parucker
Helena Cristina Franz
Darcita Buerger Rovaris
Breno Biagotti
Artemir Coelho de Brito 
Nicole Menezes de Souza
Diagramação
Bruna Goddini de O. Ferreira
Apoio
OPAS/OMS - Organização Pan-Americana 
da Saúde
Sumário
Preparo do meio de Ogawa-Kudoh 4
1. Preparo dos materiais 4
2. Preparo da base 5
3. Preparo do verde malaquita 5
4. Preparo de Ácido Para-Nitrobenzóico - PNB 7
5. Preparo de Hidrazida do
ÁcidoTiofeno-2-Carboxílico - TCH 7
6. Lavagem e assepsia dos ovos 8
7. Preparo do meio completo – com e sem PNB-TCH 8
9. Coagulação do meio 9
10. Referências 10
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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
Preparo do meio de Ogawa-Kudoh
O meio de Ogawa-Kudoh é um meio de cultura de alta qualidade, à 
base de ovos e de grande praticidade para a rotina dos laboratórios de 
micobacteriologia, utilizado para isolamento e identificação de micobactérias, 
e para a detecção de resistência aos antimicrobianos utilizados nos esquemas 
de tratamento da tuberculose. 
1. Preparo dos materiais
A produção do meio de cultura de Ogawa-Kudoh, requer os seguintes 
itens: 
• Fosfato monopotássico (KH
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PO
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) 
• Citrato de magnésio 
• Glutamato de sódio 
• Glicerol 
• Verde-malaquita 
• Água destilada 
• Água destilada estéril 
• Solução de Extran neutro 
• Ovos frescos de galinha
• Etanol 77% 
• Frascos de volume apropriado para preparo dos meios 
• Frascos de volume apropriado para distribuição dos meios 
• Frascos de volume apropriado para fazer o homogeneizado de ovos 
• Becker estéril de 200 mL
• Batedeira com pás estéreis ou bastão de vidro grosso estéril 
• Bastão de vidro grosso 
• Bucha para lavar os ovos
• Panos estéreis 
• Funil com gaze estéril
• Gaze 
• Proveta estéril 
• Distribuidor de meio ou pipetador automático 
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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
• Pipetas sorológicas estéreis de 10 e 25 mL
• Capela de Segurança Biológica (opcional) 
• Autoclave 
• Balança analítica 
• Sorocoagulador 
• Estufa a 37°C 
• Geladeira 
 
A esterilização é uma etapa fundamental na produção dos meios de 
cultura e deve ser submetida a rigoroso controle de qualidade. Para tanto, o 
bom funcionamento da autoclave é condição indispensável para o sucesso da 
produção do meio de cultura. 
As superfícies de trabalho, incluindo a Cabine de Segurança Biológica 
devem ser cuidadosamente limpas e desinfetadas antes de iniciar o 
procedimento. Todo material deve ser exclusivo para a produção do meio de 
cultura e, por uma questão de organização, deve ser lavado e esterilizado com 
24h de antecedência.
2. Preparo da base
A seguir, se apresenta a sequência para a organização do preparo da base 
do Ogawa-Kudoh. 
3. Preparo do verde malaquita
Inicia-se o preparo da base pela solução de verde malaquita 2%, que deve 
ser preparado no dia em que será utilizado. 
É necessário pesar o verde malaquita de acordo com o volume a ser 
utilizado pelo laboratório. Dissolva o verde malaquita em pó já pesado em 
água deionizada, com agitação e em placa aquecedora, tomando cuidado para 
não superaquecer a solução. 
Esta solução deve ser deixada sob agitação constante para garantir que todo 
o corante seja dissolvido. Este passo é de extrema importância, pois cristais 
de verde malaquita podem prejudicar o crescimento das micobactérias, no 
meio de cultura. Para garantir que não haja cristais de verde malaquita nesta 
solução, filtre-a com gaze. 
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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
Transfira para um frasco identificado e deixe aguardando o momento de 
ser adicionado ao meio. 
Pese todos os reagentes necessários para a produção da base e dissolva 
em água destilada aquecida, sob agitação, na ordem do Quadro 1 e de acordo 
com o volume desejado. Acrescente um por vez, aguardando a sua dissolução. 
Ainda no agitador, acrescente o glicerol e em seguida o verde malaquita já 
preparado. Após a dissolução dos reagentes, transfira a base para um frasco 
autoclavável de volume 3 vezes maior do que o volume da base. 
Autoclavar a 127°C por 15 minutos. 
O volume da base a ser produzida vai depender da demanda da instituição, 
respeitando o número de amostras a serem processadas, semanalmente ou 
mensalmente. 
Todas as soluções não autoclaváveis , como PNB, TCH e outros antibióticos 
devem ser preparadas assepticamente dentro de uma cabine de segurança 
biológica de classe I ou II. 
A seguir, o Quadro 1 apresenta os reagentes e as medidas a serem utilizadas 
no preparo da base do Ogawa-Kudoh.
Quadro 1: Reagentes e medidas utilizadas no preparo da base do Ogawa-Kudoh
REAGENTES MEDIDAS
VOLUME DA BASE 300 mL 600 mL 1500 mL
Fosfato 
monopotássico
6,0 g 12,0 g 30,0 g 
Citrato de magnésio¹ 0,3 g 0,6 g 1,5 g 
Glutamato de sódio 1,5 g 3,0 g 7,5 g 
Glicerol² 12,0 mL 24,0 mL 60,0 mL
Água deionizada 300 mL 600 mL 1500 mL
¹ Citrato de magnésio não é essencial para a detecção, mas 
melhora a viabilidade das micobactérias. 
² Não se deve adicionar glicerol para o cultivo de Mycobacterium 
bovis ou outros organismos que não toleram o glicerol. 
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4. Preparo de Ácido Para-Nitrobenzóico - PNB
Nesse preparo, o PNB deve ser dissolvido em hidróxido de sódio 1N 
(normal) adicionando 3 gotas de solução de fenolftaleína a 0,1% e gotejando 
a solução de HCl 1N até que a coloração vermelha se torne amarelo claro. 
Complete o volume da solução até 100 mL. Esta solução deve ser aliquotada e 
armazenada em freezer a menos 70°C. A seguir, estão descritos os reagentes 
e seus respectivos quantitativos.
Quadro 2. Reagentes e medidas a serem utilizadas no preparo de PNB
 REAGENTES QUANTIDADES
PNB 2,5 g
Solução de NaOH 4% 15 mL
Solução de fenoftaleína 0,1% 3 gotas
Solução de HCl 1N Gotas
Água deionizada estéril q.s.p. 100 mL
5. Preparo de Hidrazida do Ácido Tiofeno-2-Carboxílico 
- TCH 
Em relação ao preparo da Hidrazida do Ácido Tiofeno-2-Carboxílico (TCH), 
dissolva a quantidade necessária de TCH em água deionizada estéril. Esta 
solução deve ser aliquotada e armazenada em freezer a menos 70°C.
Solução de uso: No momento do preparo do meio de cultura, 1 mL da 
solução de estoque de TCH é diluído em 9 mL de água destilada estéril.
A seguir, no Quadro 3 se apresenta os reagentes e o quantitativo a ser 
utilizado no preparo do TCH. 
Quadro 3. Reagentes e medidas utilizadas no preparo do TCH. 
Reagentes Quantidades
TCH 0,1 g
Água deionizada estéril q.s.p. 10,0 mL
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Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
6. Lavagem e assepsia dos ovos
 Um cuidado especial deve-se ter com os ovos para o preparo do meio 
de Ogawa-Kudoh. Os ovos para a produção do meio de cultura devem ser 
de galinhas não alimentadas com antibióticos, recém-colhidos, ou seja, com 
menos de 7 dias. Estes ovos devem ser lavados no dia anterior, sendo que a 
lavagem deve ser feita com detergente neutro e uma bucha de uso exclusivo 
para este fim.
Na lavagem deve ser observado se a casca de cada ovo está porosa 
ou rachada. Os que estiverem assim, devem ser descartados. Depois de 
enxaguados os ovos deverão ser secos.
No dia seguinte ou no momento em que os ovos serão utilizados, deve se 
fazer antissepsia em álcool 92,8° INPM por 15 minutos,com volume suficiente 
para cobrir todos os ovos.
A quantidade de ovos necessária é calculada levando-se em conta o 
volume de cada ovo que é de aproximadamente 40 a 50 mL. Ressalta-se a 
importância de lavar e fazer a antissepsia de alguns ovos extras para suprir 
possíveis perdas. Por exemplo, para fazer 200 mL de base, serão necessários 
400 mL de homogeneizado de ovos, que correspondem a aproximadamente 
10 ovos. Acrescentando 10% do total de ovos para suprir as perdas, será feita 
a antissepsia de 10 ovos. 
 Uma vez que poderá ser reutilizado em até 3 vezes, após a antissepsia dos 
ovos, retorne todo o volume do álcool para seus frascos de origem.
7. Preparo do meio completo – com e sem PNB-TCH 
Retire os ovos do álcool e coloque-os para secar sobre um tecido, papel 
absorvente ou TNT (tecido não tecido de polipropileno) estéreis. Depois de 
secos, os ovos são quebrados um a um e colocados num becker pequeno para 
avaliar sua qualidade. A medida em que vão sendo quebrados, transfira os 
ovos para um recipiente maior estéril, onde serão homogeneizados utilizando 
bastões de vidro estéreis ou na batedeira, com batedores estéreis em baixa 
velocidade. Filtre o material homogeneizado em funil com gaze. Misture o 
filtrado do homogeneizado de ovos na base, de forma gradual, misturando 
sempre até atingir uma cor homogênea. 
 Este é o chamado “meio completo” utilizado para isolamento e identificação 
de micobacterias. Para isso, separamos a base produzida inicialmente em 3 
frascos: 
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Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
Frasco Controle 
Faça aliquotas de 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente 
200 mL de homogeneizado de ovos filtrados e misture bem. 
Frasco com PNB 
Faça aliquotas de 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente 
3 mL da solução Estoque de PNB, homogeneize bem. Acrescente 200 mL de 
homogeneizado de ovos filtrados e misture bem. 
 
Frasco com TCH 
Aliquote 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente 0,75 
mL da solução de Uso de TCH, homogenize bem. Acrescente 200 mL de 
homogeneizado de ovos filtrados e misture bem. 
 Após essa separação, os meios completos estão prontos para distribuição 
nos respectivos frascos. 
 
8. Distribuição do meio
Utilizando o distribuidor automático que estará ajustado para o volume 
correspondente a cada frasco, adicione o meio nos frascos esterilizados, 
tomando todos os cuidados para manter a esterilidade dos meios e dos 
procedimentos executados.
9. Coagulação do meio
Por fim, os frascos deverão ser incubados no sorocoagulador a 85°C por 50 
minutos com a tampa aberta um quarto de volta. Um cuidado especial deve-se 
ter com a temperatura, que não pode ser excessiva ou o tempo de exposição 
ser prolongado, porque diminui a qualidade dos meios de cultura
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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh
10. Referências
1. Costa, R.R. et al. Comparação entre os métodos de Ogawa-Kudoh 
e Petroff modificado para o cultivo de micobactérias no diagnóstico da 
tuberculose pulmonar. v. 16, n. 2, p. 1-5. São Paulo: Einstein, 2018.
2. Pedro, H.S.P. et al. Avaliação do desempenho dos meios de cultura 
Ogawa-Kudoh e MGITTM para isolamento de micobactérias. BEPA, Bol. 
epidemiol. paul. (Online). São Paulo, v. 8, n. 91, jul. 2011. Disponível em 
http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-
42722011000700002&lng=pt&nrm=iso. Acesso em 10 ago. 2020.
3. Costa, R.R.; Silva, M.R.; Gonçalves, I.C. Diagnóstico laboratorial da 
tuberculose: Revisão de literatura. Rev Med Minas Gerais 2018; 28 (Supl 5): 
e-S280525.
	Preparo do meio de Ogawa-Kudoh
	1. Preparo dos materiais
	2. Preparo da base
	3. Preparo do verde malaquita
	4. Preparo de Ácido Para-Nitrobenzóico - PNB
	5. Preparo de Hidrazida do Ácido Tiofeno-2-Carboxílico - TCH 
	6. Lavagem e assepsia dos ovos
	7. Preparo do meio completo – com e sem PNB-TCH 
	9. Coagulação do meio
	10. Referências