AULA 3 IMUNIDADE INATA_ SISTEMA COMPLEMENTO

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IMUNOLOGIA P1 
AULA 3 – IMUNIDADE INATA: SISTEMA COMPLEMENTO
O QUE É? 
· Um conjunto de proteínas termolábeis (substância que é destruída ou perde suas propriedades em T altas) presente no soro e faz parte da imunidade inata;
· Complementam a ação dos anticorpos (os Acs neutralizam os Ags, mas não matam. Quem causa a lise são as ptns do sistema complemento);
· São produzidas pelos hepatócitos, monócitos, macrófagos teciduais e cél epiteliais dos tratos gastrointestinal e genituitário. 
A maioria das ptn do complemento circula no soro na forma inativa como pró-enzimas/zimógenos, os quais são ativados pela clivagem proteolítica, ou pela interação com uma molécula que modifique sua estrutura, que remove o fragmento inibidor, expondo o sítio ativo da molécula.
A clivagem expõe uma ligação tioéster ativa.
Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de maneira seletiva, resultando na degradação de ptns. 
A ativação proteolítica é feita via cascata. Uma protease inativa (zimógeno, em roxo) é ativada (pela clivagem ou pela interação molecular que modifica sua estrutura). A partir de sua ativação, cliva outra ptn (rosada), que, por sua vez, é ativada e cliva outra proteína (verde). Essa ptn atua em outro componente da via de modo a amplificar o sinal e gerar produtos que vão atuar no sistema.
NOMENCLATURA: 
C1 a C9 ou pelas letras B ou D. Durante a cascata proteolítica, são formados fragmentos peptídicos, que são representados por a ou b. 
1-9 não tem a ver com a cascata, então pode uma ptn C8 pode começar uma cascata por exemplo.
Na figura, uma ptn C4 inativa, ao ser clivada por um componente chamado C1s, são gerados dois fragmentos, um menor, com a letra a, e outro maior, com a letra b. Geralmente o fragmento b é sempre o menor, mas não é válido como regra. 
O fragmento maior expõe uma ligação tioéster (S-C=O) ativa.
Ao expor essa ligação tioéster, o fragmento precisa, rapidamente, se ligar à superfície celular (por meio de ptns ou CHOs). Se isso não acontecer, o fragmento reage rapidamente com a água, tornando-o inativo irreversivelmente. 
ATIVAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO: 
Pode ser ativado por três vias:
Embora se iniciem de formas diferentes, as vias lectina, clássica e alternativa têm o mesmo objetivo, formar uma enzima chamada C3 convertase. A partir dessa enzima, a C3 será clivada, gerando C3b, que tem diferentes efeitos dentro da resposta imune, como formar a C5 convertase, levar a uma resposta inflamatória, opsonizar um microrganismo, levar à formação de poros na membrana (de células ou patógenos, facilitando a fagocitose – acontece por meio da C5 convertase, que foi originada pela C3b) e se ligar a regiões Fc de imunocomplexos. 
Via Lectina
Se inicia a partir de moléculas chamadas colectinas, que reconhecem açúcares na superfície de patógenos. 
Um exemplo de colectina é a ptn MBL (lectina ligante de manose), que reconhece domínios de manose e fucose, que são expostos na superfície da maioria dos microrganismos. 
A MBL é composta por hélices de colágeno e domínios globulares de lectina que reconhecem CHOs. Está associada a duas outras proteases (MASP-1 e MASP-2) que são ativadas quando a MBL faz o reconhecimento dos domínios de manose.
As bolinhas azuis representam os domínios de manose
Outro exemplo de lectina são as ficolinas, semelhantes à MBL em estrutura, mas possuem diferentes domínios de ligação para CHOs. 
As ficolinas são compostas por hélices de colágeno e domínios de fibronectina que reconhecem domínios de açúcares acilados (n-acetilglicosamina, n-acetilgalactosamina), presentes na superfície de patógenos. Também se associam à MASP-1 e MASP- 2. Essa última tem atividade catalítica.
Ativação do sist. complem. pela via Lectina
A ilustração acima mostra a ativação do sistema complemento via lectina, que acontece quando MBL ou ficolina reconhece açúcares na superfície de algum patógeno, ativam a protease MASP-2, que cliva um C4 da via, transformando-o em C4a (menor) e C4b (maior). C4b expõe uma ligação tioéster ativa e se liga rapidamente à superfície celular do patógeno (se não ele é hidrolisado e inativado permanentemente). Ao se ligar à superfície, C4b torna-se alvo de C2 e se ligam. MASP- 2, então, cliva C4bC2, transformando-os em C2a (maior) e C2b (menor). Daí, há a união dos dois fragmentos maiores, C4b e C2a, que resulta na C3 convertase (C4bC2a), uma enzima que cliva o próximo componente mais abundante da via, o C3, em C3a e C3b (maior). 
Uma C3 convertase é capaz de clivar até 1000 moléculas de C3, então várias C3a e C3b são geradas nesse processo. 
Os fragmentos C3b, assim como o C4b, expõem uma ligação tioéster ativa, então precisam ou se ligar à superfície do patógeno o mais rápido possível para não sofrer hidrólise ou se ligarem à C3 convertase. Quando se ligam à C3 convertase, formam a C4bC2aC3b (C5 convertase).
A C5 convertase vai clivar o próximo componente da via, o C5, em C5a e C5b (maior fragmento). O C5b vai dar origem ao início da formação do MAC (complexo de ataque à membrana).
Os fragmentos menores têm uma função muito relevante dentro do sistema complemento. São chamados de anafilotoxinas (levam à uma resp. inflamatória).
Repare que as convertases sempre vão reagir com o próximo componente da via e que esse componente leva seus nomes (C3, C5). Isso facilita para lembrar dos processos.
Via Clássica
É uma via que depende da ligação Ag-Ac. Inicia-se a partir do componente C1, um complexo formado por 3 proteínas (C1q, associado com domínios globulares e as proteases C1r2s2 – C1r2 e C1s2). C1q tem uma estrutura de colágeno, semelhante às colectinas, e domínios globulares que reconhecem a porção Fc da IgG. 
O complexo C1 é ativado a partir do momento que reconhece e interage com duas regiões Fc de dois anticorpos (cada Ac tem uma região Fc). Isso acontece quando o anticorpo (IgG) se liga a um Ag específico e expõe sítios de ligação para a C1q. C1q, por sua vez, ao se ligar à duas regiões Fc da IgG/IgM, ao mesmo tempo, muda sua conformação e ativa as proteases (C1r2s2). Ao serem ativadas, as proteases, principalmente C1s, clivam o próximo componente da via.
A seta preta no canto inferior esquerdo indica um anticorpo e a vermelha, a direita, indica a região Fc
Para que a via clássica seja ativada, é necessária a presença de duas moléculas de Ac. O anticorpo mais eficiente na ativação dessa via é a IgM, que é formado por cinco moléculas de anticorpo (estrutura pentamérica) que, ao se ligar ao seu Ag específico, assume a forma de grampo, expondo cinco regiões Fc (cinco sítios de ligação para a molécula C1, que precisa de apenas dois sítios).
Outro Ac potente na ativação dessa via é a IgG, mas é preciso várias IgGs ligadas à estrutura do patógeno para ativar o C1, ao contrário da IgM.
Sendo assim, IgM, devido sua estrutura que exibe cinco sítios para a ligação de C1, é mais eficiente que a IgG na resposta do sistema complemento.
Ativação do sist. compl. pela via Clássica
· Reconhecimento de duas regiões Fc do Ac pela C1q;
· Mudança conformacional de C1q que ativa as proteases associadas;
· C1r tem um domínio catalítico que ativa C1s;
· C1s, agora ativada, cliva o próximo componente do sistema, o componente C4;
· C4 clivado por C1s gera dois fragmentos, C4a e C4b (maior);
· C4b se liga rapidamente à superfície do Ag para não ser hidrolisado e se liga ao C2;
· Cs cliva C2 em dois fragmentos, C2a (maior) e C2b;
· C4b se une à C2a, formando a C3 convertase, que vai clivar vários C3 em vários dois fragmentos, C3a e C3b (maior);
· C3b se une à C3 convertase, formando C5 convertase ou se liga à superfície celular do patógeno para não sofrer hidrólise;
· C5 convertase vai clivar C5 em C5a e C5b (frag. maior). O C5b vai dar origem ao início da formação do MAC (complexo de ataque a membrana).
Antes, tinha-se o conhecimento de que a via clássica só se iniciava na presença de anticorpos, mas hoje sabe-se que não. A C1 pode ser ativada independente da presença de Acs, como pela presença de alguns lipídeos na superfície de patógenos.Eles se ligam à C1, tornando-a ativa.
Via Alternativa
Pode acontecer pela hidrólise cutânea de C3 que ocorre espontaneamente no plasma. Ao ser clivada pela água dá início à via alternativa, gerando dois fragmentos, C3a (menor) e C3b (maior). 
C3b se liga à superfície celular e fazendo isso, se une à uma molécula chamada Fator B. Fator B + C3b sofrem a clivagem do Fator D (protease ativa), reduzindo-os a C3b e o Fator B em Ba e Bb (maior). Desse modo, ficam unidos o C3b e o Bb. Essa nova molécula é a C3 convertase dessa via: C3bBb.
Como uma C3 convertase é capaz de clivar até 1000 moléculas de C3, várias C3a e C3b são geradas nesse processo. Quanto mais C3b é formado, mais a via é reforçada, fazendo com que novas C3 convertase surjam e continuem seu papel no sistema imune.
A C3 convertase (da via alternativa) ligada à membrana celular é instável, então é estabilizada pela properdina, liberada pelos neutrófilos quando são ativados (então é ativada em processos inflamatório). A properdina tem afinidade pela membrana dos patógenos e faz a estabilização da C3 convertase quando se liga a ela (isso significa que se essa C3 se ligar à superfície da cél do hospedeiro, não há continuação da cascata, uma vez que a properdina só tem afinidade pela membrana de patógenos). Após ser estabilizada, a C3 convertase pode clivar outras C3, gerando C3a e C3b, que pode se juntar à C3 convertase e formar a C5 convertase da via alternativa (C3bBbC3b). A C5 convertase cliva a C5 em C5a e C5b (maior), dando início a ativação dos componentes finais da via do sistema complemento que levará à formação do MAC (complexo de ataque a membrana).
Embora a via Lectina e Alternativa sejam diferentes, evolutivamente surgiram antes da via clássica, pois não dependem da imunidade adquirida, ou seja, da produção de anticorpos, para serem ativadas.
O QUE ACONTECE APÓS A MAC? 
C5b, gerado pelas três vias, se associa a C6 e a C7, formando um complexo. C7 passa por uma mudança conformacional, expondo uma região hidrofóbica, então consegue se inserir na bicamada lipídica. Ao fazer isso, permite a ligação de C8, que se une ao complexo e se insere completamente na bicamada. Esse novo complexo permite a ligação de C9, que se polimeriza (vários monômeros de C9 se juntam), formando um poro na membrana do patógeno. (alguma relação com as defensinas?) Essa reação acontece em cadeia, então vários poros são formados.
Todos esses furos são poros formados a partir do complexo de ataque a membrana (MAC)
RESUMO:
 
RECEPTORES DO COMPLEMENTO: 
Além dos componentes ativados via cascatas nas três vias estudadas, existem outros que estão presentes na superfície das células do sistema imune, os receptores.
Exemplos: receptor CR1 presente em fagócitos > reconhece C3b, C4b, IC3b > presentes na superfície de eritrócitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, linfócitos B e cél dendríticas (FDC, em inglês).
Então, os receptores reconhecem os fragmentos que se aderem à superfície dos patógenos, promovendo uma série de mecanismos como o estímulo à fagocitose, degranulação do mastócito, ativação de cél do endotélio.
FUNÇÕES DO SISTEMA COMPLEMENTO: 
Independentemente da forma que as vias são ativadas, todas levam à ativação do sistema complemento e cuminam com o recrutamento de células inflamatórias, a opsonização e a morte de patógenos (MAC – complexo C5b a C9). 
· A formação do MAC contribui com a lise do patógeno, já que poros na membrana causam desequilíbrio osmótico;
· A opsonização é dada pelo reconhecimento do Ag pelos anticorpos (via clássica) ou pelas lectinas (via lectina pelos CHOs), que geram/produzem fragmentos C3b, que se aderem aos microrganismos > reconhecidos pelos receptores do complemento > fagocitose:
Os anticorpos e as C3b são consideradas opsoninas pelo fato de facilitarem a identificação de Ags pelas células do sistema imune (que têm receptores que fazem o reconhecimento desses componentes aderidos aos Ags), como o CR1, por exemplo, que reconhece a C3b e o Fc (dos Acs). A sinalização de que aquilo é um antígeno (já que a C3b tem que se ligar a um ag para não sofrer hidrólise e os anticorpos se ligam a eles para gerar uma imunidade) é recebida e reconhecida para os fagócitos.
· A ativação da resposta inflamatória acontece por meio dos fragmentos menores gerados durante as cascatas nas vias (C3a, C5a e C4a). Quando formados, são reconhecidos por receptores associados à ptn G de diferentes células do sistema imune (macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, mastócitos, células endoteliais). Ao serem reconhecidos, esses fragmentos promovem um aumento na permeabilidade do endotélio, permitindo a saída de fluido dos vasos sanguíneos para os tecidos (o que facilita a chegada de várias cel do sistema imune à injúria), além de permitir a migração celular (saída de células do sangue para o tecido – as cél do sistema imune no caso).
Esses componentes menores são quimiotáticos, ou seja, atraem cél. específicas. São, também, ativadores de cél. pois promovem a degranulação de mastócito, a fagocitose, degranulação de eosinófilo, ativam o processo oxidativo de neutrófilos. Por isso, são chamadas de anafilotoxinas, pois promovem ativação e resposta das cél. envolvidas nos processos inflamatórios.
· Eliminação de complexos imunes (Ag+Ac) circulantes. O C3b gerado durante a ativação do sistema complemento se interpõe na região Fc da imunoglobulina. Ao fazer isso, é reconhecida por eritrócitos (porque têm CR1), que se liga a esse complexo e o leva até o fígado e baço, regiões ricas em macófagos e fagócitos, que reconhecem os Fcs e a C3b para iniciar a fagocitose, liberando a hemácia. 
Se isso não acontecer, esses complexos começam a se depositar nos glomérulos renais, levando a uma ativação do sistema complementos nesse sítio, promovendo a inflamação renal, que pode resultar em falência ou insuficiência renal.
Em leitões, foi observado que a deficiência de fator H (regula a C3b, impedindo que a C3 convertase e, consequentemente, a C5 convertase sejam formadas) foi identificada como um traço autossômico recessivo. Os leitões acometidos são saudáveis ao nascer e se desenvolvem normalmente por algumas semanas. Contudo, acabam apresentando deficiências de desenvolvimento, param de crescer, tornam-se anêmicos (porque o C3b age sobre essas e muitas outras células, ativando as cascatas proteolíticas, como se fosse na cél do Ag, mas nesse caso é na do hospedeiro mesmo) e morrem por insuficiência renal pela deposição de C3, já que não tem o fator H inibindo a produção de C3 convertase.
Esses complexos não seriam enviados ao órgão linfoide mais próximo? Por que se acumulam nos rins?
· Auxilia na remoção de células apoptóticas: após a apoptose há a exposição de marcadores nessas células (como a fosfatidilserina), bolhas contendo DNA, etc, que se tornam sítios para ligação de ptns C1q (via clássica) e MBL (via lectina), ativadoras do sist. complemento nesse caso. Durante a ativação, são gerados fragmentos C3b e C4b, que são reconhecidos por fagócitos (que possuem receptores para esses fragmentos) facilitando, desse modo, a fagocitose das cél apoptóticas.
· Presença na interface com a imunidade adquirida: no BCR, receptor do linfócito B, há um CR2 (ou CD21), um receptor de complemento, que reconhece fragmentos ainda mais clivados de C3, o C3d. Então, quando um epítopo é reconhecido pelo BCR, o Ag está opsonizado por proteínas do sistema complemento, mais especificamente pelo C3d, fazendo com que seja reconhecido pelo CR2. Com isso, há a ativação do linfócito B, pois o CR2 faz parte do complexo de reconhecimento do BCR.
O CR2 tem domínios citoplasmáticos que vão levar à sinalização intracelular.
REGULAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO: 
· A instabilidade relativa de muitos componentes do complemento é o primeio meio que o hospedeiro se protege contra a ativação inadvertida do complemento. O fato de precisar ficar estável para ser ativado é um mecanismo. Ex.: C3 convertase da via alternativa, que precisa da properdina;
· Outro mecanismo é o fato deos CHO da superfície celular microbianas serem diferentes das cél. do hospedeiro;
· Outro mecanismo é ação de proteínas reguladoras que atuam inibindo, destruindo ou diminuindo a atividade das ptn do complemento e seus fragmentos ativos.
Ptn que regulam o sistema complemento
· C1-INH: inibidor de serina protease (ele inibe a serina ou é formado por serina?). Causa dissociação do C1r2s2 do C1q. O inibidor se liga à C1r2s2 impedindo a formação do complexo C1;
· Proteína de ligação do C4bBP, CR1 ou MCP associadas ao C4b: bloqueiam a formação da C3 convertase, devido essa associação impedir a ligação entre C4b e C2 da via clássica e lectina. A partir da associação, as ptns atuam como cofatores para o Fator I, fazendo com que ele clive a C4b em C4c e C4d, fragmentos ainda menores, tornando totalmente irreversível a ação desse C4b. 
Se o CR1 é o receptor que faz o reconhecimento de C4b, como ele vai limitar a ação do sistema complemento? Ele não faz é ativar a fagocitose por exemplo?;
· Na via alternativa, CR1, MCP (CD46) e fator H impedem a ligação do C3b com o fator B. Essas ptn se associam ao C3b, tornando-o inacessível ao fator B para a formação de C3 convertase. Como são cofatores do Fator I, promovem o reconhecimento da associação por ele e a clivagem de C3b em fatores ainda menores.
· Fator de aceleração do decaimento (DAF) ou CD55: acelera a dissociação do C4bC2b e C3bBb, ou seja, após formada a C3 convertase da via alternativa, esses fatores atuam fazendo a dissociação. Os fragmentos viram alvo de clivagem pelo Fator I.
· A ligação da ptn S ao complexo impede a inserção do componente C8 na MAC C5bC6C7 na membrana. Com isso, o poro não é formado.
· Fator de restrição homóloga (HRF) ou CD59: liga C5bC6C7C8, impedindo a formação do poli-C9, bloqueando a formação do MAC. A imagem dessa parte pode ser vista acima.
Trabalhos mostraram que deficiências em componentes das vias torna o indivíduo mais suscetível a infecções bacterianas. Mostraram também que a ausências de componentes pode levar ao acúmulo de complexos imunes na circulação, levando à deposição dos mesmos nos rins > insuficiência renal.
COVID E SISTEMA COMPLEMENTO: 
O SARS-CoV-2 infecta células do epitélio pulmonar pelos receptores ACE 2. Com isso, são produzidas citocinas (IL-18, MCP1, IP10, MIP1α), que atraem células para induzir uma resposta inflamatória. Alguns infectados evoluem para o Viral clearance (resposta imunomediada pelos linfócitos - anticorpos gerados – e células NK, que produzem citocinas que levam o Ag à morte). Outros evoluem para a Hiperinflamação, onde se tem grande recrutamento de células e grande produção de citocinas inflamatórias (IL-6, TNF, IL-17A, GM-CSG, G-CSF) que fazem com que esse tipo de resposta seja ativado. Fatores como idade, fumante, diabetes e glicocorticoides culminam com um quadro mais severo e estão envolvidas nessa parte da hiperinflamação.
A resp. imune que é induzida e que pode contribuir com esse quadro mais grave com grande liberação de citocinas, é perceptível que o sistema complemento tem sua participação. Isso porque a liberação do vírus no meio extracelular pode ativar o sistema complemento pela via lectina (CHO na membrana), via clássica (produção de Acs durante a infecção) e via alternativa (hidrólise do C3b, que pode se associar ao envelope do vírus e induzir a ativação do sist. complem.).
Os fragmentos menores (anafilotoxinas) induzem o processo inflamatório, então podem contribuir com esse quadro (procurar no documento por “quimiotáticos” para relembrar).
Para melhorar os casos de hiperinflamação, muitos cientistas estão buscando formas de inibir alguns participantes do sistema complemento (anti-C3, anti-C5, anti-IL-6, anti-IL-1, anti-IFN).