Relatório HPLC (1)

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Disciplina de Análise Instrumental I
Laboratório: Análise Instrumental (Lab. 313)
Prática: Determinação de Cafeína e teobromina por UHPLC em fase reversa 
Professores: Ana Luísa de Queiroz Baddini e Leila Pontes da Silva 
Data da realização da prática: 03/06/2023 
Data de entrega do relatório: 17/06/2023 
Turma: BM171 
Alunos: Daniel Coelho, Maria Kelly, Sabrina Araújo e Stéphanie Diana
 MEMORIAL DE CÁLCULOS
1. Dados obtidos
1.1. Padrão 1 ppm
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,611
	1,2483
	teofilina
	3,790
	11,7564
	cafeína
	5,035
	1,2205
1.2. Padrão 5 ppm
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,620
	6,1881
	teofilina
	3,808
	11,9046
	cafeína
	5,063
	6,0462
1.3. Padrão 10 ppm
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,623
	10,7318
	teofilina
	3,811
	10,4393
	cafeína
	5,065
	10,5155
1.4. Padrão 20 ppm
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,617
	21,4487
	teofilina
	3,801
	10,6803
	cafeína
	5,050
	20,9833
1.5. Padrão 50 ppm
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,618
	64,5740
	teofilina
	3,806
	12,5062
	cafeína
	5,056
	63,3433
1.6. Amostra 1
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,638
	17,0079
	teofilina
	3,824
	10,3621
	cafeína
	5,078
	2,0783
Descrição da amostra e modo de preparo:
Chocolate em pó: 
pesar 0,25g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com um papel de filtro vai filtrar a solução e transferir para um balão volumétrico. Adicionar 1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o traço de referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente com um filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..
1.7. Amostra 2
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	2,629
	0,1120
	teofilina
	3,810
	1,5657
	cafeína
	5,056
	6,9758
Descrição da amostra e modo de preparo:
Café solúvel:
pesar 0,25g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com um papel de filtro irá filtrar a solução,e diluí-lá 5x e transferir para um balão volumétrico. Adicionar 1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o traço de referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente com um filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..
1.9. Amostra 3
	Padrão
	TR
	Área
	teobromina
	3,813
	7,2315
	teofilina
	4,779
	0,0925
	cafeína
	5,062
	0,2237
Descrição da amostra e modo de preparo:
 
Café descafeinado:
 pesar 0,10g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com um papel de filtro vai filtrar a solução e transferir para um balão volumétrico. Adicionar 1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o traço de referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente com um filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..
2. Curva de calibração da cafeína sem padronização interna
	Concentração (mg/L)
	Área
	1
	1,2205
	5
	6,0462
	10
	10,5155
	20
	20,9833
	50
	63,3433
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R2): 0,9943
Equação da reta: f(x) = 1,2718x – 1,4526
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,776 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 6,626 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 1,318 mg/L. 
3. Curva de calibração da teobromina sem padronização interna
	Concentração (mg/L)
	Área
	1
	1,2483
	5
	6,1881
	10
	10,7318
	20
	21,4487
	50
	64,5740
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R2): 0,9944
Equação da reta: f(x) = 1,2963x – 1,458
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,7293 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 6,5003 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 1,2974 mg/L.
4. Curva de calibração da cafeína com padronização interna
	Concentração (mg/L)
	Áreaanalito/ÁreaPI
	1
	0,1039
	5
	0,5075
	10
	1,0066
	20
	1,9614
	50
	5,0705
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R2): 0,9998
Equação da reta: f(x) = 0,1013x – 0,0123
Concentração da cafeína na amostra 1: 0,2108 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 0,7027 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 0,02255 mg/L.
5. Curva de calibração da teobromina com padronização interna
	Concentração (mg/L)
	Áreaanalito/ÁreaPI
	1
	1,2483
	5
	6,1881
	10
	10,7318
	20
	21,4487
	50
	64,574
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R2): 0,9944
Equação da reta: f(x) = 1,2963x – 1,458
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,58349 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 8,6279 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 0,29017 mg/L.
6. Tarefas
6.1. Listar os equipamentos utilizados (marca e modelo) e as condições de análise.
· UHPLC (cromatografia líquida de ultra eficiência) Ultimate 3000 da Thermo Scientific operando a 30o C com fase móvel composta por etanol 30% e H20 miliQ 
6.2. A partir dos valores das áreas dos padrões, fazer os Gráficos da Curva de Calibração Sx/Spi x Conc. e Sx x Conc. da Cafeína e Teobromina, considerando a Teofilina como padrão interno de cada um dos alcalóides purínicos. Calcular os coeficientes angular, linear e R2. 
Envie os cromatogramas e os resultados das áreas dos arquivos originais da ChemStation e as curvas de Excel para os professores. 
6.3. Calcular o teor das metilaxantinas (% p/p) nas amostras analisadas. Apresente todos os cálculos.
Amostra 1:
· Concentração corrigida de cafeína: 0,2108 (calculado anteriormente)
· Concentração corrigida de teobromina: 17,0079 (fornecido)
· Concentração corrigida de teofilina: 10,3621 (fornecido)
Amostra 2:
· Concentração corrigida de cafeína: 0,7027 (calculado anteriormente)
· Concentração corrigida de teobromina: 0,112 (fornecido)
· Concentração corrigida de teofilina: 1,5657 (fornecido)
Amostra 3:
· Concentração corrigida de cafeína: 0,02255 (calculado anteriormente)
· Concentração corrigida de teobromina: 7,2315 (fornecido)
· Concentração corrigida de teofilina: 0,0925 (fornecido)
Agora, para calcular o teor das metilaxantinas em cada amostra (% p/p), dividiremos a concentração de cada metilaxantina pela soma das concentrações de todas as metilaxantinas e multiplicaremos por 100.
Vamos realizar os cálculos para cada amostra:
Amostra 1:
· Cafeína: (0,2108 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 1,0019%
· Teobromina: (17,0079 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 80,5517%
· Teofilina: (10,3621 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 48,4464%
Amostra 2:
· Cafeína: (0,7027 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 30,6145%
· Teobromina: (0,112 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 4,8852%
· Teofilina: (1,5657 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 68,5003%
Amostra 3:
· Cafeína: (0,02255 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 0,3065%
· Teobromina: (7,2315 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 98,5814%
· Teofilina: (0,0925 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 1,1121%
Portanto, os teores das metilaxantinas (% p/p) nas amostras analisadas são:
Amostra 1:
· Cafeína: 1,0019%
· Teobromina: 80,5517%
· Teofilina: 48,4464%
Amostra 2:
· Cafeína: 30,6145%
· Teobromina: 4,8852%
· Teofilina: 68,5003%
Amostra 3:
· Cafeína: 0,3065%
· Teobromina: 98,5814%
· Teofilina: 1,1121%
6.4. Por que a teobromina tem tempo de retenção menor do que a cafeína?
A teobromina possui tempo de retenção menor que a cafeína porque ela interage menos com a fase estacionaria da coluna do que a cafeína que tem maior interação e consequentemente maior tempo de retenção. 
6.5. Existe teobromina e cafeína em todas as amostras?Justifique.
Sim, pois a planilha gerada no cromatograma após a leitura das amostras indica tempos de retenção praticamente iguais, porém com áreas diferentes pois a concentração em cada amostra é variada.
6.6. Comparação dos dados experimentais entre si.
FOLHA DE CÁLCULOS:
Curva de calibração da cafeína sem padronização interna
Dado que a área para a cafeína na Amostra 1 é 2,0783, podemos substituir esse valor na equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (2,0783 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 3,53089842254978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 2,7783 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 1 é aproximadamente 2,7783 mg/L.
Dado que a área para a cafeína na Amostra 2 é 6,9758, podemos substituir esse valor na equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (6,9758 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 8,42839842254978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 6,6287 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 2 é aproximadamente 6,6287 mg/L.
Dado que a área para a cafeína na Amostra 3 é 0,2237, podemos substituir esse valor na equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (0,2237 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 1,67619844754978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 1,3189 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 3 é aproximadamente 1,3189 mg/L.