Cromatografia Líquida de Gel Filtração

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Coordenadoria de Biotecnologia
Disciplina de Análise Instrumental I
Laboratório: Análise Instrumental (Lab. 313)
Prática: Cromatografia Líquida de Gel Filtração 
Professores: Ana Luísa de Queiroz Baddini e Leila Pontes da Silva 
Data da realização da prática: 17/06
Data de entrega do relatório: 24/06
Turma: BM 171
Alunos: Daniel Coelho, Sabrina Araujo e Bruno Lima Hammer
I. Objetivos 
· Separação de moléculas utilizando exclusão molecular como método de purificação por cromatografia líquida de gel filtração com a coluna Sephadex G-50. 
II. Resultados e Conclusão
· Tabela 1: Absorbâncias em 560 nm e 620 nm X Volumes eluídos
	Volume Eluído
	abs 560nm
	abs 620nm
	2
	-8,46E-02
	-7,24E-02
	4
	-7,93E-02
	-6,65E-02
	6
	3,11E-03
	1,10E-02
	8
	1,66E-02
	0,16104
	10
	0,14457
	0,20436
	12
	-0,12641
	-6,91E-02
	14
	-0,10193
	-7,60E-02
	16
	-8,10E-02
	-0,11997
	18
	0,21401
	7,75E-02
	20
	0,5335
	-6,22E-02
	22
	0,85234
	-0,11125
	24
	1,0275
	-0,13993
	26
	1,0708
	-0,1271
	28
	0,53618
	-0,11779
	30
	0,22443
	-0,14837
	32
	5,34E-02
	-8,73E-02
	34
	-0,12308
	-0,15101
	36
	5,95E-02
	5,18E-02
	38
	-1,05E-02
	-2,18E-03
	40
	0,1221
	0,11861
· O primeiro a eluir é o azul de dextran por ser uma molécula menor e não penetrar os poros da resina , posteriormente o vermelho de fenol elui por ser uma molécula menor que passa pelos poros da resina ficando mais tempo retido. 
III. Perguntas da prática 
1. Construa o cromatograma Abs x volume de eluição (mL) da gel filtração dos corantes em coluna Sephadex G-50, determinando os volumes morto e final da coluna 
· Vermelho de fenol: volume morto = 6 mL, 8 mL, 10 mL, 34 mL, 40 mL, volume final: 26 mL
· Azul de dextran: volume morto = 18 mL, 32 mL, 32 mL, 36 mL, 38 mL, 40 mL, volume final = 10 mL
2. Descreva o que foi observado em relação ao volume coletado da amostra após a eluição. Justifique
· Observando os picos de absorbância é possível perceber um grande pico em ambas as curvas, resultado da eluição de um volume maior do analito naquela porção. No entanto, a eluição para ambos analitos não seguiu os resultados esperados completamente, dado a presença de picos menores em ambos os gráficos. No caso do Azul de Dextran apresentando picos menores após a sua eluição inicial, significando que uma porção da amostra pode ter sido retida pelo gel. No caso do Vermelho de Fenol, há um pico coincidente com o primeiro pico de Azul de Dextran que indica que algumas moléculas foram capazes de eluir através do gel junto com o Azul de Dextran antes das outras. 
3. Analise a resolução, seletividade e eficiência obtidas neste ensaio
· A resolução desta cromatografia pode ser dita como ruim, embora haja uma distância entre os grandes picos de absorbância das amostras, ambos coincidem com picos menores da outra amostra, ou seja, elas ainda não foram separadas completamente umas das outras.
4. Por que as colunas armazenadas em metanol são pré-eluídas com água?
· A pré-eluição com água das colunas de cromatografia é essencial para a prevenção da formação de cristais que podem danificar e inutilizá-la.
5. Por que as resinas devem ser guardadas em azida sódica ? Como atua a azida ?
· As resinas cromatográficas são frequentemente armazenadas em azida sódica (NaN3) para evitar o crescimento de microorganismos. A azida sódica atua como um agente antimicrobiano, inibindo o crescimento de bactérias e fungos que podem contaminar as resinas. Isso é especialmente importante para garantir a integridade das resinas durante o armazenamento a longo prazo.
6. Como você procederia caso desejasse trabalhar com maior volume de amostra ? 
· Caso seja desejado trabalhar com um volume de amostra maior, pode-se considerar a diluição da amostra original. A diluição reduzirá a concentração dos componentes da amostra, permitindo que uma quantidade maior seja injetada na coluna cromatográfica sem sobrecarregar o sistema. É importante garantir que a diluição seja feita corretamente para não comprometer a detecção e a separação dos componentes.
7. Duas moléculas da mesma massa molecular obtiveram diferentes tempos de retenção. Explique
· Devido a diferenças em suas interações com a fase estacionária. Fatores como polaridade, tamanho, carga e afinidade pela fase estacionária podem influenciar a retenção das moléculas. Portanto, mesmo com a mesma massa molecular, as moléculas podem apresentar características estruturais ou propriedades químicas diferentes que levam a diferentes tempos de retenção na cromatografia.
8. Você está utilizando uma Sephacryl S-500 HR. Entretanto, a eluição está demorando excessivamente. O que fazer ?
· Primeiro, verifique se as condições de fluxo e pressão estão adequadas e otimizadas. Verifique se não há obstrução ou vazamento no sistema cromatográfico. Além disso, é possível verificar se a amostra está sendo aplicada corretamente, evitando sobrecarga na coluna. Se mesmo assim a eluição continuar demorada, pode ser necessário considerar a substituição da coluna com o uso de uma fase móvel mais adequada.
9. O que fazer quando a única chance de separação de duas substâncias é através do aumento do “mesh” da resina e da ampliação do número de pratos teóricos ?
· Quando a única chance de separação de duas substâncias é aumentar o "mesh" da resina e ampliar o número de pratos teóricos, isso significa que é necessário aumentar a eficiência da separação. Isso pode ser alcançado usando uma resina com uma matriz de partículas maiores (mesh maior) ou aumentando o comprimento da coluna cromatográfica para aumentar o número de pratos teóricos. Essas estratégias visam melhorar a resolução e a separação dos componentes da amostra.
10. Como você procederia para determinar a massa molecular de uma proteína em uma solução incolor contendo várias macromoléculas
· Para determinar a massa molecular de uma proteína em uma solução incolor contendo várias macromoléculas, seria necessário realizar uma análise de cromatografia líquida de exclusão por tamanho em uma coluna adequada para a separação de proteínas. A calibração da coluna seria realizada utilizando padrões de proteínas de massa molecular conhecida, permitindo a construção de uma curva de calibração que relaciona o volume de eluição com a massa molecular. Através dessa curva, seria possível determinar a massa molecular da proteína de interesse.
11. Como você calibra a sua coluna ?
· A calibração da coluna pode ser realizada utilizando-se padrões de compostos com massa molecular conhecida. Esses padrões são injetados na coluna cromatográfica e seus tempos de retenção são registrados. A partir desses dados, é possível construir uma curva de calibração que relaciona o tempo de retenção com a massa molecular dos compostos. Essa curva pode ser usada posteriormente para determinar a massa molecular de amostras desconhecidas com base em seus tempos de retenção na coluna.