Tema 3 - Amplificação in vitro de DNA

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02/03/2023, 21:11 Amplificação in vitro de DNA
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Ampli�cação
in vitro de DNA
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição
Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações em rotina laboratorial.
Propósito
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes formas e entender quais são suas vantagens,
desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de
trabalho.
Objetivos
Módulo 1
Elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro.
Módulo 2
Variações entre cada técnica de PCR
Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
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Módulo 3
Aplicações apropriadas ao uso de cada método
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.
Introdução
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você já parou para pensar como certas características
físicas passam dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações
transmitidas às gerações futuras dos ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos:
o ácido desoxirribonucleico (ADN – também conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em inglês).
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade viva conhecida — a célula. O DNA possui fita dupla,
sendo mais estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA,
normalmente, em fita simples e mais instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da maioria
das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se
limita apenas em traços físicos, mas também em funcionais.
Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria em um ambiente extremamente complexo e
controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na
síntese de novas moléculas de DNA, tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse processo.
Apesar de toda a complexidade da duplicação do DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em proteína.
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1 - Elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos in vitro.
Princípios da PCR concencional
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas
funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos
nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses
tijolos?
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma
mais conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de
oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases nitrogenadas:
esoxirribonucleico
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que está ausente.
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Para o RNA há uma diferença:
No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U). Essas bases são
as responsáveis pela informação genética.
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria
possível entender a informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado,
usará um código binário. Isso também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em
sequência, uma informação preciosa.
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila
(álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida
como fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são formadas. É importante
manter em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA – vamos voltar a falar a respeito disso mais à frente.
ódigo binário
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como computadores.
Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e base nitrogenada.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para
interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois
grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos que possuem:
Adenina (A)
Citosina (C)
Guanina (G)
Timina (T)
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Pirimidinas
(C, T, U) - Possuem um anel.
Purinas
(A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam com purinas, de acordo com as cargas livres de cada base.
Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através de três cargas. Essas interações são
chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e
químicos, como o pH.
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta
verde) entre adenina e timina, e as triplas (seta preta) entre citosina e guanina.
Pareamento de bases nitrogenadas.
No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas
características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do
RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a
característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação semiconservada.
emiconservada
Uma fita original (fita parental)é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita filha).
Atenção!
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos que uma das fitas se encontra com o
carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece
porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido de
interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação deve ser feita de forma semidescontínua (In vivo, apenas
a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso
acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação).
Reação em cadeia pela polimerase: ampli�cando DNA in vitro
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
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Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA
e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in vitro. Veja:
Complementariedade entre �tas antiparalelas
Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as bases nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases
correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de
90ºC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem
e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo
funciona passo a passo mais à frente.
Síntese enzimática pela polimerase
Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um
molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase não
inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou
adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por
outra enzima, chamada primase.
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA em fitas
simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas
sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são
chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, conhecidos como primers, em inglês.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um
antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na
posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do
nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os
oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão
demarcar a região do genoma a ser amplificada. Essa informação é importante para dar especificidade à PCR!
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Etapas da reação em cadeia da polimerase
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de síntese
de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa
de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender
como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos
– para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a
amplificação são:
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.
A Taq polimerase, termorresistente.
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três fosfatos são usados como fonte de
energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça.
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.
Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste.
Vejamos:
1. A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos,
95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem
estar muito concentradas, superenoveladas e ser muito longas.
2. Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão.
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por
complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.
Ilustração das etapas da PCR.
Entenda melhor como acontecem estas etapas:
Desnaturação 
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Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla.
Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95ºC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas
mais elevadas.
No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC
a 72ºC.
Atenção!
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para
amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um
tempo de extensão de 30 a 40 segundos.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo
desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a
síntese de todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um
grande avanço para as ciências biológicas e permitirama grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média
dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon (produto
amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro
ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1
bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente.
Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia, em aparelho termociclador.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
PCR qualitativa
Todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se dá pela
constatação da presença ou ausência do produto alvo da amplificação. Abordaremos alguns outros tipos de PCR que se encaixam nessa categoria.
PCR quantitativa
Também conhecida como em tempo real. Os ciclos se dão em um aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz de
quantificar em tempo real. Existem dois métodos que são mais comuns para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de revelação
posterior à reação, o que a torna mais rápida.
Anelamento 
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Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é
transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos
manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos
oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do
nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial.
Dica
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que
se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com
pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais
rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.
Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma
malha mais fechada ou mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para
podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que
o tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione adequadamente.
Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e aplicação do produto de PCR.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a
eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e
um tampão ionizável. A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas
migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo
negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução
submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa
por dentro da agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de carga
negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da
velocidade de migração, e não da posição do DNA.
Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
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Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA
de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho
das sequências de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon) no gel de agarose. Esse reagente, chamado de
fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que
intercale especificamente com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita dupla
de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e
as boas práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes da solidificação
do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio
é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um equipamento chamado transiluminador.
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho
molecular.
Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou
múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única
era esperada.
Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de possíveis problemas.
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para
separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas.
O gel de acrilamida/bisacrilamida também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas diferentes, mais
complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para execução.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose
corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR mais utilizada.
PCR e eletroforese
Veja na prática a reação emcadeia pela polimerase.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto afirmar que
A a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.
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Parabéns! A alternativa B está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-paragraph'%3EAs%20DNA-
polimerases%20s%C3%A3o%20incapazes%20de%20reconhecer%20o%20local%20de%20in%C3%ADcio%20de%20replica%C3%A7%C3%A3o%2C%20s
alvo%20desejada.%20O%20anelamento%20dos%20oligonucleot%C3%ADdeos%20permite%20o%20reconhecimento%20pela%20polimerase%2C%20q
Questão 2
A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura. Considerando as etapas, leia as afirmativas a seguir e
assinale a alternativa correta:
I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA em fitas simples.
II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a 70ºC.
III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação colorimétrica.
IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas de acordo com o tamanho, através de
eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.
V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel em direção ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica.
B
a especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e permitir que a polimerase inicie a
síntese.
C a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.
D a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.
E apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq polimerase.
A Somente a afirmativa II está correta.
B Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
C Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
D Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.
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Parabéns! A alternativa E está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3ENa%20PCR%2C%20ocorre%20o%20aumento%20exponencial%20do%20n%C3%BAmero%20de%20fitas%20duplas%20de%20DNA%20co
alvo.%20No%20entanto%2C%20esse%20aumento%20%C3%A9%20invis%C3%ADvel%20a%20olho%20nu%20e%20precisa%20ser%20revelado.%3C%2F
2 - Variações entre cada técnica de PCR
Ao �nal deste módulo, você será capaz de diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
Variações da técnica de PCR
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em
que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações, como o
sequenciamento. Em determinadas ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras
situações, podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do
DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras exceções.
Dica
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base para que variações mais complexas,
específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.
Reação de transcrição reversa
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA
polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças
causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A
Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
E Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.
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Como conseguimos resolver esse problema?
Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela
humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA →
proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso
mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente.
Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os
pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de
vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para diagnóstico e pesquisa.
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada daqui em diante para designar a reação em si) precisa de
alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na
manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro
(mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como os próprios retrovírus. Além
do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de
transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT)
seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR convencional,
para iniciar a transcrição.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada
sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T), que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser
aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
Primeiro caso
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se anelam.
Segundo caso
P d i DNA l t t d RNA d él l tit i bibli t d ã ê i
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Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa
acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por
poucos minutos. Na maioria dos casos,não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo,
podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação.
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo
por complementariedade, e síntese de cDNA pela transcriptase reversa.
Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR. Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR
de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter
apenas essas duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a
anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.
Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR.
Nested-PCR
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade.
Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o
amplicon. Nós chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade.
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade. Normalmente, a
PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional
pode não ser suficiente, pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do número de fitas
devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as
Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de expressão gênica.
Terceiro caso
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou
não. Similar à PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA
complementar usando o quarto reagente, os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
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chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação.
Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais
aumento significativo de DNA a cada ciclo.
Gráfico representativo das qPCR.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em
uma técnica conhecida como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira
reação, chamado de iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação
de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes.
Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de
etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR.
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A
primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo e
específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na segunda reação.
Saiba mais
Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma primeira PCR cujo amplicon contenha
regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se
anelem especificamente à região que foi amplificada anteriormente.
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar
produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na
segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR. Note o uso de
iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de amplificação na segunda reação, que usa
iniciadores internos.
Representação esquemática de uma nested-PCR.
PCR quantitativo em tempo real – qPCR
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos produtos da PCR e posterior revelação
das bandas através de agentes intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz
ultravioleta. Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for
utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.
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Exemplo
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR
convencional e suas variações vistas até agora não informam o suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a
quantidade de certa sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa - também conhecida como
PCR em tempo real - (qPCR).
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior.
Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz
de detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de DNA-
alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e
detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém seus
resultados podem ser igualmente mais informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura
única para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 oC.
Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a fase de curva de dissociação.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e
na especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes?
Vejamos!
SYBR Green
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser
excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR temsua fluorescência
drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na
revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão, pois esse é o momento em que há maior número de
bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência
será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois
maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada.
Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação,
e um platô após a curva de crescimento exponencial será observado. Repare que, quando não está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua
desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.
Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
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É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência seja menos
específica: como em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela
especificidade. Assim, outras formas de controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal
fluorescente usado na quantificação corresponda apenas ao produto desejado.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente,
para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da
fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e
específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR
por SYBR sem especificidade, mais de um pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível de
controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.
A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR. Observe:
Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por SYBR Green.
Quanti�cação absoluta por SYBR
Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer uma curva de quantificação absoluta.
TaqMan
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica SYBR,
a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. Entretanto, a
TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui,
temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta,
com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda
contém uma molécula fluorescente na extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu
bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos
(polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease).

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A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém o
fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável. A cada novo ciclo da PCR,
as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com remoção dos
nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a
emissão de fluorescência.
Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A
especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas
como single nucleotide polymorphism (SNP).
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do
que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de
múltiplas detecções na mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria
das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de
qualidade.
Quanti�cação
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo aparelho.
Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual
espectro da emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Isto é, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.
Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior
ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da
reação que não está relacionada com a amplificação da sequência-alvo em si.
Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído (background). O ruído vai ser utilizado
para determinar o limiar de detecção (threshold).
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O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do ruído (ou da fluorescência de base) é
chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada. A
relação entre concentração inicial de DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma
amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou normalizar) a reação internamente são a ROX, um
fluoróforo passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do DNA) usado como referência,
e o Rn, que representa um ajuste(ou normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda
TaqMan) e a referência ROX. A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo
a nós apenas a observação para eventual detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a
qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam
confiáveis.
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o
resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae. Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa
o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação
das amostras e, como você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com
menor Ct.
Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?
Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).
Pela curva padrão
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com
concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós
mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma fração da
solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim sucessivamente até
termos pelo menos 5 pontos de curva.
Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a nossa metodologia é utilizada a escala em microlitro (µL).
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Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma que o próprio computador calcule os
parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração
desconhecida. Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a
linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras
desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.
Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.
Linearidade da curva
Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja
calculada com máximo de precisão. Usando fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da amplificação
começar, baseado no Ct de cada uma.
E�ciência de ampli�cação
Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém,
devido a pequenos erros, podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais robustos com uso
de replicatas (repetições da mesma reação em poços diferentes.).
Por quanti�cação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de
referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra
ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de interesse pode variar de
acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode ser devido à quantidade de material usado na extração.
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um
gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração
na amostra-teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira subtração;
ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:
Rotacione a tela. 
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir
em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de
procedermos para a técnica de quantificação relativa.
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar
qual? A pista mais importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está olhando
diretamente o genoma, mas um produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?
ΔCt = Ctgene alvo  − Ctgene de referéncia SeguidoporΔΔCt = (Ctgene alvo  − Ctgene de referencia )calibrador  − (Ctgene alvo  − Ctgene de referencia )am
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Resposta
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR: uma reação de transcrição reversa
acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
PCR em multiplex
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos
detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos
para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado chamamos de
multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários,
sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os
amplicons tenham tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de ultravioleta não sejam
confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos maiores de
1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.
Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo de extensão.
Outro fator ao qual você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos múltiplos pares de iniciadores, que
devem ter temperaturas o mais próximas possível.
Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas
distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam
fluorescência em comprimentos de onda diferentes.
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja
excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por diante.
Por outro lado, reações multiplexquantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é
inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é
possível distinguirmos entre os sinais dos diferentes produtos.
Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os produtos distintos têm sequências
diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%. Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas
diferentes. No entanto, sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não veremos
diferenças em suas curvas de dissociação.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações, é correto afirmar
que
A
na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que geram produtos de tamanhos
distintos.
B o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.
C
na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de amplificação da
sequência-alvo presente no cDNA.
D
uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que o produto amplificado da primeira serve como
molde para amplificação na segunda.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EA%20Taq%20polimerase%20usada%20para%20amplifica%C3%A7%C3%A3o%20de%20DNA%20n%C3%A3o%20%C3%A9%20capaz%20d
polimerase%20RT%20dependente%2C%20ou%20transcriptase%20reversa.%20Ent%C3%A3o%2C%20usamos%20o%20cDNA%20sintetizado%20como
Questão 2
Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas. Considerando isso, leia as afirmativas abaixo e, em seguida, assinale a alternativa
correta.
I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e modificarmos geneticamente um organismo simples.
II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR TaqMan pode ser usada na identificação e quantificação de
mutações em diferentes alelos.
III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de aplicações muito restritas.
IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas.
Parabéns! A alternativa A está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EA%20PCR%20convencional%20pode%20ser%20utilizada%20para%20clonar%20um%20gene%20atrav%C3%A9s%20de%20um%20vetor%
TaqMan%2C%20as%20sondas%20auxiliam%20na%20quantifica%C3%A7%C3%A3o%20de%20muta%C3%A7%C3%B5es%20de%20alelos%20diferentes
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E a reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.
A Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.
B Somente as afirmativas I e IV estão corretas.
C Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
D Somente as afirmativas I e II estão corretas.
E Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.
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3 - Aplicações apropriadas ao uso de cada método
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car aplicações apropriadas ao uso de cada método.
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias
da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a
tornam ainda mais relevante e útil em diversos contextos.
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações disso? Para ilustrar melhor o quão útil a PCR é, veremos
alguns exemplos a seguir.
A PCR e as suas variantes em ciências forenses
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de
um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido alguma reportagem da
vida real. Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem do DNA. Denominadas marcadores
moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre
indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats).
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na identificação de
indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.
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As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose
e coloração por brometo de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o
perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem.
Um cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil genético.
Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores moleculares.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução,
de doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em
determinado contexto. Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a
infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou
recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas
maneiras, dependendo de qual é a doença e de seu perfil genético.
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar
no reconhecimento de pequenas mutações que levariam ao desenvolvimento de uma doença genética. Mas temos outras aplicações, usando PCR
convencional.
Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três
nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que
causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR torna-se uma
importante ferramenta diagnóstica, pois,ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o
risco e até o prognóstico da doença em si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35
ou mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de
fenótipo – no caso da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.
Atenção!
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso geraria
inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas
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Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para
amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria
estar presente naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença.
A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis, por
possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do material genético de determinado microrganismo não é suficiente para
seu diagnóstico como agente causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como técnicas de PCR mais
elaboradas que darão maiores informações.
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), assim como os
demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e
o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material
genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso,
esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser
monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação
de cDNA obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista
pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão.
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do paciente. A
PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas,
mas que exigem abordagens clínicas diferentes.
Exemplo
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o nefrologista a pensar em duas possibilidades: na
primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode
estar acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo ao óbito do paciente.
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A PCR e as suas variantes em pesquisa cientí�ca
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para manipulação genética de organismos
simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso
ao amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira região liga-
se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor
dentro do qual queremos colocar nosso gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando
inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula
a outra, comuns em bactérias.
Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por PCR, ao vetor original.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos
o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de
restrição para cortar o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR.
A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em entender
mecanismos complexos de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma ferramenta muito útil
nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes em células submetidas a diversas condições
diferentes.
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de interesse com um gene constitutivo de expressão
estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer
aplicação que determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é usada em pesquisa científica,
como, provavelmente, foi originada de uma.
Quanti�cação relativa de genes por RT-qPCR e seu uso em pesquisa
Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de SYBR.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em ciências
forenses, é correto afirmar que:
A a nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em situações forenses.
B a PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de indivíduos.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
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Questão 2
A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes para amplificações na pesquisa e diagnósticos. Sobre a PCR, escolha a
alternativa correta:
Parabéns! A alternativa C está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
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CoV2%2C%20assim%20como%20os%20demais%20coronav%C3%ADrus%2C%20tem%20RNA%20fita%20simples%20como%20material%20gen%C3%
qPCR.%3C%2Fp%3E%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20
C as STRs são regiões cuja variabilidadeas tornam úteis para distinguir indivíduos geneticamente.
D a qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra antes de seu sequenciamento.
E o sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos, além de ser trabalhoso e caro.
A Um dos principais métodos utilizados em análises forenses é o sequenciamento de genes conservados dentro de um DNA.
B
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre genes diferentes dentro de um mesmo organismo e oferecem grande
precisão na identificação de cromossomos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.
C
Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que
o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.
D Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR basta a amplificação do gene alvo que queremos clonar.
E
O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem o DNA como material genético.
Isso facilita o processo de laboratório porque o material já está disponível para qPCR.
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Considerações �nais
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que a variação cíclica de temperatura permite a
desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os
oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases nitrogenadas.
Essas últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para podermos escolher qual a melhor técnica para cada caso: para
aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado; para síntese de cDNA a partir de RNA polaridade positiva; para quantificação de DNA ou
cDNA; e para diferenciação rápida entre diferentes produtos de amplificação.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e
na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico.
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia, mais
importante para diversas áreas das ciências biológicas.
Podcast
Para encerrar, ouça um resumo dos aspectos mais relevantes deste conteúdo.
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Referências
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CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. DBBM FIOCRUZ. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
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NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what does it mean for your PCR? NEB. Consultado na internet em:
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REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. ThermoFisher Scientific website. Consultado na internet em: 18 out.
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ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-step tripletprimed PCR and melting curve assay. PLoS ONE.
Consultado na internet em: 18 out. 2020.
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replicação do DNA.
Assista ao vídeo 4. Teste de Paternidade, de Carlos Simeão, no Youtube. Você aprenderá mais sobre a variabilidade genética estudada em
análises forenses e em testes de paternidade.
Assista ao vídeo Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D, de Carlos Simeão, no Youtube. Você irá conhecer o passo a passo da
técnica de PCR.
Para conhecer mais sobre a história do PCR, leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela polimerase (PCR).
Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR e as suas variações.