lei_de_beer

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Marcelo Francisco Pompelli
AULA 1
Introdução a Espectroscopia, 
Lei de Lambert Beer
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA
ECOFISIOLOGIA DE PLANTAS DA CAATINGA
Introdução
• Exames
– Colesterol, triglicerídeos, 
glicose, ácido úrico, etc.
• Exames
– Como eles são analisados?
O Espectrofotômetro e os medidores de sais
Tipos de Espectrofotômetro
amostra
tela de cristal 
líquido
teclado para entrada de 
informações
Tipos de Espectrofotômetro
entrada para pen drive
tela de cristal líquido ou PC?
Tipos de Espectrofotômetro
1
3
4
5
2
Lâmpada de xenon,
emissora de fonte de luz
Monocromador, funciona
como um prisma,
selecionando o
comprimento de onda
adequado
Detector de referência,
funciona para calibração
do aparelho e desconto
do “zero” de referência
Carrossel automático
para até seis
cubetas, seis leituras
ao mesmo tempo Detector, mostraráum valor, dependendo
da absorvância
Funcionamento dos Espectrofotômetros
lâmpada
emissora de luz
Mocrocromador
Intensidade de
luz incidente I0
Cubeta com a
amostra a ser
analisada
Intensidade de
luz transmida I
Detector ou tela
Vai depender do 
comprimento de onda
escolhido
1 – bacterioclorofila a
2 – clorofila a
3 – clorofila b
4 – ficoeritrbilina
5 – β-caroteno
Funcionamento dos Espectrofotômetros
• Ao passar pela cubeta é comum que a 
luz seja transmitida com características
distintas da luz emitida (ex. maior
comprimento de onda, menor energia)
Lei de Lambert-Beer
• Absorção de luz pelas moléculas
– uma ampla faixa de biomoléculas absorvem luz num determinado 
comprimento de onda
• Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm
– a medição da luz absorvida por uma biomolécula através do 
espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar 
moléculas num determinado material biológico
– Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer
• A fração de luz incidente absorvida por uma solução num 
determinado comprimento de onda é relacionada com a 
espessura do caminho óptico e a concentração da 
amostra.
A = ε c L
Absorbância ou 
absorvância
Coeficiente de extinção Molar 
(M-1 L-1 cm-1) próprio de cada 
substância a ser analisada
Caminho ótico (cm), 
profundidade da 
cubeta, geralmente 1 
cm
Concentração(M)
Lei de Lambert-Beer
• Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho 
óptico (L) maior será a absorbância da amostra, por isso 
geralmente o L é padronizado em 1 cm
• Exemplo:
– com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma solução 
com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com absortividade
molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma célula com 2,00 cm de 
caminho óptico.
– A = ε C L
– A = 313 L mol-1 cm-1 x 0,002 mol L-1 x 2 cm
– A = 1,252
– Como visto a aborbância não tem unidade
Lei de Lambert-Beer
• Como vimos a profundidade do caminho óptico interfere 
na absorbância da solução
• Porém, quando o caminho óptico é fixado (geralmente
1 cm) a absorbância é diretamente proporcional a 
concentração da amostra
• Sendo assim, deve-se ter consciência que todo e qualquer 
objeto que interrompa o caminho óptico vai “atrapalhar” a 
leitura, podendo dar uma falsa impressão de aumento da 
concentração
Coeficiente de extinção molar
• O coeficiente de extinção molar varia
– com a natureza da substância analisada 
– com o tipo de solvente utilizado
– com o comprimento de onda utilizado
– com o pH da solução
Pico máximo de absorção de luz
• Como vimos toda biomolécula apresenta um comprimento 
de onda específico onde a absorção de luz é máxima
• Mas como determinar isso para uma substância 
desconhecida?
• Simples
– varre-se a solução com diferentes comprimentos de onda
– quando se desconhece completamente a natureza da 
substância pode-se usar comprimentos de onda que vão 
desde o UV até o ultravioleta.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
300 400 500 600
580 nm
700 800 900 1000
Comprimentos de onda (nm)
A
bs
or
b â
nc
ia
Pico máximo de absorção de luz Como se calcula o coeficiente de absorção molar
• Uma vez que se tenha o pico de absorção máxima da 
molécula, basta fazer uma sequência de diferentes 
concentrações e medir a absorbância respectiva.
• De posse dos valores de absorbância, você pode calcular 
o coeficiente de extiñção molar através da fórmula A = ε c 
L
• Exemplo:
– A = 0,351 e C = 0,01563 mM L-1, qual será o ε?
– 0,351 = ε x 0,01563 mM L-1 x 1cm
– ε = 0,351 / 0,01563
– ε = 22,46 mM L-1 cm-1
Como se calcula o coeficiente de absorção molar
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
Concentração (g L)-1
A
bs
or
vâ
nc
ia
(n
m
)