Patologia Clínica II - Diagnóstico Laboratorial do HIV

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Patologia Clínica II 
Diagnóstico Laboratorial do Paciente com HIV
O agente etiológico da AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) e o vírus da imunodeficiência humana, tanto o vírus, quanto o nome da síndrome levam a denominação de “imunodeficiência”, isso ocorre porque o vírus utiliza do receptor CD4+ para infectar células imunes do hospedeiro, sendo o principal os Linfócitos TCD4+, contudo, pode acabar infectando monócitos e células dendríticas, porque essas células também podem expressar o receptor CD4+, com a infecção ocorre a destruição das células imunes, consequentemente, imudeficiencia.
Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV):
Os componentes que fazem parte do vírus são utilizados no laboratório para se diagnósticos uma infecção pelo HIV: 
· Existem 2 tipos distintos de vírus: HIV 1 e HIV 2 Sendo que a maioria é causada pelo HIV advém do tipo 1, por mais que sejam constitucionalmente distintos, morfologicamente são parecidos, de uma maneira geral o HIV é formato por uma partícula esférica. 
· Pertence a família dos Retrovírus 
· Apresenta 2 copias de RNA de cadeia simples no interior da partícula esférica.
Essa fita simples de RNA, que está presente no interior da partícula viral acaba sendo encapsulada por uma proteína denominada de Capsídeo, sendo que esse é formado exclusivamente pela p24. 
Após o capsídeo viral temos uma Matriz Proteica, constituída pela proteína p17.
Existe uma molécula chamada de Integrase, a qual é constituída pela p31, e tem como função principal promover a integração do DNA do HIV ao genoma do Hospedeiro A partir do momento que o HIV infecta as nossas células, irá ocorrer um processo de transcrição da molécula de RNA para uma molécula de DNA, consequentemente, consegue se inserir no DNA do genoma do hospedeira a partir da Integrase. 
A Protease é uma outra proteína denominada de p10 é responsável por clivar precursores proteicos em unidades ativas menores, após a liberação da partícula viral da célula do hospedeiro. 
O HIV precisa da enzima Transcriptase Reversa, que são responsáveis pela p66 e p51 para transcrever o RNA viral para uma cópia de DNA, assim, podendo integrar no DNA do hospedeiro com ajuda da integrase. 
Externamente é composto por uma bicamada fosfolipídica, a qual é proveniente da célula hospedeira onde o vírus se originou, e nessa estão inseridas duas Glicoproteínas: 
· Uma proteína transmembrana que é a gp41 Responsável pela fusão da membrana viral com a membrana com a membrana célula da hospedeira.
· E a glicoproteína gp120 Responsável por se ligar ao receptor CD4 das células imunológicas.
Em conjunto Gp120 + Gp41 Responsáveis pela ligação do vírus na membrana celular da célula hospedeira e introduza seu material genético no interior dessa célula e passe utilizar da maquinaria da célula hospedeira para produção de partículas virais.
Genoma do HIV: 
Possui 3 principais genes, que codificam proteínas estruturais e também enzimas virais e são chamados de: 
· Gag Codifica a proteína p55 sendo que a partir dela serão formadas as proteínas: p6, p9, p17 e p24.
· Pol Codifica as enzimas virais: p66 e p51 (subunidades da transcriptase reversa) e outras duas enzimas: p31 (promove integração do ácido desoxirribonucleico – DNA do HIV ao genoma do hospedeiro) e p10 (clivagem dos precursores proteicos em unidas menores).
· Env Codifica as proteínas do envelope viral, ou seja, glicoproteína 160 que é uma precursora da gp120 e gp41.
Existem vários outros genes que compõem a partícula viral, contudo, esses 3 são destacados, porque são esses responsáveis por codificar proteínas com utilidade diagnostica. 
Morfologicamente o HIV-1 e o HIV-2 são muito parecidos, pois são partículas esféricos, mas constitucionalmente são diferentes, devido ao tipo de proteína e glicoproteína presentes nos tipos.
E quando falamos do gene env, pol e gag temos a codificação de proteínas e glicoproteínas presentes no vírus.
Infecção pelo HIV:
· Realizada por vias sanguíneas com sangue contaminado, sendo que a maioria das contaminações irá ocorrer por meio de mucosa do trato genital ou retal durante uma relação sexual.
· Vertical Pode ocorrer de mãe pra filho, durante a gestação, trabalho de parto e amamentação.
Horas depois da infecção pelo HIV, ou seja, esse vírus já está no organismo, ele acaba tendo uma atração pelas células com receptores CD4, sendo que entre essas células temos: 
· Linfócitos TCD4 
· Macrófagos 
· Células Dendríticas
A partir do momento que entra no organismo dispara uma resposta imunológica inata, que vai gerar uma acumulo de células T no local da infecção, que teoricamente seria para combater o HIV, acaba favorecendo a replicação viral, porque o vírus utilizado do receptor dessas células para sua reprodução.
Então, a partir dessas pequenas populações de células que acaba se infectando pelo HIV, ele vai se disseminando, primeiramente, vai para os linfonodos locais e com o agravar da doença se dissemina sistemicamente.
Resposta Imune contra o HIV e Sintomas:
Os primeiros 10 dias pós infecção são chamados de “Fase Eclipse” Paciente possui o vírus, contudo, não conseguimos detectá-lo sericamente no plasma do paciente, por isso, o nome eclipse é uma fase obscura.
Depois desse período a replicação viral começa se tornar ativa, ou seja, passa se reproduzir e a circular livremente na corrente sanguíneo, lembrando que se o vírus está se replicando ele precisa de células com receptor CD4, principalmente, os Linfócitos TCD4, consequentemente, conforme vai aumentando o número de vírus temos uma diminuição de linfócitos TCD4 na circulação sanguínea.
Síndrome Aguda Inespecífica Em um período de 21 a 22 dias após a infecção do HIV, falamos que a viremia está associada com um declínio acentuado de linfócitos TCD4, nessa fase o indivíduo apresentará Sintomas Inespecíficos de uma síndrome viral aguda, e que não indicará para o clínico que o paciente está com HIV, pois é nesse momento que o paciente tem febre, linfadenopatia, exantema, diarreia, cefaleia, que não necessariamente são específicos a uma infecção viral pelo HIV.
Passado o período da síndrome aguda desenvolve-se uma resposta imunológica celular especifica contra o HIV, com liberação de anticorpos anti-HIV e diminuem a viremia desse paciente e favorece o restabelecimento do número de linfócitos com uma certa recuperação clínica, entrando em um período assintomático, onde continua apresentando a infecção viral, mas a viremia vai seguindo de uma maneira progressiva e lenta, onde ocorre um aumento do número de partículas viras, consequentemente, diminuição no número de Linfócitos TCD4. 
com a evolução dessa fase sem sintomas que surge em um período de 10 anos desde o início da infecção viral, o paciente começa apresentar algumas manifestações sistêmicas que são características da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida. 
Manifestação Clínica Síndrome da Imunodeficiência Adquirida O fato de ter um aumento no número de partículas virais e diminuição de linfócitos TCD4, consequentemente, paciente fica mais exposto a infecções oportunistas (fúngicas e bacterianas) e fica mais susceptível a evolução frente a qualquer tipo de infecção, isso caracteriza os sintomas específicos de um paciente com AIDS.
Essa identificação da resposta imunológica frente ao HIV é muito importante no diagnostico frente a infecção, porque se nós conseguimos avaliar a evolução da infecção e a resposta do individuo frente essa infecção, nos conseguimos detectar algumas alterações no sangue do paciente infectado, as quais consideraremos como marcadores diagnostico do HIV.
Marcadores da Infecção De HIV: 
Na corrente sanguínea:
Como qualquer outra infecção, a primeira classe que será produzida são os anticorpos IgM, como uma resposta imune primária, que tende a iniciar a sua produção cerca de 3 semanas do início da infecção, logo, não adianta mandar o paciente fazer um teste 2 semanas após a infecção, tendo em vista que não será possível detectar anticorpos.
Esse vírus é persistente e continua expondo os antígenos no nosso organismo,gradualmente, a IgM irá ser substituir do IgG, então cerca de 1 semana após o inicio da produção de IgM temos o começo de IgG. Para o HIV não conseguimos fazer a distinção de IgM para fase aguda e IgG para fase crônica, pois o IgM pode sumir na 4 semana e ser substituído por IgG, mas passar um período pode acabar surgindo na 6 semana, consequentemente, não pode ser usado como marcado de infecção recente. 
Logo, podemos encontrar IgM e IgG ao mesmo tempo, então não é aconselhável a dosagem desses para distinguir uma infecção recente para uma infecção crônica de HIV, porque o IgM pode sumir e passado um tempo por reaparecer, isso ocorre devido ao HIV ser um vírus muito mutável, fazendo o surgimento de novos moléculas IgM.
Geralmente são dosadas a dosagem de anticorpos totais, que irá ver IgM + IgG para diagnosticar um paciente com HIV, mas não será feito uma distinção entre esses anticorpos. 
Logo o inicio da infecção, ou seja, passado o período de Fase Eclipse começa ter a produção de particulares virais, consequentemente, é possível começar a detectar, cerca de 2 semanas (14 dias) é possível identificar a presença do RNA viral nesse indivíduo.
Além de poder ser feito uma dosagem da p24, que é uma proteína que está presente no Capsídeo.
Detecção do HIV: 
Esses exames são para diagnóstico do paciente, contudo, também é feito a triagem sorológica do sangue que é doado, através de técnicas aprimoras, isso é feito para garantir a segurança na transfusão e órgão para transplante, para que não ocorra contaminação de paciente. 
Além disso a detecção do HIV através de técnicas laboratoriais também muito utilizado para estudos de vigilância epidemiológica para saber como uma determinada população está se comportando frente a uma infecção do HIV, se os indivíduos tiveram ou não contato com esse vírus.
Temos os: 
· Testes Rápidos: Triagem de pacientes com HIV Avaliam a presença de anticorpos totais do paciente, se teve ou não exposição ao vírus HIV. 
Diagnóstico: 
· ELISA Visa avaliar/identificar a presença de anticorpos totais contra o HIV, mas o teste de ELISA possui uma alta especificidade quanto em comparação aos testes rápidos.
· Complementares Teste de westernblot (WB), imunoblot (IB), imunoblot rápido, etc. Visam identificar a produção de anticorpos, contudo, são específicos contra determinadas proteínas ou glicoproteínas que compõem o HIV, portanto, é um pouco mais especifico quando comparado ao ELISA. 
· Moleculares Visam identificar especificamente o vírus, tanto na forma de RNA, quanto na forma de DNA através da técnica de PCR. 
Monitoramento: 
Existem alguns exames que são utilizados para o monitoramento que já são diagnósticos com HIV: 
· Contagem de Linfócitos TCD4 
· Carga Viral 
Também são testes moleculares, utilizando a técnica de PCR, conforme tem uma maior carga viral, temos uma menor contagem de linfócitos, ou seja, são inversamente proporcionais, e quanto maior a carga viral pior o prognostico do paciente. 
Triagem do Paciente com HIV: 
· Teste rápido (sangue total ou fluido total) – resultado em período máximo de 30 minutos 
· É um imunensaio simples Detecção de anticorpos totais anti-HIV 
Os testes rápidos tem que seguir algumas recomendações governamentais, no sentido de: 
· Precisam ter uma Especificidade maior ou igual a 99% e Sensibilidade maior ou igual a 99.5% Para garantir que seja um teste que confira um resultado confiável para triar o sangue desse paciente.
Existem vários formatos disponíveis, sendo que os mais frequentemente utilizados são: 
· Imunocromatografia de fluxo lateral É necessário obter uma amostra do paciente, pode ser tanto de sangue total ou fluido oral, essa amostra é adicionada na área de amostra, junto com a amostra biológica do paciente e colocado uma situação tampão, espera-se que se esse paciente tem a produção de anticorpos, esse irão migrar para a área teste, onde tem a presença de antígenos fixados, onde se tiver positividade irá aparecer uma coloração do teste e uma coloração vermelha na área de controle, se o controle não for positivo, significa que o teste está corrompido, ou seja, não é valido, tem que fazer outro.
· Imunocromatografia de duplo percurso Amostra adicionada na área 1 e na área 3 o tampão, consequentemente, tendem a migrar para área teste, se for positivo teremos a linha vermelha no teste e no controle, lembrando que se o controle for negativo, o teste está corrompido.
· Imunoconcentração A amostra do paciente é colocada diretamente na área T e coloca a solução tampão no mesmo lugar, se tiver anticorpos presente na amostra eles irão se ligar aos antígenos gerando uma alteração na coloração, onde o controle também deve ser positivo.
Teste positivo + Controle negativo Teste corrompido, devemos fazer uma nova coleta e refazer o teste.
Triagem do Paciente com HIV:
Os testes rápidos são utilizados para triagem e estamos em um local que temos a disposição de laboratórios clínicos para investigar se o paciente está ou não com HIV, se der positivo é aconselhável que o paciente prossiga para um laboratório especializado para confirmação do diagnostico desse paciente.
Contudo, existem locais no Brasil, onde não temos a disposição de fazer um teste mais confiável para detecção do HIV, consequentemente, nessas localidades o teste rápido pode ser utilizado para diagnostico de HIV.
Portanto: Em apenas em alguns locais específicos utilizamos os testes rápidos para diagnostico.
Fluxograma: 
· Coletamos a amostra do paciente e amostra de sangue da positiva, ou seja, o teste foi valido e o controle funcionou e o teste foi positivo Sugere para que o paciente faça um novo teste rápido, para confirmação se realmente o paciente tem um contato com o HIV. 
· Segundo teste rápido positivo Paciente deve prosseguir para exames laboratoriais mais específicos para confirmar o diagnostico e começar o tratamento para o HIV. 
· Caso o teste rápido seja validado (controle positivo) e o teste negativo Exclui a possibilidade de o paciente ter contato com o vírus do HIV. 
· Em alguns locais o teste rápido pode ser utilizado para diagnóstico.
Diagnóstico do Paciente com HIV: 
ELISA de 4 geração:
· Teste irá detectar de maneira simultânea tanto anticorpos totais (IgM + IgG) + antígeno p24 Único ensaio que possibilidade a detecção desse dois.
· Esse ensaio apenas consegue ser realizado, após 15 dias do contato com o vírus, porque temos o Período Eclipse.
· Portanto, se é um individuo que chega com história de relação sexual com uma pessoa que possui HIV há 1 semana não é indicado um teste de ELISA. 
Utiliza-se uma plaquinha, que no fundo do pocinho de cada plaquinha já estará sensibilizado com anticorpos anti-p24 e também terá alguns antígenos específicos que fazem parte do HIV, o objetivo é que se tenho anticorpos e antígeno presente na amostra do paciente irá se ligar ao anticorpo ou então se o anticorpos presentes na amostra se ligarão ao antígeno.
É um tipo de teste enzimático, onde vai ter uma mudança de coloração, o que indica que está presente nessa amostra a presença de antígeno ou anticorpos anti-HIV. 
É um teste muito mais confiável do que o teste rápido, que apenas pode ser utilizado após 15 dias do contato do indivíduo. 
Teste Complementares: 
Recentemente foram adicionados ao diagnostico com o paciente com HIV, uma vez que esses testes irão auxiliar no esclarecimento de alguns resultados de pacientes que tem uma infecção por HIV, ou seja, fazem parte daquele período de síndrome viral inespecífica.
Geralmente, utilizados posteriormente ao teste de ELISA em pacientes com a presença de antígenos p24 e ausência de anticorpos totais. 
· Testes complementares: Westernblot (WB), imunoblot (IB), imunoblot rápido (IBR) ou imunofluorescência indireta (IFI).
· Esses testes farão a detecção de anticorpos IgG específicos para cada proteína ou glicoproteína do HIV Um pouco mais especifico quando comparado a teste de ELISA.
Existem algumas membranas por eletroforeses em que as proteínas do HIV são separadas e, consequentemente, são transferidas para umamembrana de westernblot (WB), a qual apresenta alguns peptídeos diretamente relacionada com a presença do HIV, essas membranas serão intubadas no soro do paciente e caso ocorra a reação de anticorpos com essas membranas iremos conseguir observar a presença de bandas e conseguimos especificar que o paciente possui anticorpo especifico para cada proteína ou glicoproteína.
Testes Moleculares: 
· Visam a detecção direta do antígeno, através da detecção do RNA ou do DNA pró-viral pela técnica de PCR, essa detecção é indica quando o paciente faz o teste de ELISA e não identificada a produção de anticorpos e prossegue para um weternblot (WB), o qual também não consegue fazer a detecção
· Porque não faz diretamente o WB? É uma técnica cara, é um teste que nem sempre dá certa, não possui uma padroniza correta, consequentemente, nem sempre consegue ser o suficiente para fazer o diagnóstico, portanto, o ELISA vem em primeiro lugar, o WB em segundo lugar e em sequência o Teste molecular onde não teremos dúvida alguma.
Quando utilizar o teste molecular para diagnóstico: 
· Menores de 18 meses Não tiveram produção de anticorpos próprios contra o HIV, Crianças nascidas de mães soro positivas podem adquirir anticorpos anti-HIV de maneira passiva, logo, estaremos analisando os anticorpos da mãe e não da criança.
· Adultos na fase aguda da infecção Adultos que ainda não soroconverteram, ou seja, não tem detecção no ELISA, contudo, quando fazemos o teste molecular identificamos uma grande quantidade de partículas virais presentes na amostra. 
Coletamos a amostra do paciente, a primeira recomendação e fazer o teste de ELISA, que irá ver os anticorpos totais e presença p12 na amostra do paciente. 
· Se essa amostra der positiva é indicado fazer um segundo teste, o qual é um Teste Molecular, o qual se der positivo, ou seja, resulta maior ou igual de 5.000 mil copias Fecha diagnostico de HIV. 
· Se essa amostra der positiva é indicado fazer um segundo teste, o qual é um Teste Molecular, o qual se der negativo, ou seja, resulta menor 5.000 mil copias Realização de WB ou IB ou IBR para avaliar se tem a produção de anticorpos específicos para proteínas e glicoproteínas do vírus, se der positivo fechamos o diagnostico e se der negativo damos como uma amostra indeterminada, com isso, sugerimos que o paciente refaça o exame após 30 dias. 
Estágios da Infecção por HIV e Exames Laboratoriais: 
A partir dos exames foi estabelecido uma classificação, chamada de: 
Classificação de Fidedig Mostra qual teste é o mais recomendado para o paciente, a partir do momento que o paciente foi entrado em contato com o vírus. 
· Fase Eclipse Fase 0 
· Fase 1 Conseguimos detectar o RNA viral através do PCR
· Fase 2 Possível detectar proteína p24 pelo método de ELISA
· Fase 3 Possível detectar anticorpos totais 
· Fase 4 Conseguimos fazer avaliação do RNR viral (PCR), avaliar o p24 por ELISA, dosar os anticorpos totais por ELISA e avaliação por WB, onde não é possível apenas avaliar a proteína p31, porque essa demora um período para ser produzida e detectada na corrente sanguínea do paciente.
· Fase 5 Conseguimos fazer todos os exames e detectar a proteína p31 
· Fase 6 Avaliação de todos os exames anteriormente relacionados 
Linha Tracejada A linha vermelha denota a presença do RNA viral, enquanto essa linha denota um limite de detecção de RNA viral no plasma do paciente, logo, para fazermos uma quantificação do RNA viral no soro do paciente é necessário no mínimo é ne 100 copias de partículas virais.
Podemos reparar que em cada estágio nos conseguimos adicionar um exame para identificação de algo especifico do HIV no soro do paciente e conseguir diagnosticar o paciente com a infecção viral.
Monitoramento do Paciente com HIV: 
Existem testes de monitoramento para pacientes com HIV: 
Esse teste se baseia na contagem de linfócitos TCD4: 
· Essa avaliação é feita pela Citometria de fluxo (CD3, CD4 e CD8) O intuito é que quanto menor foi a quantidade de linfócitos TCD4 presentes no paciente maior a gravidade do paciente.
Depleção progressiva indica maior gravidade da doença:
VR: 500 – 1300 células/μl (38-65%).
· < 200 células/μl (<14-16%) – maior susceptibilidade para infecções oportunistas.
· <50-100 células/μl (<5-10%) – Enquadra o paciente AIDS Paciente extremamente vulnerável, provavelmente, já apresenta uma infecção oportunista frente essa diminuição expressiva de linfócitos no sangue periférico.
Geralmente, quando fazemos a contagem de Linfócitos TCD4 prosseguimos para a avaliação da Carga Viral do paciente: 
· Carga Viral: quantificação de partículas virais plasmáticas Feita Técnica de PCR. 
Se tenho uma baixa nos linfócitos TCD4 temos um aumento na carga viral, eles são inversamente proporcionais: 
· Menor que10.000 cópias RNA/mL – baixo risco de progressão/piora da doença.
· 10.000 – 100.000 cópias – risco moderado.
· Maior que 100.000 cópias – alto risco de progressão e piora
Quando pedimos a dosagem da Carga Viral? 
· Progressão da doença no paciente
· Prognóstico do paciente
· Resposta anti-retroviral Avaliar se o medicamento passado para o paciente está fazendo efeito ou não, se o paciente está respondendo bem aquele medicamento.
Exames Complementares: 
Além dos exames utilizados para Triagem, Diagnóstico e Monitoramento do paciente com HIV, outros exames laboratoriais devem ser solicitados para avaliar as condições gerais do paciente: 
· Hemograma Avaliar se o paciente possui uma anemia, leucopenia, linfopenia, plaquetopenia, as quais são situações que podem piorar a situação do paciente.
· Testes de função hepática e renal Ver se tem alguma alteração hepática ou renal frente a administração medicamentosa, pois são medicamentos que podem causar efeitos colaterais.
· Sorologias: sífilis, hepatites e toxoplasmose Geralmente, os pacientes que possuem HIV possuem coinfecção com sífilis, vírus da hepática, o que acaba agravando o caso, e a toxoplasma é importante avaliar se ocorreu exposição previa para o Toxoplasma Gongi, tendo em vista que o paciente está imunossuprimido e pode vim apresentar essa doença
· PPD – tuberculose Coinfecção com tuberculose, o que pode agravar mais ainda o quadro do paciente.
· Papanicolau O vírus do HIV acaba propiciando uma atuação do HPV e favorecer o desenvolvimento de um câncer de colo do útero, contudo, o HIV não é um vírus oncogênico, logo, por si só não tem capacidade de ocasionar nem um tipo de neoplasia.
HIV – AIDS: 
O acompanhamento continuado das recomendações vigentes é essencial para atuação profissional responsável e eficiente.
· Departamento de Vigilância, Prevenção e Controle das Infecções Sexualmente Transmissíveis, do HIV/AIDS e das Hepatites Virais, Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde. É essencial que os profissionais da saúde que atuam nessa área sempre estejam atualizando tanto para diagnóstico, quanto para o tratamento dos pacientes com HIV.