Biologia Molecular - DNA Recombinante

Prévia do material em texto

Aula 10 – Tecnologias do DNA recombinante
O DNA recombinante é uma molécula de DNA formado por segmentos de DNA de origens diferentes, podendo ser feito por fragmentos de espécies diferentes ou simplesmente alterar artificialmente de forma direta a estrutura do DNA. Um exemplo seria fazer um gene específico ter uma expressão maior do que o normal, chamada de sobrexpressão.
O vetor de DNA é um veículo portador que pode conter uma sequência de DNA exógena e/ou heteróloga. Necessita da replicação de forma autônoma em um hospedeiro compatível. 
Exemplos de vetores:
	Plasmídeos naturais ou sintéticos (Mais utilizados por causa de seu manuseio mais fácil comparado aos outros)
	Cosmídeos (Mistura entre um plasmídeo e um vírus)
	Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
	Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
Plasmídeo
O processo de obtenção de um DNA recombinante é dado da seguinte maneira:
	O gene de interesse é “cortado” do DNA original
	O plasmídeo é aberto por uma enzima de restrição
	Com a ajuda de uma ligase o gene de interesse se liga ao plasmídeo na região aberta
	O plasmídeo com o gene é inserido em uma bactéria como E.Coli (Transformação). Utilizando choque térmico ou choque elétrico para controlar a resistência da membrana plasmática da bactéria, assim, permitindo a entrada do plasmídeo. Também pode ser feito via microinjeção.
	A bactéria se replica, multiplicando a quantidade do gene de interesse ligado ao plasmídeo
	Há a remoção do plasmídeo das bactérias
pBR322 – 1º plasmídeo obtido e laboratório. Possui genes ampR e tetR que dão resistência a antibióticos específicos, ampicilina e tetralina, respectivamente. Consegue fazer autoreplicação. Com a inserção de outro gene no BamH1, o tetR para de expressar, perdendo a resistência ao seu respectivo antibiótico. Dessa maneira, é possível saber se o plasmídeo obteve o gene de interesse, já que, ao inseri-lo em um meio com Tetracilina, ele não irá sobreviver devido a perda da resistência.
pUC8 – Plasmídeo com gene ampR e lacZ’, produzindo resistência a ampicilina e beta-galoctosidase. A beta-galoctosidase produz Xgal, que dá coloração azul ao produto. Logo, para saber se houve o inserto, basta olhar a cor das colônias. Possui vários sítios de enzima de restrição.
Cosmídeo 
É uma combinação entre um plasmídeo e um bacteriófago. Possui a capacidade de clonar 25-45 kpb, o que é maior quando comparado a plasmídeos, que perde a capacidade replicativa em segmentos longos de DNA. 
Etapas da obtenção do inserto:
	Ligação de fragmentos de DNA entre dois sítios cos
	DNA concatemérico
	Vitropackaging para introduzir o DNA na cabeça do fago para formar a partícula madura do fago
	Introdução do DNA clonado na bactéria, por meio da infecção dela pelo fago em que está inserido o cosmídeo
BAC’s 
Capaz de clonar até 300 kpb. É um vetor de cópia única e possui uma manutenção estável durante gerações.
YAC’s
Possui marcador de seleção de levedura e de bactéria, múltiplo sítio de restrição, telômeros, centrômeros, origem de levedura e origem de bactéria, permitindo que ele seja replicado dentro de bactérias e de leveduras. A vantagem de poder replicar em ambas bactérias e leveduras é que a E. Coli produz um resultado de réplicas muito maior que uma levedura. Durante o processo de replicação, primeiro a réplica ocorre dentro de uma bactéria e depois passa para a levedura. 
É capaz de clonar até 3000kpb, é utilizado para mapeamento físico e é mantido como cromossomo linear. A marca de seleção (URA), uma marcação autsotrófica, faz com que os YAC’s só cresça na presença de uracila.
Genomas Virais
Há bacteriófagos que são letais para bactérias, funcionando como antibióticos muito eficientes.
Ciclo lítico – Bacteriófago interage com a bactéria, injetando seu DNA dentro dela, assim, produzindo novos fagos. Ao final do processo. A bactéria é rasgada e os fagos liberados.
Ciclo lisogênico – Bacteriófago injeta seu DNA dentro da célula, onde o DNA se integra ao cromossoma da célula. Desse jeito, o DNA é replicado dentro da célula, sendo tratado como parte integrante do cromossoma celular. A lise da célula e liberação do DNA viral ocorre quando a célula estiver em alto estado de reparo, com a RecA ativa, removendo a repressão do sistema de reparo.
Genoma do bacteriófago lambda – Possui região para a produção dos capsídeos, integração do seu material genético no hospedeiro, replicação do seu DNA e lise da célula hospedeira. Seu genoma é linear. 
OBS: IS = Insertion Sequence
Transposon
Conhecido como jumping genes. Possuem naturalmente uma marca de resistência. Possuem genes que expressam proteínas.
Tn9 possui resistência a chloramphenicol e Tn10 possui resistência a tetraciclina.
Transposição replicativa – É sintetizada uma cópia do transposon e esta cópia que é utilizada.
Transposição conservativa – É utilizada o próprio transposon.
Enzimas de restrição
São enzimas que possuem a atividade de hidrolisação de ligações fosfodiester. Enzimas de restrição vão funcionar em segmentos específicos do gene, hidrolisando as ligações fosfodiester.
Tipo I – Composta por 2 ou 3 cadeias polipeptidicas diferentes. 
Tipo II – Possui sistemas de restrição e modificação separados. Reconhece uma região de corte, fazendo a hidrólise somente nesta região.
Tipo III – Possui sistemas de restrição e modificação na mesma enzima.
Fora das condições ideais de pH e temperatura, a enzima de restrição pode cortar fora de sua região específica (palíndromo).
Clonagem
1. Preparação do vetor – Escolher e extrair o vetor de uma célula o mais puro possível. Utiliza-se 2 enzimas de restrição para digerir o plasmídeo, para direcionar cada extremidade e gerar terminais compatíveis com o inserto. Alternativamente, pode-se ligar linkers às extremidades com sítio de restrição desejado.
2. Ligação do vetor e inserto 
3. Transformação do hospedeiro
4. Seleção de clones 
Tipos de vetores:
	Vetores Integrativos – Sequências homólogas ao cromossomo de levedura com deleções (permitindo a integração do vetor), vetores são linearizados por digestão com enzimas de restrição e a integração resulta em duas cópias idênticas da região alvo de integração flanqueando o gene heterólogo inserido.
	Vetores Epissomais – Possuem replicação autônoma, apresentam número variável de cópias por célula, manutenção celular instável, maioria desses vetores apresenta sistema de seleção por supressão auxotrófica e pode haver inserção do vetor inteiro.
	Vetores Centroméricos – Possuem um fragmento de DNA correspondente a região centromérica, permite a replicação autônoma na levedura, manutenção celular estável e baixo número de cópias por célula.
	Vetores de Expressão - São vetores de clonagem capazes de promoverem a transcrição e tradução da célula. 
Construção de Bibliotecas – Biblioteca genômica é um conjunto de clones de DNA que contém todo o conteúdo de DNA de um genoma do qual a biblioteca derivou. Você fragmenta um cromossomo e o liga novamente de forma aleatória, e então o clona com plasmídeos.