Haploides

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Técnicas Haplóides	
Durante uma triagem sistemática das reações de várias partes das flores de Datura innoxia cultivadas in vitro, Guha e Maheshwari (1964) observaram o desenvolvimento de plantas haplóides a partir de anteras contendo micrósporos imaturos. Mais tarde, especialmente as anteras do tabaco foram extensivamente investigadas por vários grupos de pesquisa, e principalmente micrósporos desta espécie foram utilizados para testar a adequação desta técnica para programas de melhoramento híbrido. Entretanto, a produção de haplóides de várias centenas de espécies de plantas tem sido relatada na literatura (ver Kumar e Sopory 2010; Saikat et al. 2011). A reprogramação do desenvolvimento dos micrósporos em direção à embriogênese e à formação de plantas haplóides torna a cultura isolada de micrósporos um sistema gratificante no campo da biologia molecular e da biotecnologia das plantas. A transformação dos micrósporos e dos embriões derivados produzirá linhas homozigóticas (duplo haplóides) que poderão ser utilizadas posteriormente para fins de reprodução. (Kumar e Roy 2006, 2011; Kumar e Sopory 2008). Destes, apenas alguns foram utilizados, com sucesso limitado, em programas de melhoramento; algumas razões para isso serão discutidas mais tarde.
6.1 	Possibilidades de Aplicação
Um pré-requisito para usar o efeito de heterose reproduzível no melhoramento híbrido é a disponibilidade de linhagens parentais homozigotas. A produção de tais linhagens endogâmicas requer muitos retrocruzamentos de material parental heterozigótico. Linhagens consanguíneas com propriedades desejadas também são necessárias para a exogamia de espécies de plantas. Uma redução considerável do tempo necessário para produzir tal material vegetal pode ser alcançada pelo uso de haplóides. Plantas superiores haplóides são inférteis e, portanto, antes que os haplóides possam ser usados em programas de melhoramento, é necessária uma diploidização (por exemplo, usando colchicinas ). Com os métodos descritos posteriormente, tais plantas dihaplóides podem ser produzidas idealmente dentro de 1 ano. Considerando o tempo necessário para a seleção de plantas haplóides para posterior utilização no melhoramento híbrido e a propagação das plantas selecionadas (geralmente por enraizamento), são necessários cerca de 5 anos para produzir as primeiras sementes híbridas. Um cronograma para a produção de um híbrido de tabaco, desde os tempos pioneiros da técnica, pode ser visto no resumo a seguir:
· 1976: cultura de anteras e criação de plantas haplóides
· 1977: propagação por estacas e seleção de ramos diplóides para enraizamento
· 1978: propagação de plantas dihaplóides por enraizamento
· 1979: polinização cruzada de pais dihaplóides selecionados
· 1980: plantio de híbridos F1
Vários métodos têm sido utilizados para a diploidização de haplóides, dos quais apenas dois serão mencionados aqui. O método de Jensen (1974, 1986), originalmente descrito para cevada, utiliza plantas jovens (estágio de cinco folhas) submersas em uma solução de 0,1% de colchicina (sem clorofórmio) contendo 2% de DMSO e 0,2–0,5 ml de Tween por 5 horas em a luz a 20–22 ◦ C. Para dicotiledôneas, o método de Ockendon (1986) será
descrito. Aqui, uma solução de colchicina a 0,05% é aplicada diretamente no ápice do caule de uma planta jovem, com uma microseringa (10 μl ). Uma alternativa é a aplicação com algodão embebido na solução de colchicina. Para ambos os métodos, foi relatado um sucesso de mais de 70%.
Na verdade, três abordagens experimentais estão disponíveis para produzir plantas haplóides:
(1) o método de cultura de anteras ou de micrósporos derivados delas, (2) a embriogênese de óvulos não fertilizados isolados e (3) produção de híbridos de espécies das quais o conjunto de cromossomos de um dos pais foi eliminado durante o desenvolvimento . Antes de ser dada uma descrição detalhada do primeiro método, os outros dois serão brevemente resumidos.
O exemplo agora clássico para a utilização da hibridização interespécies é uma polinização cruzada de Triticum aestivum e Hordeum bulbosum (o método bulboso ). Aqui, um conjunto de cromossomos ( Triticum ) é organizado na metáfase, enquanto o do outro progenitor permanece desorganizado na célula e é perdido durante as divisões celulares seguintes. Para o método bulbosum , Hordeum vulgare também pode ser usado como progenitor adequado (Fig. 6.1), e haplóides, isto é, dihaplóides , obtidos por este método foram logo usados em programas de melhoramento (Kasha e Rheinsberg 1980). Cinco anos após o início deste programa de melhoramento, a primeira nova variedade (Mingo) estava disponível. Durante as últimas décadas, muitos mais exemplos de híbridos interespécies foram relatados, e um resumo pode ser obtido em Gernand et al. (2005). Neste artigo são descritos experimentos para acompanhar também o destino dos cromossomos do parceiro “perdedor” da hibridização do milheto de trigo, por eliminação. Todos os cromossomos do milheto foram eliminados entre 1 e 3 semanas após a polinização. A eliminação cromossômica envolve a formação de extrusões nucleares e a formação pós-mitótica de micronúcleos cuja cromatina é posteriormente fragmentada.×
V
B
50-90%
fruit set
20-100%
embryos
30-75%
monoploids
Incompatible 2-15 %
embryos
2-15 %
hybrids
V
VB
GYNOGENE MONOPLOIDS
CHROMOSOME DOUBLING
HYBRIDS
75-100% double monoploids
DOUBLE MONOPLOIDS, FERTILE
VV
VVBB
DOUBLE HYBRIDS, FERTILE
Fig. 6.1 Resultados do cruzamento de Hordeum vulgare ( V ) e Hordeum bulbosum ( B ). Observe a alta porcentagem de frutificação (50–90%) com 20–100% de desenvolvimento embrionário (após Jensen 1986)
Como será discutido mais tarde, as plantas produzidas por tais métodos apresentam um grau mais elevado de estabilidade citogenética, em comparação com aquelas derivadas pelo método de cultura de anteras. Enquanto, em princípio, o método das anteras ou micrósporos é aplicável a todas as plantas, o método bulboso depende da disponibilidade de espécies parentais adequadas.
Embora basicamente exista a possibilidade de obtenção de material vegetal haploide por meio do cultivo de óvulos imaturos, devido ao fácil manuseio das anteras, seus micrósporos são preferidos. Um resumo sobre ginogênese foi publicado há alguns anos por Keller et al. (1987), em que são listados nove exemplos de sucesso: Hordeum , Triticum , Oryza , Beta vulgaris , Gossypium , Ephedra , Nicotiana , Crepis , e Lolium . Nos últimos anos, tem havido pesquisas intensificadas para explorar o
possibilidade de ginogênese – vamos esperar e ver!
Uma comparação de plantas derivadas androgenéticas e ginogenéticas será fornecida abaixo. Um exemplo é o uso de protoplastos de óvulos dissecados. Enquanto os protoplastos não fertilizados da cevada não se dividiram, os fertilizados desenvolveram-se em microcalos e , se co-cultivados com micrósporos em embriogénese, estes desenvolveram estruturas embrionárias e eventualmente plantas férteis. Se cultivados sozinhos, esses microcalos degeneraram (Holm et al. 1994). Outra forma é usar um método de imersão floral, como para Arabidopsis para transformação genética com Agrobacterium tumefaciens carregando o gene GUS e o promotor 35S, 5 dias ou mais antes da antese. A atividade de GUS foi detectada apenas em óvulos em desenvolvimento, e não em pólen ou tubos polínicos. Esta seletividade pode ser devida ao caminho especial de desenvolvimento das flores de Arabidopsis . Aqui, o gineceu se desenvolve como uma estrutura aberta para formar lóculos fechados cerca de 3 dias antes da antese ( Desfeux et al. 2000).
Podem ser encontrados relatos descrevendo superioridade para plantas androgênicas, outras para ginogênicas, muitas vezes apenas em uma ou outra característica. A androgênese, entretanto, foi geralmente considerada mais eficiente que a ginogênese (Foroughi-Wehr e Wenzel 1993); o sucesso de ambas as técnicas parece controlado geneticamente e podem ser observadas amplas variações de genótipos. Num sistema de tabaco, os haplóides duplos de origem ou de auto-progénie eram quaseiguais, mas o material androgénico exibia mais vigor e era altamente variável ( Kumashiro e Oinuma 1985). Um artigo mais recente compara plantas monoplóides androgênicas e ginogênicas de Solanum phurea (Lough et al. 2001). Em contraste com as plantas ginogênicas, as plantas androgênicas tiveram um aumento no tamanho das folhas de 15 a 20%, e a produção total de tubérculos foi cerca de duplicada ou triplicada. A altura das plantas, no entanto, foi significativamente reduzida nas linhagens androgênicas. A ginogênese é frequentemente empregada para superar a alta porcentagem de plantas albinas frequentemente observada em sistemas androgênicos.
Outra possibilidade de obtenção de plantas ginogênicas seria a utilização de pólen irradiado com raios X para fertilização. Isto deverá tornar o pólen inativo como doador de genes, mas ainda capaz de induzir a divisão celular do óvulo. Poderia ser produzido material vegetal obtido sem fertilização e apenas com o conjunto materno de material genético.
6.1 Antecedentes Fisiológicos e Histológicos
Em muitas publicações, a exigência de estresse é descrita como um pré-requisito para induzir o desenvolvimento androgênico. A necessidade de um tratamento de estresse depende da espécie da planta, bem como do genótipo da espécie. Isto pode ser fome e stress osmótico induzidos por um suplemento de manitol ao meio de cultura, como no caso da cevada, ou uma combinação de fome e choque térmico para o tabaco e o trigo, ou apenas choque térmico para a colza e a pimenta. Outros fatores de estresse podem ser colchicinas , falta de nitrogênio (Heberle- Bors 1983), irradiação gama ou choque frio; um resumo é fornecido por Maraschin et al. (2005). Em outros relatos, a androgênese pode ser induzida sem um tratamento de choque óbvio. Considerando a alta concentração de sacarose (2% e mais) na maioria dos meios, a transferência de tecido isolado já provoca algum estresse osmótico. Além disso, o confronto de células in vitro com concentrações frequentemente bastante elevadas de fitohormonas em sistemas embriogénicos deve ser considerado um factor de stress. Aqui, as influências positivas do ABA na embriogênese coincidem com as do estresse osmótico. Também para a indução da embriogênese somática, vários fatores de estresse estão sendo discutidos como necessários, como ferimentos, estresse osmótico, fome e íons de metais pesados. Freqüentemente, a separação dos explantes de sua origem na planta intacta e a formação de uma ferida no explante são considerados fatores de estresse e pré-requisitos para induzir a embriogênese somática. A relevância desses fatores é discutida em outro lugar. Na verdade, em comparação com as células da planta mãe original, todos os sistemas de cultura in vitro incorrem em condições de stress para as células dos explantes cultivados.
Para induzir o potencial para a embriogênese somática, a desdiferenciação ou melhor, a transdiferenciação (ou, mais moderna, a reprogramação) de micrósporos, óvulos ou células somáticas é um pré-requisito que é provocado pelo ambiente sob condições in vitro - por exemplo, meio nutriente e temperatura.
Seguindo Maraschin et al. (2005), o desenvolvimento androgênico, e provavelmente qualquer outra embriogênese somática, consiste em três fases principais: aquisição do potencial embriogênico, início da divisão celular e formação de padrões das células em divisão. Inicialmente, um estresse (ou fitohormônios) induz uma reprogramação do metabolismo celular , incluindo uma repressão da expressão gênica relacionada à biossíntese do amido e a indução de genes proteolíticos e genes relacionados ao estresse . Isto é seguido pela ativação de reguladores-chave da embriogênese – por exemplo, o chamado fator de transcrição BABY BOOM. Após a indução da divisão celular durante a formação do padrão dos embriões, a morte celular programada parece também desempenhar um papel essencial. Isto está aparentemente relacionado com a perda de ATP extracelular (Chivasa et al. 2005), até à data de função pouco clara.
O rearranjo metabólico pode ser provocado pelo sistema proteossômico da ubiquitina 26S , que degrada moléculas; está envolvida a autofagia para degradação e reciclagem de organelas em animais por meio de lisossomos e em plantas por meio de vacúolos. Os produtos de degradação são eventualmente metabolizados.
Idealmente, a indução da androgênese consiste basicamente na indução da embriogênese somática em micrósporos após isolamento da planta mãe. Em muitos casos, porém, pode-se observar inicialmente a formação de um calo, no qual posteriormente se desenvolvem embriões. Ainda mais frequentemente, a formação de raízes e rebentos ocorre primeiro, e ambos se unem mais tarde para produzir uma planta intacta.
No estágio de desenvolvimento adequado (ver, por exemplo, Fig. 6.2), os botões florais esterilizados na superfície são abertos sob condições estéreis, e as anteras são cortadas por meio de uma pinça e colocadas em meio ágar (ver Fig. 6.3). Um meio adequado é fornecido na Tabela 3.4 (ver também meio NN). Duas ou três semanas depois, pode-se observar o aparecimento dos primeiros embriões (Fig. 6.3). Altamente significativo para o sucesso é o estágio de desenvolvimento adequado das anteras, ou seja, de seus micrósporos. O estágio ideal para os micrósporos do tabaco é a primeira mitose que produz o primeiro núcleo vegetativo e o primeiro núcleo generativo. Até onde se sabe, o embrião haplóide se desenvolve a partir do núcleo vegetativo. Existe alguma correlação aproximada entre o desenvolvimento do botão da flor e o do pólen, fornecendo diretrizes para o estágio de desenvolvimento adequado para a obtenção das anteras para o experimento. Para o tabaco, este estágio é alcançado assim que a corola pode ser vista emergindo do cálice (Fig. 6.2). Ao colocar os botões cortados durante a noite no frigorífico antes de retirar as anteras, pode ser alcançado um aumento de 10-15% no número geralmente baixo de plantas haplóides (normalmente abaixo de 0,1%).
Fig. 6.2 Isolamento de anteras (após Reinert e Yeoman 1982)
Fig. 6.3 Vários estágios da cultura de anteras . (Superior) anteras de Datura em ágar, (meio) início do desenvolvimento embrionário em uma antera rompida, (inferior) estruturas embrionárias isoladas de uma antera androgênica (fotografias de E. Forche)
Heberle- Bors (1983) relata resultados sobre alguns fatores que são significativos na determinação do potencial para realizar a androgênese e, conseqüentemente, o sucesso por configuração experimental. O tabaco foi usado como modelo. Para começar, foi observado um dimorfismo do pólen em anteras maduras. O pólen infértil, denominado pólen P, é embriogênico e pode ser separado do pólen fértil por centrifugação em gradiente de densidade. O pólen P ocorre principalmente em situações de estresse que promovem a esterilidade masculina. Exemplos disso são condições de dias curtos, baixa temperatura ou deficiência de nitrogênio. Nestas condições, a eficiência do tecido nutritivo da antera, isto é, o tapete, é restringida ou perturbada, e o pólen não consegue desenvolver-se até à maturidade. A quantidade de pólen P também pode ser aumentada por uma aplicação de substâncias de crescimento que promovem a esterilidade masculina (auxinas, antigiberelinas ) e, portanto, o seu aumento não se deve apenas à perturbação do sistema nutricional da antera. Além disso, também as plantas com esterilidade masculina de base genética geralmente exibem um alto potencial de androgênese.
Além das influências das variações nas condições de crescimento da planta-mãe no sucesso na produção de plantas haplóides a partir de seus micrósporos, um sistema experimental para aumentar a produção de plantas haplóides a partir de plantas-mãe normais e saudáveis é descrito por Moreno et al. (1989). Aqui, os micrósporos em um estágio inicial de desenvolvimento (estágio inicial de dois núcleos) são cultivados em um meio nutriente sem açúcar (para preservar as condições isoosmóticas , a sacarose é substituída por manose) por 1semana, resultando em uma predominância de pólen P. A abundância de plantas haplóides parece ser limitada apenas pela taxa de sobrevivência do pólen após este tratamento.
6.3 	Métodos para Aplicação Prática
Basicamente, estão disponíveis dois métodos, que são praticados com muitas variações. No primeiro método, que parece ser o mais original, colocam-se anteras inteiras em meio ágar e, no segundo, as anteras são cultivadas em meio líquido no qual o pólen é liberado por agitação. Utilizando anteras de tabaco, será dado um exemplo para cada método.
Cultura de Agar de Anteras
· Cortar os botões florais com um comprimento de corola de 15–25 mm.
· Para esterilização superficial, os botões são transferidos para uma solução de hipoclorito (0,1% de cloro ativo) suplementada com algumas gotas de Tween por 10–15 min.
· Lavar os botões na bancada de trabalho estéril com água esterilizada e transferir o anel para uma placa de Petri estéril.
· Remoção do cálice e da corola com pinça flamada.
· Cortando as anteras e transferindo para uma placa de Petri estéril. Remoção suave dos filamentos.
· Transferência das anteras para meio nutriente ágar (Tabela 6.1), ver abaixo; 5 ml de meio por 50 	placas de Petri de 18 mm). Os dois sacos polínicos devem tocar o×
superfície do ágar, com o sulco orientado para o ar. Os pratos são selados com Parafilm.
· As culturas são transferidas para um gabinete de crescimento escuro a 28 ◦ C.
· No aparecimento dos primeiros estágios embrionários, após cerca de 2–4 semanas, as culturas são iluminadas (16/8 h, 20–25 ◦ C).
	(NH 4 ) 2 SO 4
	463
	MnSO4 × 4H2O _ _
	4.4
	SABE 3
	2830
	ZnSO4 × 7H2O _ _
	1,5
	KH 2 PO 4
	400
	H 3 BO 3
	1.6
	MgSO4 × H2O _ _
	185
	KI
	0,8
	CaCl2 × 2H2O _ _
	
	
	
	Glicina
	2,0
	Sacarose
	20.000–30.000
	Tiamina-HCl
	0,5
	
	
	Ácido nicotinico
	0,5
	ágar
	800
	
Tabela 6.1 Meio ágar para culturas de anteras (mg/l)
Agar medium
(mg/l)
(mg/l)
(NH4)2SO4
463
MnSO4 × 4H2O
4.4
KNO3
2830
ZnSO4 × 7H2O
1.5
KH2PO4
400
H3BO3
1.6
MgSO4 × H2O
185
KI
0.8
CaCl2 × 2H2O
166
Glycine
2.0
Sucrose
2000
Agar
8000.0
Thiamine-HCl
0.5
Nicotinic acid
0.5
Além disso, uma solução de EDTA-Fe recém-preparada: 27,9 mg de FeSO 4 H 2 O e 37,2 mg de EDTA-Na. Desse meio de cultura, 5 ml são transferidos para placas de Petri (50 18 mm) nas quais, após resfriamento, são colocadas as anteras.×
×
Este meio foi sugerido por Sunderland (1984) e originalmente não continha fitohormônios nem carvão ativado, como foi usado posteriormente em muitos sistemas. Um suplemento de 0,5% de carvão vegetal ou de 1% de ácido naftilacético (NAA), no entanto, muitas vezes aumenta claramente o número de plantas haplóides obtidas.
Técnicas de micrósporos vegetais
Transferência de embriões de cevada imaturos transformados em meio de seleção Isolamento de micrósporos de trigo/cevada
Teste de viabilidade com FDA
Inoculação de A. tumefaciens para agroinfiltração (ver também Cap. 13)
6.4 Cultura de antera e ovário
6.4.1 Cultura de antera ou micrósporo
O cultivo de anteras ou micrósporos isolados de anteras em condições adequadas através de plantas haplóides embriogênese somática pode ser obtido. Tratando esse material vegetal com, por exemplo, colchicinas , é possível produzir diplóides, e se tudo der certo dentro de no máximo 1 ano (dependendo da espécie de planta), uma planta diplóide homozigótica fértil pode ser produzida a partir de uma planta-mãe heterozigota. Este método é vantajoso para o melhoramento híbrido, pois reduz substancialmente o tempo necessário para estabelecer linhagens endogâmicas .
Freqüentemente, porém, primeiro um calo é produzido a partir de micrósporos com formação separada de raízes e brotos que se unem posteriormente e no devido tempo as plantas haplóides podem ser isoladas. Aqui, a produção de quimeras pode ser por vezes um problema. Outro objetivo do uso de culturas de anteras ou micrósporos é provocar a expressão de genes recessivos em haplóides a serem selecionados para melhoramento de plantas ou transferência de genes.
6.4.1.1 Materiais
· Liquidificador autoclavado
· Espigas de trigo (6–8)
· Etanol [75%]
· Solução de manitol [0,2 M]
· Malha de aço inoxidável de 100 e 38 μm
· Meio de indução e regeneração
· Filtro para esterilização de filtros
· Maltose [20%]
· Parafilme
6.4.1.2 Procedimento
Condições de cultivo de plantas e seleção de pontas contendo micrósporos da variedade de trigo bobwhite
Cerca de quatro plantas por vaso (20–25 cm de diâmetro) são cultivadas em uma estufa controlada a uma temperatura de 27 2 ◦ C (dia) e 17 2 ◦ C (noite) e um regime de luz (250 μmol / s/m 2 fótons) . densidade de fluxo) de 17 horas de dia e 7 horas de noite. Perfilhos frescos contendo micrósporos encerrados dentro das anteras na seção intermediária de uma espiga no estágio uninucleado intermediário a tardio (quando as cabeças de trigo estavam cerca de 3-4 cm fora da bainha) de desenvolvimento foram cortados abaixo do segundo nó e colocados em um local limpo. recipiente com água destilada. O estágio de desenvolvimento dos micrósporos é estabelecido pelo exame microscópico das anteras esmagadas. Na fase uninucleada, o micrósporo deve ser redondo e o núcleo claramente visível. O núcleo deve estar localizado na periferia do micrósporo, oposto ao poro (Fig. 6.4). Os perfilhos podem ser armazenados em água a 4 ◦ C por até uma semana sem perda significativa na viabilidade dos micrósporos. 	 
Os seguintes procedimentos ocorrem sob condições assépticas em uma capela laminar
(Todos os equipamentos devem ser autoclavados).
Fig. 6.4 No estágio uninucleado, o micrósporo é redondo e o núcleo claramente visível e localizado na periferia do micrósporo oposto ao poro (seta vermelha)
Tratamento de picos de doadores
· As espigas cobertas parcialmente pela bainha superior das folhas das plantas doadoras selecionadas são desinfetadas por pulverização com etanol a 75%.
· Após 15 minutos ou até que o álcool seque, os espigões são retirados da bota e os toldos aparados para não se fecharem nas florzinhas.
· As pontas são esterilizadas com solução de água sanitária comercial a 20% por 15 minutos e lavadas três vezes com água destilada autoclavada.
Isolamento de Micrósporos
· Florzinhas de seis a oito pontas são cortadas assepticamente dos entrenós em um copo misturador Waring autoclavado.
· São adicionados 50 ml de solução de manitol 0,2 M e o copo do liquidificador é coberto com papel alumínio.
· As florzinhas são misturadas em baixa velocidade por 5 s.
· O conteúdo do liquidificador foi filtrado através de uma malha de aço inoxidável de 100 mícrons para um béquer de 150 ml e o resíduo retornou ao copo do liquidificador.
· São adicionados 50 ml de solução de manitol 0,2 M durante mais 5 s de corrida.
· O conteúdo é filtrado como antes e o copo enxaguado três vezes com 5 ml de manitol 0,2 M.
· O filtrado combinado é então despejado no filtro de malha de aço inoxidável autoclavado de 38 mícrons para capturar os grandes micrósporos viáveis.
· Os micrósporos retidos na malha são enxaguados suavemente com 30 ml de manitol 0,2 M num copo de 150 ml.
· A solução resultante contendo micrósporos viáveis é transferida para tubos de centrífuga de 15 ml e os micrósporos sedimentados a 4.000 rpm por 5 min (Fig. 6.5).
Pré-tratamento para condicionamento de micrósporos
· Ressuspender o pellet em 10 ml de solução A (Tabela 6.2).
· Sedimentar os micrósporos a 4000 rpm por 3 min.
· Derramar o sobrenadante e ressuspender as células ressuspensas em 5 ml de solução A e transferir para uma placa de Petri estéril de 60 × 15 mm.
Figura 6.5 (a) Picos na solução indutora. As folhas e toldos foram removidos; (b, c) Cariopses no liquidificador (Warring MCII), (d) filtrado em um conjunto de filtros de malha de 38 μm (imagens fornecidas pelo Prof. Dr. Diter von Wettstein { , Pullman, EUA)
Tabela 6.2 Composições da Solução A
	Produtos químicos
	mg/L
	KCl
	1492
	MgSO4.7H2O _ _ _ _
	246
	CaCl2.H2O _ _ _ _
	148
	KH 2 PO4
	136
	Na2EDTA _ _
	37,3
	FeSO4.7H2O _ _ _ _
	56
	H 3 BO 3
	3
	KI
	0,5
	MnSO4.4H2O _ _ _ _8,0
	ZnSO4.7H2O _ _ _ _
	0,3
	Maltose
	90.000
	2-HNA
	50
	Cinetina
	0,2
pH 6,5
Filtro esterilizado
Fig. 6.6 Micrósporos formados por fibrilas em meio pré-tratado (seta vermelha)
· Cubra a placa e sele com Parafilm e incube a 22–25 ◦ C no escuro por 40–70 horas ou até que o citoplasma de aparência fibrilar dos micrósporos induzidos seja alcançado. Os micrósporos embriogênicos normalmente possuem oito ou mais pequenos vacúolos imediatamente adjacentes à parede celular. Esses vacúolos circundam o citoplasma condensado no centro, formando uma estrutura fibrilar (Fig. 6.6).
Indução da Divisão de Micrósporos
· Transferir quantitativamente os micrósporos da placa de Petri para um copo com solução A. Remover a solução A por centrifugação a 900 rpm durante 3 min e ressuspensão em 2 ml de manitol 0,2 M.
· Os micrósporos nos 2 ml de solução de manitol 0,2 M são colocados em camadas sobre 11 ml de solução de maltose a 20% num tubo de centrífuga de 15 ml.
Figura 6.7 (a) Formação de uma faixa branca de grandes micrósporos na interfase das soluções de manitol e maltose (seta vermelha).
(b) um ovário de trigo
· A centrifugação é a 600 rpm durante 3 min. Isto resulta na formação de uma faixa branca de grandes micrósporos na interfase das soluções de manitol e maltose (Fig. 6.7a).
Colete a faixa branca ou a faixa branca junto com a fase superior de manitol e filtre-as através de um filtro de malha de 38 mícrons para reter os micrósporos grandes.
· Os micrósporos presos no filtro são lavados três vezes com 2 ml de meio de indução (Tabela 6.3, Brew -Appiah et al. 2013) e transferidos para um béquer com 2 ml de meio de indução (Tabela 6.3). A concentração de grandes micrósporos é estimada usando um hemocitômetro.
· Os micrósporos são plaqueados numa placa de Petri de 60 15 ou 35 10 mm a uma densidade mínima de 1 104/ml e uma densidade máxima de 1 10 7 e com um volume total de 3 ml por placa.×	×
×	×
· Os micrósporos são co-cultivados com ovários vivos (Fig. 6.7b) de trigo, três ovários/ml. Os ovários apenas fertilizados e em crescimento funcionam melhor. As placas são cobertas e seladas com Parafilm e incubadas a 27,5 ◦ C no escuro sem agitação para
desenvolvimento (Fig. 6.8). Para a regeneração das plantas, após 30 dias de cultura em meio de indução, os calos embriogênicos (~2 mm de diâmetro) foram transferidos para o meio de regeneração C-17 (Tabela 6.4, Pauk et al. 1991). As culturas foram mantidas a 26 ◦ C sob luz fraca [~100 μmol m —2 s —1 μmol /s densidade de fluxo de fótons) com fotoperíodo de 16/8 h (dia/noite). As plântulas estão prontas para envasamento 4 semanas após a transferência dos calos embriogênicos para regeneração (Fig. 6.9).
Vantagens
· Produzindo homozigoto duplo haplóide (aceleração do progresso reprodutivo, redução de 2 a 4 anos)
· Uso de planta homozigota para mapeamento genético
· Produção de plantas transgênicas sem quimeras
· Transformação com complexo T-DNA para superar genótipos dependendo da transformação
Tabela 6.3 Composição do meio de indução (mg/L)
	SABE 3
	1400
	Coquetel de aminoácidos (mg/L)
	NH 4 NÃO 3
	300
	Glutamina
	1950
	KH 2 PO 4
	170
	Asparagina
	120
	MgSO4 · 7H2O _ _
	370
	Arginina
	60
	CaCl2 · 2H2O _ _
	440
	ácido g-aminobutírico
	160
	FeSO4 · 7H2O _ _
	37,3
	Serina
	110
	Na2EDTA · 2H2O _ _
	22.3
	Alanina
	60
	MnSO4 · 4H2O _ _
	8.6
	Hidrolisado de caseína amino
	40
	ZnSO4 · 7H2O _ _
	6.2
	Cisteína
	20
	H 3 BO 3
	37,3
	Leucina
	20
	KI
	0,83
	Isoleucina
	20
	NaMoO 4 ·2H 2 O
	0,25
	Prolina
	20
	CuSO4 · 5H2O _ _
	0,025
	Lisina
	20
	CoCL2 · 6H2O _ _
	0,025
	Fenilalanina
	10
	Mio-inositol
	300
	Triptofano
	10
	Tiamina-HCL
	0,4
	Metionina
	10
	Piridoxina-HCL
	0,5
	Valina
	10
	Ácido nicotinico
	0,5
	Glicina
	5
	Ácido ascórbico
	0,75
	Histidina
	5
	PAA
	2,0
	Treonina
	5
	Cinetina
	0,5
	Tirosina
	10
	L-Glutamina
	975
	
	
	Aminoácidos, Coquetel
	355 mg
	
	
	Maltose
	90g
	
	
	Fitagel
	3g
	
	
	pH
	6
	
	
Aplicação de Haplóides e Haplóides Duplos
A reprogramação do desenvolvimento dos micrósporos em direção à embriogênese e à formação de plantas haplóides torna a cultura isolada de micrósporos um sistema gratificante no campo da biologia molecular e da biotecnologia das plantas. A transformação dos micrósporos e embriões derivados produzirá linhas homozigóticas/haplóides duplos (DH) que poderiam ser usados para reprodução adicional. Desde que a primeira planta haplóide Nicotiana tabacum foi obtida em 1967 ( Bourgin e Nitsch 1967), o grande número de plantas haplóides foi induzido a partir de várias espécies de plantas herbáceas e lenhosas, como Oryza sativa , Setaria . itálica , Zea mays e Aesculus hippocastanum (Guha et al. 1970; Ban et al. 1971; Murakami et al. 1972; Radojevic 1978).
Fig. 6.8 Processo de desenvolvimento de micrósporos em meio de indução. (a) Fibril formada 5 dias após a indução (seta vermelha). Multiplicação e crescimento celular aos 7 dias (b); 14 dias (c) e 21 dias (d)
Cucurbitáceas
A família de plantas Cucurbitaceae inclui uma série de culturas hortícolas econômicas e essenciais, como pepino ( Cucumis sativus var . sativus L.), melão ( Cucumis melo L.), abóbora ( Cucurbita moschata Duchesne ex Poir .), abóbora ( Cucurbita pepo L.) e abobrinha ( Cucurbita pepo L.), melancia ( Citrullus lanatus (Miniatura) Matsum . & Nakai), abóbora ( Cucurbita maxima Duch. ex Lam.) e outras espécies. Todos são cultivados em todo o mundo, em todas as culturas, e deixaram uma marca indelével na civilização moderna.
Conforme relatado por Dong et al. (2016) haplóides e haplóides duplos são componentes críticos do melhoramento de plantas. Eles discutiram detalhadamente os seguintes quatro aspectos desta questão: (1) os métodos mais populares de obtenção de haplóides e DHs em cucurbitáceas e os fatores que influenciam cada método, onde os resultados mais importantes estão resumidos nas Tabelas 6.1, 6.5 e 6.6. (2) Comparação entre métodos de duplicação cromossômica e identificação de ploidia em cucurbitáceas e entre meios para produção eficiente de DH. (3) aplicação de DH no melhoramento de plantas e na pesquisa genética básica, incluindo estudos moleculares, e (4) conclusões importantes sobre metodologias e protocolos para haplóides de androgênese, ginogênese e partenogênese, etapas básicas e aspectos de cada método, e protocolos haplóides de pepino, especificamente, como mostrado na Fig. 6.10.
Tabela 6.4 Composições do meio C-17 (mg/L)KNO3
1400
NH4NO3
300
MgSO4·7H2O
150
KH2PO4
400
CaCU·2H2O
150
MnSO4·4H2O
11.2
ZnSO4·7H2O
8.6
CUSO4·5H2O
0.025
H3BO3
6.2
Kl
0.83
COCI2·6H2O
0.025
Na2EDTA
37.25
Fe2SO4·7H2O
27.85
Nicotmic acid
0.5
Thiamine HCl
1.0
Pyridoxine HCl
0.5
Clycince
2.0
D-Biotin
1.5
Folic acid
0.5
Myo-inositol
100.0
2,4-D
2.0
Kinetin
0.5
Sucrose (9%)
90,000
Agar
5500
pH
5.8
Fig. 6.9 Desenvolvimento de plântulas em meio de regeneração. (a) calos embriogénicos ; (b) plântulas geradas a partir de calos embriogênicos (Imagens fornecidas pelo Prof. Dr. Diter von Wettstein { , Pullman, EUA)
Tabela 6.5 Algumas características morfológicas de plantas haplóides, diplóides e di-haplóides de Nicotiana tabacum var. Xanthi ( Zeppernick 1988)98
6 Haploid Techniques
	
	Peso fresco (g/planta)
	
	
Plante um
	Altura (cm)
	Número de folhas
	Número de botões laterais
	Número de botões/
flor
	
Tronco
	
Folhas
	Botões laterais
	Botões/
flor
	
Raízes
	Rendimento/planta
	
LAI -b
	n
	76
	28
	13
	146
	84
	86
	5
	31
	119
	325
	0,47
	2n _
	112
	35
	5
	52
	173
	185
	2
	8
	99
	467
	0,63
	2 × n
	77
	28
	17
	66
	99
	134
	3
	9
	138
	383
	0,62
aColheita : n , 13 de julho; 2 de julho , 12 de julho; 2 × n , 12 de julho
foliar (LAI) ¼ largura da folha (em cm)/comprimento da folha (em cm)
Tabela 6.6 Atividade de giberelina de cepas haplóides e di-haplóides e de um híbrido F1 (8 4) determinada pelo método do arroz anão ( Tanginbozu ) após separação do extrato de acetato de etila de folhas de tamanho definido por cromatografia em camada delgada (expresso como equivalentes de giberelina, ng /g de peso fresco; média de quatro repetiçõespor cepa; colheita 1988)×
	Variedade
	21/02, n.
	22/02, 2× n
	31/04, n.
	32/04, 2 × n
	11/08, n.
	12/08, 2 × n
	8 × 4, 2n
	8 × 4, 2n
	Área para l fino. cr.
	Plantas geradoras
	Plantas vegetativas
	Polar
	3.1
	0,9
	0,7
	0,2
	0,2
	0,3
	4.1
	0,5
	Não polar
	0,4
	0,4
	0,8
	0,5
	0,3
	0,2
	0,1
	0,1
	Total
	3.5
	1.3
	1,5
	0,7
	0,5
	0,5
	4.2
	0,6
6.10 As etapas básicas e os principais fatores na androgênese, ginogênese e partenogênese haplóides em cucurbitáceas (Fonte Dong et al. 2016)
Cultura Líquida de Anteras
Este método inclui um pré-tratamento das anteras antes da cultura para estimular o desenvolvimento dos micrósporos em plântulas. Este pré-tratamento consiste num “stress frio”:
· Transferência dos botões florais recém-isolados para um recipiente lacrado (placa de Petri, saco de polietileno).
· Colocação do recipiente por 3 semanas no escuro na geladeira (7–9 ◦ C). Seguindo Sunderland, este tratamento “frio” aumenta o número de plantas haplóides em 10 a 15 vezes.
· Para obter as anteras, segue-se o método descrito para culturas em ágar.
· Transferência de até 50 anteras para uma placa de Petri (50 18 mm) contendo 5 ml do meio nutriente fornecido acima sem ágar. As anteras flutuam na superfície do meio líquido.×
Depois de alguns dias, um número suficiente de pólen cai das anteras, que pode então ser usado novamente para iniciar uma nova cultura, transferindo-o para outra placa de Petri.
Após cerca de 2 semanas, as primeiras estruturas embrionárias podem ser observadas; até que plantas jovens transplantáveis estejam disponíveis, o meio nutriente deve ser renovado várias vezes.
Ainda não é completamente compreendido o significado do carvão ativado. Este suplemento está de alguma forma associado à inativação (via absorção) de alguns componentes do ágar que podem inibir a androgênese e à liberação de outras substâncias solúveis em água que podem promovê-la (Forche et al. 1981). Como mencionado antes, outro fator chave é a temperatura. Relata-se que diversas espécies de plantas requerem o armazenamento das anteras em baixa temperatura (2–4 ◦ C) por pelo menos 24–48 horas antes do cultivo. A temperatura também é importante durante o cultivo e sua exigência parece depender de fatores genéticos. Por exemplo, enquanto a variedade de tabaco “Wisconsin” requer 22 ◦ C para iniciar a androgênese, isso pode ser alcançado para “Xanthi” apenas a 28 ◦ C. Os requisitos discutidos aqui podem ser considerados apenas como tendências, e as condições exatas para induzir a androgênese devem ser determinados para cada espécie ou variedade. Muitos exemplos podem ser encontrados na literatura na Internet.
O sucesso das culturas de micrósporos depende também das condições de crescimento da planta doadora. Por exemplo, a temperatura novamente parece ser importante aqui. Maiores rendimentos de embriões foram obtidos se os micrósporos se originassem de plantas de colza ( Brassica napus ) cultivadas sob um ciclo claro/escuro de 16/8 horas a 15/12 ◦ C, em comparação com 23/18 ◦ C (Lo e Pauls 1992). Os autores relacionam isso a uma redução na granularidade citoplasmática e/ou densidade da exina.
Finalmente, será dada uma descrição das plantas haplóides. O tecido que envolve os micrósporos haplóides na antera (conjuntivo do tapete) é diplóide. Assim, são necessários métodos confiáveis para distinguir entre plantas haplóides derivadas dos micrósporos e diplóides derivadas do tecido diplóide adjacente. O mais confiável, claro, é contar os cromossomos nas células em divisão, por exemplo, nas células da ponta da raiz. No entanto, normalmente apenas uma ponta de raiz está disponível por planta, a qual não se deseja “sacrificar”. Como alternativa, o método descrito agora tem sido utilizado com sucesso nas nossas investigações há muitos anos e requer apenas um pequeno pedaço de folha ou calo. Se a planta se origina de micrósporos, então podem ser observadas células com núcleos 1C. A ausência de tais células indica que as plantas são derivadas de material diplóide da antera. O valor 1C da espécie pode ser determinado usando seus micrósporos. Os problemas relacionados com a estabilidade da ploidia serão tratados mais adiante (Cap. 13).
Determinação microfluorométrica do nível de ploidia (Blaschke 1977; Blaschke et al. 1978). Para a padronização do método, o DNA foi medido no estágio inicial da tétrade dos núcleos no micrósporo em desenvolvimento. A intensidade da fluorescência dessas estruturas é igual ao conteúdo de DNA do núcleo haplóide (1n). Este método antigo é particularmente adequado para usar tecido sem ou com poucas divisões celulares disponíveis para contagem de cromossomos.
O material vegetal a ser utilizado para a investigação é primeiramente fixado em etanol/ácido acético glacial (3:1) por 12 horas, seguido de uma série ascendente de álcool para desidratação. Em seguida, as células são embebidas em parafina e, com a ajuda de um micrótomo, são cortadas seções de 12–15 μm . Os cortes são fixados em lâmina com solução de gelatina/ glicerina (1 g de gelatina pura dissolvida em 100 ml de água destilada , complementada com 15 ml de glicerina e alguns cristais de timol) e secos por 12 horas a 40 ◦ C.
Após a retirada da parafina em placa aquecida, aplica-se uma série descendente de álcool, semelhante a outros métodos histológicos comuns. Isto é seguido pela coloração com uma solução de bisbenzimida a 0,005% (Dye Höchst 33258) por 10 min (pH 4,4-4,6) e depois enxágue por 5 min em água corrente e diferenciação por 15 min em etanol a 70%. Após a inclusão dos cortes em “ glicerina para microscopia de fluorescência” Merck), uma lamínula é colocada e no dia seguinte as medições podem ser feitas.
As medições são feitas em um comprimento de onda >490 nm usando uma lâmpada de xenônio de alta pressão para iluminação com ampliação de 500 vezes. Para determinar a intensidade da fluorescência, a lente do microscópio é adaptada ao tamanho e formato dos núcleos. Para as medições, é preciso ter cuidado para selecionar núcleos que não toquem em outros próximos. A intensidade da fluorescência é estável durante pelo menos 6 meses. A leitura pode ser comparada com valores obtidos de micrósporos em estado de tétrade. Após a maceração enzimática das suspensões celulares, uma automação da determinação do valor C pode ser realizada por citofotometria de fluxo. Aqui, os protoplastos são mais adequados do que as células intactas.
Outros métodos
de Arabidopsis geneticamente transformado (Zhang et al. 2005), acoplando GFP com a histona 2A. Esta construção (HTA6) complexada na cromatina está, portanto, linearmente relacionada com o conteúdo de DNA do núcleo. Este material também pode ser usado para citometria de fluxo.
Sari et al. (1999) compararam quatro métodos diferentes para determinar o nível de ploidia, ou seja, contagem de cromossomos, citometria de fluxo, tamanho e número de cloroplastos das células-guarda e algumas observações morfológicas, usando duas cultivares de melancia. Todos os quatro foram bem-sucedidos e igualmente confiáveis. O mais fácil de executar foi o método baseado nas medidas dos estômatos. O comprimento dos estômatos dos haplóides era de 17–18 μm , o diâmetro de 10–12 μm e o número de cloroplastos nas células-guarda era de 6–7. Para diplóides, os valores correspondentes foram 23–24 μm , 18 μm e 11–12. Com equipamento adequado, uma determinação aproximada do nível de ploidia também poderia ser realizada em plantas intactas, na estufa ou no campo.
Aqui, questões relativas às relações do nível de ploidia e do plastoma devem ser acompanhadas detalhadamente.
6.5 	Plantas Haplóides
As características morfológicas mais óbvias das plantas haplóides são altura reduzida, folhas menores com diâmetro reduzido da lâmina foliar e número excessivo de frutos pequenos (Tabela 6.5, Fig. 6.11). Na Figura 6.12, pode-se observar que também as plantas haplóides produzem frutos. A formação de sementes, entretanto, está ausente e, como o tamanho dos frutos depende frequentemente do desenvolvimento das sementes, os frutos permanecem pequenos.Fig. 6.11 Folhas, flores e frutos de Datura innoxia diplóide (esquerda) e haplóide (direita) plantas (fotografias de E. Forche)
Fig. 6.12 Formato das folhas de três linhagens de plantas de tabaco dihaplóides (2n ) derivadas por androgênese
Além disso, deformações de folhas e flores ocorrem frequentemente em plantas haplóides. Nas plantas Datura , foram observadas flores com três pétalas, em vez de cinco, e nas flores do tabaco, um gineceu fundido e sete a oito anteras podem ser vistos. Parece que duas flores se fundiram numa só; tais fusões foram observadas também nas folhas. Tais deformações não foram observadas em plantas diplóides normais crescendo nas mesmas condições. Possivelmente, a população de plantas diplóides observada era demasiado pequena para dar um resultado definitivo sobre este problema.
Além da redução do tempo necessário para estabelecer linhagens endogâmicas, outro benefício das plantas haploides é a possibilidade de concretizar genes recessivos ocultos na geração parental. Para considerar o “efeito da dosagem genética” no julgamento dos genomas das plantas derivadas da androgênese, são necessárias plantas dihaplóides . Tais plantas podem ser produzidas aplicando, por exemplo, colchicinas aos botões (ver acima). Em algumas espécies de plantas (por exemplo, tabaco), os dihaplóides são produzidos espontaneamente a partir dos botões das folhas. Se esses dihaplóides forem propagados por estacas, as propriedades desses genomas poderão ser preservadas. Com esse material, a China foi a primeira a criar novas variedades de tabaco, milho, trigo e outras plantas, já há muitos anos em uso pelos agricultores.
Uma característica clara das plantas haplóides é o diâmetro foliar reduzido, com comprimento foliar mais ou menos normal (Tabela 6.3; cf. Figs. 6.12 e 6.13). Além disso, os haplóides entram na fase de floração cerca de uma semana antes dos dihaplóides , o que é consistente com a maior concentração de c-form (Tabela 6.6). Como a pulverização de dihaplóides com uma solução de giberelina (GA 3 ) induz o mesmo formato de folha, é razoável prever uma forte influência do nível de ploidia no sistema de giberelina nativo das plantas . No entanto, é difícil ver de que forma o sistema giberelina e o nível de ploidia estão relacionados. Embora a síntese e o metabolismo geral deste grupo de fitohormônios sejam bastante bem compreendidos, sua ação como um sinal para promover respostas morfogênicas, como o formato das folhas, ainda requer investigações (para um resumo, ver Thomas e Sun 2004).
É difícil decidir até que ponto as variações no formato das folhas das três cepas dihaplóides da Figura 6.13 são devidas à expressão de genes recessivos. Deve-se salientar que estas cepas foram derivadas de anteras da mesma planta-mãe diplóide. Essas plantas dihaplóides são férteis e podem ser utilizadas para cruzamentos. A figura mostra diferenças claras que foram preservadas através de várias gerações de propagação por sementes. Como pode ser visto nas imagens de folhas comparáveis dos dois progenitores e de um híbrido, uma clara heterose pode ser observada para o tamanho da folha (Fig. 6.13). A altura da planta do híbrido, entretanto, está entre as dos pais. A heterose pode ser observada novamente para a concentração de nicotina nas folhas (Tabela 6.7).
Fig. 6.13 Formas de folhas de duas cepas de tabaco derivadas por androgênese e um híbrido F1
Tabela 6.7 Concentrações de nicotina de duas cepas dihaplóides de Nicotiana tabacum e um seu híbrido (F1; experimentos em vasos, média de 3 anos consecutivos; Zeppernick 1988)
	Variedade
	mg de nicotina/g de peso seco de folhas
	mg de nicotina/planta (“ Hauptgut ”)
	32/04
	2.2
	8.4
	12/08
	4.1
	22,9
	F1
	6.3
	37,2
K, L 
L 
Spontaneous Diploid Plants Chimeric Plants Haploid Plants Somatic Diploid Plants 
Double Haploid Plants Haploid Plants Chimeric Plants 
Planting in Greenhouse 
Plant 
Ovary 
Ovary 
Plant 
Flower Bud 
Fruit 
Irradiated Pollen 
A, B 
E, F 
E, F 
× 
C, D 
G, H 
G, H 
G, H 
 
 
 
G, H E 
 
 
G 
 
 
I 
 
 
 
 
J Plant Regeneration 
Embryo Differentiation 
Embryo Excision and Resuce 
Embryo or Callus 
Ovary Slice 
Microspore Culture 
Anther Culture 
Embryo or Callus 
 
G, H