Variação Somoclonal

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13.1 Somaclonal Variações
Segundo Leva et al. ( 2012 ), o termo somaclone foi cunhado para se referir a plantas derivado de qualquer forma de cultura celular, e o termo “variação somaclonal” foi cunhado para se referir à variação genética entre essas plantas. Fenotípico e genotípico variações são às vezes mostrando em em vitro regenerado plantas derivado de culturas de órgãos, cali, protoplastos, e somático embriões (Orbovic et al. 2008 ; Machczyńska e outros. 2015 ). No entanto, a variação somaclonal fornece uma fonte valiosa de informações genéticas. variação para o melhoramento de culturas através da seleção de novas variantes, que poderia mostrar resistência para doença, melhorou qualidade, ou mais alto colheita (Unai et al. 2004 ). Planta clássica criadores também gerar diversidade genética dentro de uma espécie explorando um processo chamado variação somaclonal, que ocorre em plantas produzidas a partir de tecido cultura, particularmente plantas derivado de calo. Induzido poliploidia e o Adição ou remoção de cromossomos usando a técnica chamado cromossoma Engenharia poderia também ser usado.
A variação somaclonal será agravada por efeitos epigenéticos. Isso faz com que uso para melhoramento de culturas é mais difícil, particularmente em plantas propagadas assexuadamente, desde cruzando e nova seleção seria ser obrigatório para organizar fora desejado mutações de outro alterações. Em vitro seleção é deficiente por atípico gene expressão. O usar de haplóides derivado de antera cultura tem encontrado isso é melhor aplicativo em a “técnica dos haplóides duplos”, que leva mais rapidamente à homozigosidade para uma seleção. Leva et al. ( 2012 ) e Sridevi e Giridhar ( 2014 ) obtido variantes somaclonais em somaclonal variantes de robusta café com reduzido níveis de cafestol e kahweol.
13.1.1 	Estabilidade da Ploidia
As culturas de longo prazo geralmente mostram células com níveis de ploidia superiores à haploidia ou diploidia além da aneuploidia. Esta instabilidade ploidia observada em culturas originalmente haplóides ou diplóides é na verdade uma característica geral das culturas celulares. A estabilidade citogenética, no entanto, é um pré-requisito para manipulações genéticas, bem como para a utilização de tais culturas para fins de melhoramento. Ainda assim, a instabilidade genética também oferece por vezes uma oportunidade para isolar genótipos com propriedades importantes para aplicações práticas. No entanto, o problema da estabilidade genética da prole ainda precisa ser resolvido.
As variações epigenéticas desempenham um papel importante. Seguindo Chaleff, estas são definidas como reações de culturas mantidas após a remoção do estímulo que causou essas reações. Em contraste com isso, as reações fisiológicas normais cessam a operação após a remoção do estímulo.
O método clássico para determinar o nível de ploidia é contar os cromossomos na metáfase da mitose. As células em divisões ativas são em sua maioria estáveis em ploidia, enquanto uma ampla dispersão dos níveis de DNA pode ser observada por citofotometria em culturas de células mais antigas com uma baixa taxa de divisão. Neste caso, contagens cromossómicas fiáveis reflectiriam uma maior estabilidade e homogeneidade genética do que realmente existe. Isso pode ser visto na Figura 13.1 para uma suspensão de células Datura na fase estacionária de crescimento, na qual a quantidade de DNA foi determinada por meio de medições citofotométricas (ver Capítulo 6). Tais heterogeneidades ocorrem particularmente em culturas de origem haplóide. Os métodos citofotométricos, entretanto, geralmente não são sensíveis o suficiente para detectar aneuploidias ou perda de seções de cromossomos. Para isso, a análise cromossômica ainda é recomendada.
Fig. 13.1 Conteúdo de DNA em núcleos de células de origem haplóide e diplóide em culturas de suspensão celular: em t0, e após o tratamento descrito na Fig. 13.3, em t28 (Kibler e Neumann 1980) Eixos X: unidades relativas, eixos Y : porcentagem de núcleos com um determinado conteúdo de DNA
Como mencionado anteriormente, para estudos que avaliam o conteúdo de DNA específico de células, o chamado valor C é frequentemente utilizado. 1C representa o conteúdo de DNA do genoma haplóide da espécie na fase G do ciclo celular e 2C o da fase G2. O valor 1C pode ser facilmente obtido pela determinação citofotométrica do conteúdo de DNA nas tétrades para padronização do método. Nas cenouras, por exemplo, podem ser observadas diferenças mensuráveis (embora pequenas) no conteúdo de ADN entre variedades e, portanto, recomenda-se realizar tais medições para cada variedade separadamente.
Na fase G1 do ciclo celular, o conteúdo de DNA das células diplóides é definido como 2C e nas células da fase G2 como 4C. Na fase S são encontrados valores intermediários. Valores superiores aos definidos para o genoma diplóide também podem ser observados em células de plantas intactas cultivadas a partir de sementes. Além disso, e apesar de alguma dispersão de dados, particularmente para células estaminais, a comparação dos perfis de conteúdo de ADN de células de plantas intactas e de sistemas de cultura celular demonstra claramente mais uniformidade no conteúdo de ADN para as primeiras.
Em plantas de cevada criadas a partir de micrósporos, uma heterogeneidade distinta pode ser observada dentro de uma planta, com diferentes níveis de ploidia nas folhas (Fig. 13.2). Nas condições utilizadas, a embriogênese somática direta não pôde ser induzida. As plantas foram obtidas a partir de um calo produzido pela cultura de anteras através de diferenciação separada de parte aérea e raiz. A ponta da raiz dessas plantas consiste em linhagens celulares de diferentes níveis de ploidia (Neumann 1995). Este não é o caso das plantas cultivadas pelo método bulboso. A mesma dispersão dos níveis de ploidia pode ser detectada no calo do qual a planta foi obtida. Aparentemente, os primórdios da raiz se desenvolveram a partir de um grupo de células dentro do calo que continha células de diferentes valores C. Na parte aérea dessas plantas foram registradas variações nos valores de C nas folhas e foram observadas flores inférteis. Se o início dos primórdios da parte aérea fosse análogo ao dos primórdios da raiz considerados acima, então essas tendências de folhas e flores seriam explicadas.
Fig. 13.2 Distribuição do valor C em várias folhas de uma planta de cevada cultivada a partir do calo de culturas de anteras (Forche et al. 1979) Eixos X: unidades relativas de conteúdo de DNA nos núcleos, eixos Y: porcentagem de núcleos com um determinado conteúdo de DNA
Esses resultados têm implicações importantes. Como sabemos hoje, as plantas derivadas da embriogênese somática desenvolvem-se a partir de uma única célula (ver Seção 7.3). Portanto, em experiências sobre o genoma, ou para utilização em programas de melhoramento e semelhantes, estas plantas seriam de longe preferíveis às obtidas a partir de culturas de calos com diferenciação separada de raízes e rebentos. Para algumas espécies de plantas, ainda hoje, o termo recalcitrante é utilizado no que diz respeito à indução da embriogênese somática. Para essas espécies, os resultados a seguir poderiam ajudar na produção de material ploidico e homogêneo (Figs. 13.3 e 13.4).
Figo. 13.3 Procedimento obter ploidia homogêneo célula culturas (Kibler e Neumann 1980 )
O protocolo é baseado em duas suposições: primeiro, as células com o menor nível de ploidia têm a menor duração do ciclo celular e, segundo, em suspensões celulares, a maior atividade de divisão celular ocorre em pequenos agregados celulares, comparáveis aos ninhos meristemáticos descritos para culturas de calos. . A alta atividade de divisão celular é suportada por um suplemento de cinetina, e esses agregados celulares são isolados por meio de alguma técnica de peneiramento. O resultado final são suspensões de Datura extremamente estáveis, mantidas por 3–4 semanas (Kibler e Neumann 1980; Neumann 1995). A aplicação deste protocolo a suspensões de cevada de origemhaplóide com uma ampla dispersão de valores C em várias subculturas sucessivas resultou em material celular ploidiamente homogêneo (Neumann 1995).
13.1.2 	Mais algumas variações somaclonais
Seguindo Larkin e Scowcroft (1981), a dispersão dos níveis de ploidia (como descrito acima) e algumas outras variações epigenéticas de células cultivadas podem ser categorizadas como variações somaclonais. Estes incluem mutações, rearranjos cromossômicos, alterações na estrutura cromossômica, amplificação genética, metilação genética, ativação de transposons, troca de seções de cromossomos e outros.
Para uma série de espécies de plantas (arroz, trigo, milho, alface, tabaco, tomate e colza, limão), as chamadas mutações pontuais foram detectadas em plantas cultivadas a partir de culturas de células. Uma revisão inicial sobre este tópico foi publicada por Scowcroft et al. já em 1987 (ver também Orbovic et al. 2008; Leva et al. 2012). As plantas com tais mutações foram obtidas do mesmo calo que outras estão livres destes, e especulou-se que essas mutações foram produzidas durante a cultura celular.
Isto, no entanto, não pode ser considerado uma prova conclusiva. No entanto, Orbovic et al. (2008) analisaram a variabilidade genética em várias populações de limoeiros derivadas de cultura de tecidos usando RAPD e citometria de fluxo. Normalmente, um explante original consiste em 10.000 a 15.000 células e mais, e não se pode excluir a existência acidental de células já mutadas na planta-mãe, que são posteriormente propagadas em cultura. Aqui, as culturas de protoplastos e a embriogênese somática deveriam ser um sistema mais adequado.
Nas plantas superiores, a fração de sequências repetidas de DNA equivale a cerca de 40-60% do genoma total, e algumas sequências podem ocorrer em até milhões de cópias. A fração de sequências repetitivas com número moderado de cópias inclui genes para rRNA. Em plantas individuais de Triticale derivadas de cultura de tecidos, para uma proporção de quatro fragmentos de uma sequência de rRNA entre si, obtida pela aplicação da enzima de restrição Tag 1, variações quantitativas foram detectadas por Brown e Lörz (1986). Essas mudanças foram estáveis por meio da meiose. Para a interpretação de tais resultados, deve-se considerar que alterações no número de cópias de genes também podem ser induzidas por fitohormônios ou herbicidas (Widholm 1987). Ainda não está claro até que ponto tais mudanças são hereditárias. Notavelmente, uma amplificação de alguns trechos de DNA induzida por aplicações de GA3 em plantas de cenoura, que resultou numa redução do diâmetro da raiz principal, não foi herdada.
Larkin et al. (1985) já descreveram plantas derivadas de cultura de tecidos de 14 espécies nas quais foram observadas alterações na estrutura cromossômica. Estes incluíram deleções, troca de seções cromossômicas, formações de isocromossomos, inversões, amplificações de DNA e outros. Além disso, tais alterações foram observadas em 17 das 551 plantas de trigo hexaplóides derivadas de cultura de tecidos. Em 14 plantas foi detectada aneuploidia de um cromossomo e quatro plantas eram euplóides. Essas variações foram interpretadas como sendo devidas à formação de isocromossomos ou translocações dentro do genoma.
É necessário levantar a questão de saber quais são as causas das variações somaclonais e o que torna as plantas derivadas de culturas de tecidos particularmente propensas a tais alterações.
A simples compreensão convencional da regulação genética da vida celular pode ser resumida como o DNA é transcrito em RNA, que atua como modelo para sintetizar proteínas, sendo estas responsáveis por essencialmente todos os processos que ocorrem dentro da célula, ou pelas suas reações ao meio ambiente. À medida que as sequências de nucleótidos do ADN se tornam cada vez mais conhecidas, contudo, aparecem inconsistências inexplicáveis com este dogma central. Isso levanta questões como por que gêmeos aparentemente idênticos geneticamente não são realmente idênticos em alguns aspectos. Factores epigenéticos parecem ser responsáveis por estas anomalias, e estas podem estar associadas ao chamado ADN lixo (ver acima). É preciso ter em mente que apenas uma pequena porcentagem do nosso DNA codifica proteínas através do mRNA. Durante muito tempo, esse DNA lixo foi considerado um subproduto de milhões de anos de evolução. Isto ainda pode ser verdade até certo ponto, mas aqui pelo menos parte da informação sobre fatores epigenéticos poderia ser localizada. Variações somaclonais, frequentemente observadas em material celular cultivado, ou embriões derivados deste, podem ser definidas como fatores epigenéticos, e este pode ser um sistema valioso para estudar o amplo espectro da epigenética como tal, e sua regulação das células.
Durante os últimos anos, cada vez mais evidências apontam para um sistema epigenético de regulação do crescimento e desenvolvimento que parece controlar a atividade genética. Isso inclui metilação do DNA, amplificação do DNA, acetilação de histonas e outros sem alterações na sequência de nucleotídeos. As alterações neste sistema também são hereditárias. Resta saber se estes fazem parte de um sistema regulatório acima do sistema clássico DNA/RNA/proteína ou se são fatores amplamente independentes relacionados ao esquema clássico.
Como mencionado em outro lugar, durante a formação de calos in vitro, dois desses fatores epigenéticos, isto é, a metilação do DNA e a amplificação do DNA, foram caracterizados em culturas de cenoura. Estes provaram ser transitórios. Durante a fase de crescimento logarítmico, a amplificação do DNA diminuiu e a metilação do DNA foi promovida. Isto foi uma indicação de um rearranjo de fatores (ou sistemas) epigenéticos na transferência das células radiculares originais, bastante quiescentes, para células calosas em proliferação. Na fase estacionária frequentemente associada à rizogênese, a metilação foi reduzida e a formação de sequências de DNA amplificadas foi novamente aumentada. Aqui, um novo sistema epigenético, presumivelmente qualitativamente diferente, teria sido estabelecido. Mudanças na metilação também podem ser induzidas por reguladores de crescimento, notadamente auxinas (Loschiavo et al. 1989; Arnholdt-Schmitt 1993). Sabe-se que elementos repetidos são preferencialmente metilados (Arnholdt-Schmitt et al. 1995).
Durante tais rearranjos, podem ocorrer erros na reorganização do sistema epigenético, expressos como variações somaclonais. Tais variações somaclonais são frequentes em material transgênico. As plantas transgênicas são geralmente derivadas de sistemas de cultura de tecidos e, uma vez que tais alterações epigenéticas podem ser hereditárias, o genoma das plantas transgênicas é frequentemente bastante instável. Isto poderia contribuir para responder à segunda parte da questão colocada acima.
Como respostas à primeira parte desta questão, podem ser consideradas amplificações de DNA, transposons e reorganizações somáticas do genoma. Este último parece envolver principalmente mudanças nas características poligênicas. Além disso, cruzamento somático, troca de material de cromátides irmãs, variações no padrão de metilação do DNA, ativação ou inativação de genes devido a mutações de sequências de DNA originalmente não codificantes, embora associadas a trechos codificantes de DNA, e outros aspectos podem ser discutidos. Até o momento, entretanto, não há evidências experimentais suficientes publicadas na literatura que apontem para qualquer mecanismo como a causa das variações somaclonais. A situação não é muito diferente na resposta à segunda parte da questão colocada acima. Já na década de 1970, D'Amato discutiu a alta plasticidade do genoma de plantas superiores em cultura de tecidos. Com base na disponibilidade de dados suficientes já naquela época, vários mecanismos pareciam ser possíveis, relacionados principalmente ao material original a partir do qual os explantes foram obtidos. Isto pode conter células com replicações de DNA sem divisão simultânea do núcleoou eventualmente da célula. Se tais células ocorrerem em um explante no início da divisão celular, então, quando essas células se dividirem, ocorrerá poliploidia. Tais extra-replicações de DNA foram registradas em mais de 80% das angiospermas examinadas. Como já descrito, estes podem ser mais ou menos específicos do tecido e parecem estar relacionados com a diferenciação. No tecido meristemático, eles estão quase ausentes. Em tecidos maduros como o suspensor Phaseolus, uma amplificação do DNA sem divisão simultânea das cromátides resulta em cromossomos gigantes (Nagl 1970). Consequentemente, a homogeneidade ploidica das culturas celulares dependeria, pelo menos em parte, do estado de desenvolvimento do tecido utilizado para obter explantes para cultura. A utilização de explantes de áreas meristemáticas deverá produzir sistemas de cultivo com maior homogeneidade de ploidia.
Importantes também são as reações do núcleo durante as induções do calo.
Aqui, são frequentemente observadas endorreduplicações e também fragmentação desigual do núcleo devido à formação de fusos multipolares. Como resultado, são produzidas células com mais de um núcleo (D'Amato et al. 1980). Mais tarde, as divisões celulares estarão associadas à perda de um ou outro cromossomo, levando eventualmente à aneuploidia. Como já mencionado em outro lugar, os fitohormônios parecem desempenhar um papel central nestas
processos, particularmente a relação auxina/citocinina.
Em geral, a variabilidade do genoma aumenta com a idade das culturas. Isso pode ser observado principalmente pela ocorrência de endorreplicações sem divisão simultânea do núcleo, bem como da célula. A extensão desta influência depende da suplementação hormonal do meio nutriente, mas também da forma e concentração do nitrogênio, da pressão osmótica do meio e de outros fatores. Assim, o tipo de célula que encontrará as condições ideais sob as quais poderá dominar dependerá da composição do meio nutriente. Um exemplo é a influência da cinetina no enriquecimento de células haplóides numa suspensão que originalmente mostrava uma ampla dispersão de valores C (ver acima).
Um significado semelhante pode ser atribuído às mudanças no meio nutriente para induzir a diferenciação. Assim, alterando as condições de cultivo, é possível promover seletivamente o crescimento de determinados genomas. Por implicação, recomenda-se aqui uma caracterização genética cuidadosa, particularmente de material vegetal utilizado para melhoramento de plantas, ou tecnologia genética.
Conforme discutido anteriormente, a variação somaclonal pode causar problemas para os sistemas de cultura celular que preservam o germoplasma por um longo período através da subcultura. Estes problemas podem ser contornados através da utilização de vários métodos de criopreservação (Secção 3.6).
Como mencionado anteriormente, a variação somaclonal pode ser explorada para selecionar linhagens germinativas com propriedades benéficas para uma ou outra aplicação. Aqui surge novamente o problema da estabilidade de tais características. Embora algumas alterações no genoma tenham se mostrado hereditárias, essas alterações foram conferidas principalmente a áreas de baixa importância para o crescimento e desenvolvimento de plantas intactas derivadas de suspensões celulares. Semelhante às mutações induzidas por tratamentos químicos ou por raios X, as variações somaclonais são bastante acidentais. Para melhorar o rendimento das plantas cultivadas ou a resistência às tensões ambientais e aos ataques de pragas, é necessária uma alteração controlada do genoma. O sucesso depende da compreensão da base fisiológica ou bioquímica do processo na planta a ser alterada e da sua dependência de fatores genéticos. Como será descrito mais adiante, aqui entra em jogo a tecnologia genética.
Um aspecto importante no rastreamento de alterações genômicas induzidas naturalmente como variações somaclonais ou por meios artificiais, como raios X, é o método de seleção. Geralmente, aplica-se um método positivo através do qual as plantas com genomas alterados não são ou pelo menos são menos afetadas num ambiente hostil ao tipo selvagem inalterado (Figs. 13.5 e 13.6). Um exemplo é um aumento gradual de uma toxina. Culturas de calos, suspensões de células ou culturas de meristemas são adequadas para a indução de mutações. Nas culturas de calos, assim como nas culturas de meristemas, as células não são todas expostas igualmente nem ao mutagênico, nem à mesma pressão de seleção. Conseqüentemente, um número variável de células escapa de um ou de outro. As plantas obtidas de tais culturas através da regeneração de rebentos e raízes podem ser quimeras, tal como descrito acima para as quimeras de ploidia. Uma alternativa poderia ser o uso de protoplastos, que podem ser plaqueados e selecionados após o início da cultura para serem utilizados na produção de plantas após a embriogênese somática. O plaqueamento implica a transferência de protoplastos para o ágar ainda não totalmente endurecido e, através da solidificação adicional do ágar, a sua posição é subsequentemente fixada. A posição dos protoplastos individuais na placa pode ser marcada e seu desenvolvimento posterior pode ser facilmente observado. Culturas de um determinado tamanho (centenas de células) podem ser expostas à pressão de seleção. Os problemas das seleções serão abordados novamente após a discussão da tecnologia genética. A O resumo do trabalho realizado sobre mutações antes do advento da tecnologia genética é fornecido por Jacobs et al. (1987).
A descoberta de muitas vias bioquímicas em micróbios baseou-se no uso de mutantes deficientes. Enquanto isso, mutantes de alguns sistemas vegetais mestres, como Arabidopsis ou arroz, são empregados para estudar o metabolismo de plantas superiores (metabolômica). Detalhes sobre isso são encontrados nas seções que tratam do metabolismo e da tecnologia genética deste livro.
Fig. 13.4 Distribution of % 
C-values in cell cultures of 
40
 
Hordeum vulgare during 
some subcultures with the 
30
 
application of the procedure 
20
 
described in Fig. 13.3. Until 
the 5th subculture, a transfer 
10
 
was performed at 4–6 week 
intervals and later every 
a:primary anther callus 
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RU 
2 weeks. X axes: DNA content 
in relative units, Y axes: 30 
percentage of nuclei with a 
given DNA content (Kibler 
20
 
and Neumann 1980) 
 
 
Fig. 13.5 Selective growth of barley cultures on an agar medium supplemented with a toxin 
(photograph by E. Forche) 
 
 
n 
Plants 
2n 
xn 
 
 
 
explants 
buds 
callus 
cell suspension 
plated cells 
protoplasts 
regeneration 
 
 
mutagenesis 
 
 
 
several 
cell 
divisions 
 
 
expression 
of mutation 
progeny 
genetic 
regenerated plants 
biochemical 
strain isolation 
selection 
characterization 
characterization 
 
Fig. 13.6 Examples of a program to select 
for mutations