TERAPIA GÊNICA

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RESUMO: AP2
TERAPIA GÊNICA
· O objetivo no tratamento de doenças genéticas é eliminar ou amenizar os efeitos das mesmas, não apenas do paciente, mas da família também. 
· Doenças Monogênicas são causadas por mutações com perda de função, o tratamento é direcionado para a substituição da proteína defeituosa, melhorando sua função ou minimizando as consequências da sua deficiência. No caso, mesmo que depois o tratamento ocorra e o indivíduo tiver as duas copias do gene normal, a família deverá prestar consulta contínua para a detecção dos portadores e diagnostico pré-natal. 
· Exemplos de primeiro uso da terapia gênica: curas para doenças herdadas (imunodeficiência combinada grave), com o uso da habilidade de manipular a expressão gênica com nucleotídeos análogos aparentemente seguros e a habilidade de prevenir manifestações clinicas de doenças previamente letais, incluindo as de armazenamentos lisossômicos, por terapia de substituição enzimática. 
· Muitas doenças multifatoriais que se manifestam tipicamente na adolescência ou na vida adulta, tanto os componentes etiológicos ambientais como genéticos são pouco entendidos. No caso, quando se trata de fatores ambientais, tem-se a chance de modificar o ambiente para fatores não responsáveis pela doença.
· Motivos do tratamento de doenças monogênicas serem insatisfatório: 
1. Gene não-identificado ou patogenia não-elucidada: 
2. Danos fetais pré-diagnosticados: algumas mutações ocorrem precocemente no desenvolvimento ou causam mudanças patológicas irreversíveis antes de serem diagnosticadas.
3. Fenótipos severos são menos susceptíveis a intervenção: os casos iniciais a serem reconhecidos em uma doença costumam ser os mais severamente afetados e também os menos susceptíveis ao tratamento. 
· A maioria das doenças necessitam de tratamento longos devido a fatores como o tratamento inicialmente ser bem-sucedidas, entretendo apresentar algumas imperfeições que serão observadas somente a longo prazo. Mas também, acredita-se que a terapia gênica é livre de efeitos colaterais a curto prazo pode estar associada a sérios problemas a longo prazo. 
· O tratamento mais adequado para doenças monogênicas requer um nível raro de precisão no diagnóstico, muitas vezes, um deles precisa determinar não somente o locus especifico envolvido, mas também a classe especifica do alelo no lucus.
· A heterogeneidade alélica tem implicações adicionais para a terapia, alguns alelos produzem uma proteína em menor quantidade, mas com alguma função residual. As estratégias definidas para aumentar a expressão ou estabilidade de uma proteína parcialmente funcional podem ser eficientes na correção do defeito bioquímico, em contraste, nenhum efeito será obtido com o aumento na quantidade de uma proteína mutante. 
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· Terapia direcionada ao fenótipo clinico: inclui todas as intervenções médica ou cirugicas que não são exclusivas do tratamento de doenças genéticas.
· Tratamento de anormalidades metabólicas: 
 
· Restrição alimentar: é um método terapêutico que consiste em tratar doenças que normalmente envolvem mais de uma loci, é um método que é altamente eficaz, entretanto geralmente requer o cumprimento vitalício de uma dieta restrita e muitas vezes artificial. Os nutrientes essenciais como os aminoácidos não podem ser evitados totalmente, pois sua ingestão deve ser o suficiente para as necessidades anabólicas. 
· Reposição: é um tratamento que consiste em fornecimentos de metabolitos essenciais, co-fatores , ou hormônios cuja deficiência é devida á doença simples.
· Desvio: um tratamento que se utiliza do aprimoramento de vias metabólicas alternativas para reduzir a concentração de um metabolito prejudicial.
· A inibição é um tratamento que se utiliza de enzimas para modificar anormalidades metabólicas de erros inatos.
· Depleção: Doenças genéticas caracterizadas pelo acúmulo de um composto prejudicial são às vezes tratadas por meio da remoção direta da substância do corpo. Esse princípio é exemplificado pelo uso de flebotomia para suavizar o acúmulo de ferro que ocorre na hemocromatose.
· Tratamento molecular da doença:
· Tratamento em Nível Proteico: algumas vezes se o produto proteico mutante é fabricado, pode ser possível aumentar a sua função, em outros casos a estabilidade de uma proteína mutante com alguma função residual pode ser molécula proteica anormal, pode se utilizar enzimopatias, que melhora a função obtida por esse princípio mesmo sendo pequena, na ordem de poucos por cento, mas esse acréscimo muitas vezes é suficiente para restaurar a homeostase bioquímica.
· Aumento da expressão gênica do tipo selvagem ou locus mutante: efeitos teraipeuticos podem ser obtidos por meio do aumento na quantidade de RNA mensageiro transcrito a partir de locus selvagem associado a uma doença dominante ou de um locus mutante, se a proteína mutante guardar alguma função.
· Reduzindo a expressão de um produto de um gene mutante dominante: RNA de interferência-----as mudanças patológicas de algumas doenças resultam em doenças dominantemente herdadas resultam tanto na produção de um produto gênico que é toxido para a célula quanto a contribuição diminuída do alelo selvagem da proteína normal, como efeito dominante negativo de cadeias anormais. Em qualquer uma das situações o objetivo da terapia é diminuir a quantidade da proteína mutante feita, sem inteCélulas-tronco são células auto-regenerativas definidas por duas propriedades: (1) suas habilidades
· de proliferar para formar os tipos celulares diferenciados de um tecido in vivo e (2) suas habilidades
· de auto-regeneração — para formar outra célula-tronco.rromper a produção da proteína do alelo normal. Pode se utilizar do RNA de interfência (RNAi), para degradar a um especifico RNA-alvo, como aquele que codifica a proteína mutante. Resumidamente, pequenos RNAs que correspondem a sequências específicas do RNA-alvo são introduzidos nas células, por exemplo, por transferência gênica viral. Filamentos do RNA de interferência se ligam ao RNAalvo e iniciam sua degradação.
Modificação do genoma somático por transplante: células transplantadas mentem o genótipo do doador, e, consequentemente, o transplante pode ser considerado como uma forma de terapia de transferência genica porque leva a modificação do genoma somático.
O transplante nuclear refere-se à transferência de um núcleo diplóide de uma célula somática adulta doadora, como um fibroblasto da pele, para um citoplasma de ovócito (i. e., um ovócito cujo próprio núcleo tenha sido removido) para gerar um embrião clonado.
Clonagem terapêutica é o uso de células-tronco embrionárias geradas por transplante nuclear para formar tipos celulares diferenciados em cultura. Devido ao fato de que as células derivadas a partir dessa técnica são geneticamente idênticas ao núcleo doador, elas poderiam ser usadas para transplante de célula para o doador sem receio de rejeição imune, um conceito definido como terapia de transplante nuclear ou clonagem terapêutica. 
Clonagem reprodutiva, ao contrário, refere-se ao processo de reimplantação de um embrião obtido por transplante nuclear dentro do útero de uma mãe hospedeira, com o objetivo de permitir que o embrião se desenvolva em um clone humano do doador a partir do qual o núcleo somático foi obtido. A clonagem reprodutiva é proibida em todos os países devido aos complexos assuntos éticos relacionados com a criação de clones humanos.
· Terapia gênica: um gene é introduzido em uma célula para atingir um efeito terapêutico. objetivo da terapia gênica é melhorar a saúde do paciente pela correção do fenótipo mutante. 
· Requesitos essenciais da terapia genica para um distúrbio herdado:
a. Identidade do defeito molecular 
b. Uma copia funcional do gene 
c. Conhecimento do mecanismo fisiopatológico 
d. Razãi risco-beneficio favorável 
e. Compontes reguladores apropriados para o gene transferido 
f. Uma célula-alvo apropriada
g. Forte evidência de eficácia e segurança 
h. Acordo regulatório.
· Um gene apropriadamente projetado pode ser transferido para células-alvopor uma das duas estratégias gerais. A primeira envolve a introdução do gene ex vivo (i. e., fora do corpo) em células que tenham sido cultivadas a partir do paciente e então reintroduzidas após a transferência gênica. No segundo caso, o gene é injetado diretamente in vivo dentro do tecido ou líquido extracelular de interesse (do qual é seletivamente captado pelas células-alvo). A marcação desse tipo é geralmente alcançada pela modificação do revestimento de um vetor viral de modo que somente as células designadas se ligam às partículas virais. 
· As células-alvo ideais são as células-tronco (que são auto-replicativas) ou células genitoras com sólido potencial replicativo. A introdução do gene nas células tronco pode resultar na expressão do gene transferido em uma grande população de células-filhas. Atualmente, a medula óssea é o único tecido do qual as células-tronco ou células genitoras têm sido usadas com sucesso como receptoras de genes transferidos. 
· O vetor ideal para a terapia gênica deve ser seguro, prontamente construído, e facilmente introduzido no tecido-alvo apropriado, e também deve expressar o gene de interesse por toda a vida. Atualmente, nenhum vetor — viral ou não — que preencha todas essas características foi identificado. Tipos de vetores mais comuns:
a. Uma das classes de vetores mais usadas é derivada dos retrovírus, que são vírus filamento único de RNA com apenas três genes estruturais que podem ser removidos e recolocados com o gene a ser transferido (Fig. 13-15). A atual geração de vetores retrovirais tem sido construída para tornálos incapazes de replicação. Seus outros méritos incluem o fato de serem não-tóxicos para a célula, de que somente um baixo número de cópias do DNA viral (com o gene transferido) se integra no genoma hospedeiro, que o DNA integrado é estável, e que esses vetores retrovirais podem como dar até 8 kb do DNA adicionado, possuindo espaço suficiente para muitos genes que possam vir a ser transferidos. A principal limitação de muitos vetores retrovirais é que a célula-alvo deve sofrer divisão para a integração do vírus no DNA hospedeiro, limitando seu uso em células que não sofrem divisão, como os neurônios. Lentivírus, entretanto, a classe de retrovírus que inclui o vírus da imunodeficiência humana, são capazes de se integrar ao DNA em muitas células com divisão lenta ou que não se dividem, incluindo os neurônios. Esses vetores podem realmente ser adequados para o tratamento de doenças neurológicas. 
b. Vírus adeno-associados possuem a grande vantagem de não apresentar efeitos adversos em humanos, sendo muito difundidos nas populações. Além disso, eles infectam células que se dividem ou não e podem existir tanto na forma epissômica como estavelmente integrado em um romossomo hospedeiro. Uma desvantagem é que os vetores atuais de vírus adeno-associados podem acomodar insertos de até 5 kb somente. 
c. Vetores adenovirais possuem as vantagens de poderem ser obtidos em alto título; de que vão infectar uma grande variedade de tipos celulares, que se dividem ou não; e de que podem acomodar insertos de 30 a 35 kb. No entanto, além de outras limitações, eles foram recentemente associados a pelo menos uma morte em experimentos de terapia gênica através do desencadeamento de uma forte resposta imune. Consequentemente, seu uso na terapia gênica está sendo reavaliado.
· Em princípio, vetores não-virais são atrativos porque não apresentam o risco biológico (p. ex., contaminação viral) associado aos vetores virais e porque suas preparações, pelo menos teoricamente, são mais diretas. Os vetores não-virais em desenvolvimento são de quatro tipos gerais:
a. DNA puro (naked DNA), por exemplo, um cDNA com elementos reguladores em um plasmídeo; ou RNA, como um pequeno RNA de interferência (RNAis);
b. DNA embalado em lipossomos, uma bicamada lipídica contínua envolvendo um volume aquoso;
c. conjugados de DNA-proteína, nos quais o DNA é complexado à proteína — assim como um peptídeo que se liga ao receptor na superfície celular —, que facilita a entrada do complexo nas células ou em um compartimento subcelular; e 
d. cromossomos artificiais, nos quais os componentes funcionais mínimos de um cromossomo natural são combinados com um cDNA ou gene de interesse, com elementos reguladores apropriados.
· Riscos da Terapia genica:
a. Resposta adversa ao vetor ou combinação veto-doença.
b. Mutagenese de inserção causando neoplasia maligna: ocorre quando o gene transferido cai se integrar no DNA do paciente e ativar um protocongêse ou interromper um gene supressor de tumor, levando possivelmente à neoplasia maligna. 
c. Inativação de inserção de um gene essencial
FARMACOGENÉTICA E FARMACOGÊNOMICA
· A farmacogenética é relevante para a variação individual de resposta a drogas de duas maneiras. A primeira é a variação na farmacocinética, ou seja, a taxa a que o organismo absorve, transporta, metaboliza, ou excreta as drogas e seus metabólitos. A segunda é a variação que afeta a farmacodinâmica de uma droga, ou seja, a causa genética da variabilidade da resposta à droga se deve à variação alélica dos alvos posteriores (downstream) da droga, como os receptores, as enzimas, ou as vias metabólicas. 
· A farmacogenômica, abordagem genômica para a farmacogenética, diz respeito à avaliação de variantes genéticas comuns, em geral, pelo seu impacto sobre os efeitos da terapia com drogas. Em vez de analisar genes individuais e suas variantes de acordo com o que se sabe a respeito da sua influência nas vias farmacocinéticas e farmacodinâmicas, conjuntos de alelos em um número grande de loci polimórficos (polimorfismos de um único nucleotídeo e de número de cópias; Cap. 9) estão sendo identificados de forma a distinguir os pacientes que responderam adversamente ao que foi considerado uma droga benéfica daqueles que não tiveram reação adversa. 
EPIGENÉTICA
· A epigenetica se refere aos fenótipos e processos que são transmitidos para outras células e as vezes, a futuras gerações, mas não são resultados das diferencias na sequência de bases do DNA, os seus efeitos são causados por mudanças na expressão gênica resultantes de alterações à estrutura de cromatina ou outros aspectos da estrutura do DNA, como o padrão de metilação do DNA. Logo, um fenótipo é herdado com estabilidade resultante de mudanças na cromatina sem alterações na sequência de DNA. São influenciadas por fatores ambientais. 
· A epigenetica altera a expressão do genes e essas alterações são estáveis o suficiente para serem transmitidas por mitose, mas também serem alteradas. 
· Três mecanismos moleculares que alteram a estrutura da cromatina e sustentam muitos fenótipos epigeneticos:
1. Alteração no padrão de metilação do DNA: A metilação do DNA refere-se ao acréscimo de grupos metila às bases de nucleotídios. Nos eucariotos, o tipo predominante de metilação de DNA é a metilação da citosina para produzir 5-metilcitosina. A metilação está associada à repressão da transcrição, e ocorre com frequência, nas bases de citosina que estão imediatamente adjacentes aos nucleotídeos de guanina, chamados de dinucleotideos CpG (apresenta fosfato que conecta os nucleotídeos C e G). A metilação de sequências CpG significa que duas bases citosina metiladas estão em diagonal uma da outra em fitas opostas. Antes da replicação, as bases citosina em ambas as fitas são metiladas (Figura 21.2). Imediatamente após a replicação semiconservativa, a base citosina na fita molde estará metilada, mas a base citosina na fita recém-replicada, não. Enzimas metiltransferases especiais reconhecem o estado hemimetilado dos dinucleotídios CpG e adicionam grupos metila a bases citosina não metiladas, criando duas novas moléculas de DNA totalmente metiladas. Dessa forma, o padrão de metilação do DNA é mantido durante a divisão celular. 
2. Modificações químicas das proteínas histona: Já foram detectadas mais de 100 diferentes modificações pós-tradução das proteínas histona. Muitas dessas modificações ocorrem nas caudas com carga elétrica positiva das proteínashistona, que interagem com o DNA e afetam a estrutura da cromatina. As modificações nas histonas incluem o acréscimo de fosfatos, grupos metila, grupos acetila e ubiquitina a suas caudas. Essas modificações alteram a estrutura da cromatina e afetam a transcrição dos genes. As modificações também servem como sítios de ligação para proteínas como fatores de transcrição necessários para esse processo. A adição de grupos acetila a aminoácidos nas caudas da histona em geral desestabiliza a estrutura da cromatina, fazendo com que ela assuma uma configuração mais aberta e esteja associada a mais transcrição. A metilação das histonas, também modifica a estrutura da proteína mas o efeito vaira dependendo do aminacido especifico que é metilado, alguns tipos de metilação estão associados a menos transcrição. Foi demonstrado que muitas marcas adicionais das histonas estão associadas ao nível de transcrição. Esses tipos de modificações são chamados de marcadores epigenéticos.
3. Moléculas de RNA que afetam a estrutura da cromatina e a expressão genica: O primeiro descoberto e ainda mais bem compreendido exemplo de mudança epigenética mediada por RNA é a inativação do X, na qual um longo RNA não codificado chamado Xist suprime a transcrição de um dos cromossomos X nas fêmeas dos mamíferos. Outro exemplo envolve a paramutação no milho, no qual um alelo epigeneticamente alterado induz uma mudança em outro alelo que então é transmitido para gerações futuras. Não está claro como as mudanças epigenéticas baseadas em RNA são mantidas pelas divisões celulares, embora aparentemente algumas envolvam pequenos RNAs que são transmitidos pelo citoplasma.
· Paramutação: é definida como a interação de dois alelos que leva a mudança que pode ser herdada na expressão de um dos alelos. A paramutação produz essas diferentes no fenótipo sem qualquer alteração na sequencias de bases do DNA de alelo convertido. O padrão de expressão recém-estabelecido do alelo convertido é convertido é transmitido para as gerações futuras, mesmo que o alelo que produza a alteração não esteja mais presente. O alelo alterado agora é capaz de converter outros alelos para o novo fenótipo. Nã existem diferenças associadas de sequência de DNA nos alelos alterados. 
· Mudanças epigéneticas comportamental: pode ser causado por mudanças epigeneticas induzidas pelo comportamento materno, efeitos epigeneticos do estresse precoce nos humanos (estresses durante a adolescência e infância provoca vários efeitos adversos que perduraram na vida adulta). Epigenetica na cognição (anomalidades na metilação do DNA estão associadas a distúrbios de desenvolvimento e capacidade intelectual nos humanos). Efeitos epigeneticos das substâncias químicas do ambiente.
· Epigenoma: padrão de modificações da cromatina de cada organismo. 
· Detecção da metilação do DNA: foram desenvolvidas varias técnicas para examinar os níveis de metilação de DNA, pode ser utilizado enzimas de restrição que cortarão uma sequencia que tenha 5-metilcitosina, enquanto algumas outras ezimas de restrição são insensíveis a metilação. 
· Detecção de modificações de histona: podem ser detectados por fragmentação da cromatina e aplicação de um anticorpo especifico para uma modificção especifica da histona, um processo chamado imunoprecipitação da cromatina.
· Marcadores epigeneticos de genoma inteiro: geneticistas comparam os epigenomas de diferentes tipos de celulas.