Aula_03_Processamento_de_amostras (1)

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Centro Universitário Estácio 
Disciplina: Microbiologia clinica
FASE ANALÍTICA DO DIAGNÓSTICO 
MICROBIOLÓGICO
Processamento de amostras
Profª Herlice do N Veras
Biomédica CRBM 11750 
Mestre e Doutora em Microbiologia Médica
ü Selecionar o meio de cultura adequado para amostra;
ü Determinar a temperatura e a atmosfera de incubação 
para o isolamento dos MO de potencial significado;
üDeterminar quais microrganismos isolados no meio 
primário necessitam de uma melhor caracterização;
ü Determinar se serão necessários testes de 
sensibilidade antimicrobiana
Procedimentos para
processamento de amostras
Equipamentos necessários para o 
cultivo microbiológico
As abordagens quanto a determinação dos testes devem 
atender laboratórios e clínicas em geral.
A escolha de protocolos específicos adotados de 
acordo com necessidade local. Ex.: hospital rural 
certamente diferirá de uma clínica médica urbana.
O dia da “pancultura” tenha acabado.
Nas ultimas décadas os microbiologistas tentam, segundo 
Bartlette, “ o controle de processamento”.
Procedimentos para
processamento de amostras
“Restringir o processamento de amostras de cultura a 
produção de informação relevante e útil”.
1 - Seleção de Meios de Cultura Primários;
2 - Técnicas de Transferência e Cultura de Amostras Clínicas; 
3 – Técnicas para Cultura de Amostras;
Procedimentos para processamento de
amostras
Curva de Crescimento bacteriano
A
D
B
C
Fases da Curva de Crescimento de bactérias: 
- Fase Lag ou Fase de adaptação - Fase Estacionária
- Fase Exponencial ou Logarítmica (Log) - Fase de Declínio
A C
B D
X= xo.2n
Fases de crescimento bacteriano:
A - Fase lag de crescimento ou de Adaptação:
Nesta Fase de crescimento, as bactérias estão
aumentando o conteúdo intracelular de macromoléculas e
se adaptando às condições do meio de cultura e o cultivo
em geral;
B – Fase Log de crescimento ou Logarítmica de
crescimento:
É nesta Fase de crescimento que as bactérias estão se
dividindo EXPONENCIALMENTE como demonstramos no
exercício anterior.
C – Fase Estacionária de crescimento:
Nesta Fase do crescimento, podem ocorrer 2 situações: 1)
as bactérias permanecem viáveis mas não estão se
dividindo; 2) o número de células bacterianas que se
dividem é igual ao número de células bacterianas que
estão perdendo viabilidade.
D – Fase de declínio de crescimento:
Nesta Fase de crescimento, conforme o tempo vai
passando, as células da população bacteriana vão
perdendo sua viabilidade. Então, após um determinado
tempo o número de células viáveis na população será
muito baixo e seguira caindo até que todas estejam
mortas.
Fases de uma Curva de Crescimento
Conjunto de substâncias, formuladas de 
maneira adequada, capazes de promover o 
cresc. bacteriano, em condições de
laboratório.
Diferentes espécies de bactérias, variam 
extensivamente quanto as exigências mínimas 
de substâncias nutrientes;
A maioria das bact. pode ser cultivada em 
laboratório, utilizando-se meios nutrientes;
Meios de cultura
Meios de cultura
- Fonte de Carbono e Nitrogênio;
- Fonte de Energia;
- Sais Minerais;
- Fatores de Crescimento;
- Condições Físicas;
- Esterilização.
Meios de cultura
Característica básica
Fontes de Energia - Orgânicos
- Inorgânicos
- Luz
Fontes de Carbono 
(C), Hidrogênio 
(H), 
Oxigênio (O)
- Orgânicos (Heterotróficos): Açúcares, Proteínas
- Inorgânicos (Autotróficos): CO2
Fontes de N - Orgânicos: NH4+
- Inorgânicos: NO2-, NO3-
- N2 (fixadoras de nitrogênio).
Fontes de 
P e S
- HP042-
- SO42-
Fontes de outros 
Elementos
(sais minerais)
- Na+, K+, Mg++, Fe+++
- Traços de Zn++, Mn++, Co++, Mo+++, Se++
Fatores de Crescimento
- Vitaminas
- Aminoácidos
- Fatores presentes no SANGUE
pH - Acidófilos
- Neutrófilos (pH 5-9)
- Alcalófilos
Osmolaridade ~ solução fisiológica (0,9% NaCl)
Macronutrientes
Micronutrientes
Fatores de Crescimento
Nutrientes necessários para o cultivo
M
ac
ro
nu
tr
ie
nt
es
Mic
ronu
trien
tes
Fatores de Crescimento
-Vitaminas
- Aminoácidos
- Fatores presentes no SANGUE
Micr
onu
trien
tes
Nutrientes necessários para o cultivo
Ágar Sangue (meio completo suplementado com 5% de 
sangue desfibrinado de carneiro adicionado ao meio 
quando este estava abaixo de 40ºC):
Colônias de bactéria Neisseria gonorrhoeae cultivadas. 
Ágar Chocolate (meio completo suplementado com 5% de sangue 
desfibrinado de carneiro adicionado ao meio solido quando este ainda 
estava quente: 
Colônias de bactéria Haemophilus influenzae cultivadas. 
Condições de Cultivo
pH
Cada bactéria cresce em
máxima velocidade quando é
incubada no seu pH ótimo
específico.
O pH ótimo de crescimento da
maioria das bactérias de vida
livre apresenta um intervalo de
cerca de três unidades. Veja a
simetria das curvas abaixo e
acima deste pH ótimo.
Fora destes intervalos de pH
ótimo especifico para cada
bactéria, o crescimento não
ocorre.
A maioria das bactérias de
interesse médico crescem
com máxima velocidade em
pH 7
Fig. Taxa de crescimento versus pH de três tipos de
procariontes.
Temperatura - Psicrófilos
- Mesófilos (maioria das bactérias de interesse médico) 
- Termófilos
Thermus aquaticus
Min. 40 oC
Ótima:70-72 oC
Máxima: 79 oC
Condições de Cultivo
Temperatura 
Cada bactéria cresce em
máxima velocidade quando é
incubada sua temperatura
ótima de cultivo.
Fora destes intervalos de
temperatura, a velocidade do
cultivo diminui.
A maioria das bactérias de
interesse médico crescem
com máxima velocidade a
37 oC.
Mesófilo
s
- Aeróbias Obrigatórios
- Aeróbias Facultativas
- Anaeróbias Facultativos 
- Anaeróbias Estritas
O metabolismo aeróbio gera radicais de oxigênio. Bactérias aeróbias tem enzimas 
que conferem resistência a estes radicais. De modo simplificado, veja abaixo: 
A) 2 02 + 2 H2 H202
B) H202 H20 + 02
Condições de Cultivo
Concentração de Oxigênio 
Quanto a capacidade de 
cultivo na
presença de Oxigênio
(atmosfera),
as bactérias podem ser:
A distribuição das enzimas
- superóxido dismutase (SOD), 
- catalase, e 
- peroxidase
em células determina a sua capacidade de existir na presença de O2.
Estas enzimas desintoxicam as células de radicais livres de oxigênio,
que são inevitavelmente gerados pelos seres vivos que vivem na
presença de O2.
Superóxido dismutase
catalase
a) Aeróbias obrigatórias – Ex. Pseudomonas
b) Anaeróbias – Há estritas (Clostridium) e não estritas 
c) Aeróbias Facultativas – Ex. Escherichia coli (crescem 
mais rapidamente em presença de O2)
d) Microaerófilas – Crescem em tensão intermediária de O2
e) Anaeróbias Aerotolerantes – Crescem de modo 
semelhante independemente da em tensão de O2
-De acordo com seu conteúdo físico, os meios de cultura podem 
ser líquidos ou caldos, semi-sólidos e sólidos.
Líquidos ou caldos: crescimento indiscriminado com turvação do 
meio
Semi-sólido: adição de menor quantidade de ágar, mobilidade 
bacteriana
Sólidos: crescimento de colônias isoladas, muito uitilizado para 
culturas puras
-
- De acordo com seu conteúdo químico, os meios de cultura 
podem ser sintéticos ou complexos.
Meios de cultura
Classificação
Meios de Cultura
1. Meios Básicos: São os de uso geral, podem ser usados 
como base no preparo de outros meios.
2. Meios de Enriquecimento: geralmente líquido, de 
composição química rica em nutrientes, com a finalidade 
de permitir que as bactérias contidas em uma amostra 
clínica aumentem em número.
Ex.: Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo Tetrationato.
Processamento de amostras
Meios de Cultura
3.Meio Diferencial: possibilita a distinção entre vários gêneros e
espécies de microrganismos, por possuir substâncias que
permitem uma diferenciação presuntiva, evidenciada na
mudança de coloração ou na morfologia das colônias.
Ex.: Agar EMB, Agar McConkey e Agar Hektoen.
4.Meio Seletivo: a finalidade deste tipo de meio é selecionar as
espécies que se deseja isolar eimpedir o desenvolvimento de
outros germes (adição de corantes, antibióticos e outras
substâncias com capacidade inibitória para alguns germes.
Ex.: Agar Manitol Salgado e Agar SS
Processamento de amostras
Processamento de amostras
Meios de Cultura
5. Meio de Transporte: consiste em um meio isento de
nutrientes, contendo um agente redutor (Tioglicolato ou cisteína).
Geralmente mantém o pH favorável, previne a desidratação de
secreções durante o transp. e evita a oxidação e auto-destruição
enzimática dos patógenos presentes.
Ex.: Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair e Caldo Tioglicolato.
Possíveis Defeitos no Preparo dos Meios:
Desvios no valor do pH água não neutra; frasco mal fechado; 
superaquecimento durante a preparação; meio de cultura 
dessecado ou c/ validade vencida.
Turbidez e precipitação água insuficientemente deionizada; 
recipientes de preparo mal lavados; pH incorreto ou desajustado; 
superaquecimento durante a preparação; substâncias empregadas 
c/ impurezas.
Meios de cultura contaminados esterilização insuficiente; 
contaminação acidental.
Processamento de amostras
Possíveis Defeitos no Preparo dos Meios:
Pouco crescimento de microrganismo presença de inibidores 
do crescimento; microrganismos já alterados no material 
investigado; pH incorreto; aditivos mal dosificados; 
superaquecimento na preparação.
Excessivo crescimento de microrganismos superaquecimento 
na preparação com destruição de substâncias inibidoras; 
aditivos mal dosificados; inoculo excessivo de m.o.
Crescimento atípico meio de cultivo errado ou mal preparado; 
com prazo de validade vencido; condições de cultivo 
inadequadas.
Processamento de amostras
Técnicas de Inoculação
- Técnica de esgotamento por meio de estrias superficiais: 
A amostra é semeada na superfície do meio solidificado com 
uma alça de semeadura para esgotar a população, assim em
algumas regiões do meio, células individuais estarão 
presentes
Técnicas para Cultura de Amostras
- Técnica de Spread-plate ou distensão
A amostra é diluída em tubos com meios liquefeitos
(45 °C). Após homogeneização são distribuídos em
placas de Petri.
Após a solidificação dos meios as placas são incubadas. As 
colônias se desenvolverão tanto acima quanto abaixo da 
superfície (colônias internas).
Técnicas para Cultura de Amostras
Técnicas para Cultura de Amostras
- Métodos de inoculação de tubos c/ meio líquido/sólido em 
tubo de ensaio.
Técnicas para Cultura de Amostras
Obrigada!
Construção de mapa mental
´ Assuntos:
1. Staphylococcus aureus 
2. Streptococcus pneumoniae
3. Pseudomonas aeruginosas
4. Escherichia coli uropatogênica
5. Shigella dysenteriae
6. Klebsiella pneumonia
Abordagem: Morfologia, patogenicidade, transmissão, 
manifestações clínicas, diagnóstico, tratamento.
Valendo até 
dois pontos!