Diagnostico-virologico-nutricao-2018

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Diagnóstico Virológico
Para que serve?
Importância do Diagnóstico Laboratorial
• Diferenciação de agentes que causam a mesma 
síndrome clínica
• Identificação de patógenos novos
• Diferenciação de fases de doença
• Triagem e avaliação de tecidos e órgãos
• Imunidade pós vacinal
• Vigilância epidemiológica
• Estudo epidemiológico
• Iniciar tratamento específico
Tipos de métodos diagnósticos
Métodos Direitos
Pesquisam elementos 
da partícula viral
(antígenos, genoma, 
partícula inteira)
Métodos 
Indireitos
Pesquisam 
RESPOSTA do 
hospedeiro 
(Anticorpos)
Tipos de métodos diagnósticos
Métodos Clássicos
Isolamento viral em 
sistema hospedeiro
Métodos Rápidos
Imonológicos
Biologia Molecular
Microscopia eletrônica
Tipos de Amostras
Tipos de Amostras
Métodos clássicos: Isolamento viral
Métodos clássicos: Isolamento viral
Cada tipo de vírus vai 
exigir uma cultura celular 
diferente!
Cultivo Celular
Cultura Primária
Cultura Diplóide
Cultura imortal
Efeito Citopático (ECP): 
alterações que a replicação 
viral causa à célula hospedeira
Efeitos Citopáticos (ECP)
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
DIRETA
Detecção de ANTÍGENOS 
virais no interior das 
células
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA
Detecção de ANTICORPOS
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO 
DIRETO
Detecção de ANTÍGENOS
virais em fluidos (ex. 
sangue)
Diagnóstico Imunológico
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO 
INDIRETO
Detecção de ANTICORPOS
Diagnóstico Imunológico
Ensaio 
imunoenzimático
sanduíche
Ensaio 
imunoenzimático
competitivo
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico Imunológico
Diagnóstico rápido
Hemaglutinação:
- Capacidade de alguns 
vírus em aglutinar 
hemácias 
- Rápida, fácil execução
- Não identifica 
exatamente um vírus; 
restrito
Diagnóstico rápido
Inibição da Hemaglutinação:
- Capacidade de alguns vírus 
em aglutinar hemácias é 
bloqueada por anticorpos 
específicos contra 
determinado vírus 
quantificação!
- Rápida, fácil execução, 
identifica exatamente um 
vírus; 
- Restrito
Técnicas Moleculares
Informação codificada para vida!
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Ampliar o número de determinada sequência 
de DNA 
Mimetizando a duplicação in vivo!
• Aquecimento – Resfriamento cíclico
• Temperatura máxima ~100°C 
• Temperatura de desnaturação ~95°C
• Temperatura ótima Taqpolimerase ~72°C
• Anelamento: variável
In vitro
http://biologiateista.blogspot.com.br/2010/09/complexidade-da-vida-parte-i-dna.html
Reação em cadeia da polimerase - PCR
http://biologiateista.blogspot.com.br/2010/09/complexidade-da-vida-parte-i-dna.html
• Primers (iniciadores) DNA:
• Senso e Anti-senso
• Complementariedade à sequência alvo do 
gene: desenhados!
• Permitem a ação da Taq
In vitro
http://www.pcrstation.com/pcr-primer/
Reação em cadeia da polimerase - PCR
http://www.pcrstation.com/pcr-primer/
In vitro
http://www.norgenbiotek.com/display-product-pcr-dntp.php?ID=237 http://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html
Reação em cadeia da polimerase - PCR
http://www.norgenbiotek.com/display-product-pcr-dntp.php?ID=237
http://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html
PC
. 
In vitro
Água autoclavada e deionizada: completa o volume
final da reação
Tampão 10X concentrado: 10 mM Tris-HCl pH 8,0 ,
50mM KCl  mantém o pH ótimo para a reação
Cloreto de Magnésio (MgCl2): otimiza a atividade da
Taq polimerase. Concentração: 0,5 a 2,5 mM
dNTP mix
10x buffer MgCl2 Taq pol
Reação em cadeia da polimerase - PCR
PC
DNA polimerase
Reagentes do PCR
Primer Sense
Primer Antisense
Reação em cadeia da polimerase - PCR
PC
Ciclagem (30 – 40x)
Desnaturação do DNA (95°C – 30’’ a 1’)
Temperatura de anelamento variável
Extensão 72°C (30’’ a 1’)
Desnaturação Inicial
95° 10’
Extensão Final 
72°C 7’
Temperatura de anelamento ~5°C abaixo da Tm (melting Temperature) do primer;
Para calcular Tm de um primer : 2 (A + T) + 4 (G + C)
Reação em cadeia da polimerase - PCR
PC
Reação em cadeia da polimerase - PCR
PC
• 35 a 100 nuc/seg
• 1 minuto = 1,2kbp
Reação em cadeia da polimerase - PCR
PC
DNA?? CADÊ???
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Eletroforese 
• Agarose ou Poliacrilamida
A separação é feita por peso molecular de casa 
amostra que migra no gel devido a corrente elétrica
Eletroforese - visualização
O Brometo de Etídio -intercalante de DNA- fluoresce em UV
Variações do PCR: Nested
Nested PCR pode ser uma alternativa para
melhorar a especificidade e a sensibilidade da 
PCR
1o PCR: primers externos
Produto do 1o PCR : 
template para o 2º PCR
2o PCR: primers internos
Produto do 2º PCR 
- Para vírus de genoma RNA, pesquisa de RNAm
-Realização da reação de 
transcrição reversa ->
Transcriptase Reversa
-Cuidados a tomar durante o 
preparo do c-DNA
Variações do PCR: RT-PCR
Ensaio quantitativo, rápido, dispensa 
realização do gel
Variações do PCR: PCR em tempo real
Baseado na emissão de fluorescência e detecção 
por Laser
• TaqMan
• Syber Green
• Molecular beacon
PCR em Tempo Real
Novaes et al 2004
TAqMan
Novaes et al 2004
Sybr Green®
Novaes et al 2004
http://www.gene-quantification.de/chemistry.html
http://www.gene-quantification.de/chemistry.html
Quantificação: Curva de calibração 
a partir de concentrações 
conhecidas de DNA
Representação de um plot da 
amplificação em tempo real: 
3 fases
 linha basal: não houve 
clivagem suficente do 
corante-repórter para que se 
possa detectar a 
fluorescência
 fase log: a quantidade de 
amplicon dobra a cada ciclo
 fase platô: não há mais 
aumento no número de 
ampliconsxx
PCR em Tempo Real