PCR - A técnica e aplicações

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A Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR)
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará
Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas
Genética
Docente: Prof. Dr. Carlos Rocha
Discentes: Aline Luane Rodrigues de Lima
Jade Camila de Oliveira Assunção
Conhecer o contexto histórico do desenvolvimento da PCR;
 Entender o conceito da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
 
Compreender as etapas da técnica; 
Demonstrar suas aplicações; 
Conhecer as variações da PCR
Objetivos
O princípio da PCR foi descrito pela primeira vez
em 1971;
Em 1983 que o bioquímico Kary Mullis e seus
colegas fizeram os ensaios experimentais e ajustes
necessários para torná-la executável;
Em 1985, Kary Mullis apresentou sua descoberta à
comunidade científica através de uma publicação
na Revista Science;
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Contexto histórico
Kary Banks Mullis (1944-2019)
Em 1986, a descoberta da bactéria Termus aquaticus e extração de sua DNA
Polimerase (Taq DNA Polimerase) possibilitou o aperfeiçoamento da técnica, que
não necessitava de adição de mais DNA Polimerase a cada ciclo, pois a mesma
suporta temperaturas acima de 100°C
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Contexto histórico
Bactéria termofílicaTermus aquaticus Taq DNA Polimerase
Em 1987, com a patente da PCR por parte da Perkin,
desenvolve-se a automação para o controle do aumento e
redução da temperatura, neste momento surge o
Termociclador;
Em 1992, foi desenvolvido o primeiro teste diagnóstico
desenvolvido para HIV, descartando o problema da janela
imunológica estabelecida pelo virus
 Uma das aplicações da PCR: diagnóstico de doenças 
 infecciosas
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Contexto histórico
Em 1994, Kary Mullis, devido à relevância de seu trabalho recebeu o prêmio
mais importante da ciência, o Prêmio Nobel, na área de química.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é
uma técnica rotineira de laboratório utilizada
para amplificar ou fazer bilhões de cópias de
uma determinada sequência específica de
DNA em um tubo de ensaio, sendo realizada de
uma maneira rápida, prática e barata;
A PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction,
é uma técnica que pode ser executada
inteiramente in vitro, sem o uso de células.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Definição
Muitos dos avanços da Biologia Molecular ocorreram, em grande parte,
graças ao sucesso da técnica PCR, assim como a execução de projetos
desafiadores como o sequenciamento do genoma humano;
Renovações na PCR originaram variações, como a PCR em tempo real
(qPCR) e a PCR digital (dPCR)
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica
 A PCR reproduz o processo de duplicação ou replicação do
DNA em um tubo de ensaio, porém, com algumas diferenças;
A primeira é que a amplificação não será de todo o material
genético da célula mas de um único fragmento (um gene ou
região que se queira estudar;
A segunda é que a duplicação será feita repetidamente (por
isso, "reação em cadeia") para que o número de cópias do
segmento seja aumentado várias vezes
 A PCR é conduzida em um pequeno tubo contendo sete componentes
básicos:
 A enzima DNA Polimerase termoestável
 Os nucleosídeos trifosfatados
 A amostra de DNA a ser amplificada
 Um par de primers específicos
 Íons magnésio
 Um tampão
 Água 
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica
Origem do DNA a ser amplificado: genômica, mitocondrial, de cloroplasto, etc;
Obtido por amostra sanguinea, esfregaço bucal, tecidos, isolado de células, fluidos
corporais e até em substratos inorgânicos;
Moléculas de RNA DNA, por meio de transcrição reversa;
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A técnica
Desnaturação inicial: temperatura é aumentada para 95°C de 2-5 minutos
a) desnaturação: 95°C por 30 s
b) anelamento : 57° C por 30 s
c) extensão: 72°C por 60 s
1.
A alta temperatura é capaz de quebrar as ligações de hidrogênio
2. Termociclagem: 
3. Extensão final
72°C por 10 minutos
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica
Ao fim da termociclagem, ocorre a
polimerização do produto da reação:
amplicon.
No final de todo o processo, o amplicon pode
ser visualizado por meio de eletroforese em
gel de agarose.
Aplicações em pesquisas de genomas
humanos e de diferentes organismos;
Inserção ou clonagem de genes em
vetores, análise da expressão gênica;
Mutagênese sítio-dirigida;
Diagnóstico de doenças genéticas,
infecciosas e câncer
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Aplicações
Evidências forense e perfil
genético;
Identificação de suspeitos de
crimes;
Determinação ou exclusão de
paternidade;
Identificação de vítimas a partir
de restos humanos;
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Aplicações
Estudos filogenéticos;
Paleobiologia;
Biotecnologia agrícola;
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Aplicações
Os testes moleculares RT-PCR são feitos a partir da
coleta de mucosa nasal ou da garganta e
permitem a detecção do vírus já nos primeiros dias
de sintomas, mesmo antes da produção de
anticorpos.
A PCR detecta o RNA do vírus através da
amplificação da amostra analisada
A coleta pode ser feita a partir do 3° dia de
sintomas
Teste de Covid-19
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Aplicações
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR em tempo real (qPCR)
Análise quantitativa;
Propicia a mensuração da quantidade
do amplicon presente ao longo da
reação, permitindo uma quantificação;
Uso de primers fluorescentes e um
termociclador apropriado; 
Requer menor concentração de
DNA/cDNA
Ex: quando se deseja estimar o número
de partículas virais em uma amostra ou a
quantidade de material transgênico em
um produto alimentício.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR digital(dPCR)
Sensibilidade superior;
Baseada no princípio da diluição limitante;
Informa o número exato de moléculas de DNA oriundas
de um patógeno;
Detecção de células tumorais em estágios iniciais da
doença, mutações raras, exames pré-natais, DNAs de
patógenos em baixas concentrações de fluidos
corporais;
Conclusão
"O sucesso da PCR impactou em várias áreas além da biologia molecular,
destacando-se o baixo custo da técnica e sua contínua renovação, e mesmo anos
após sua invenção, se sustenta como uma técnica atual e permanece como o
ápice da Biologia Molecular devido às suas elevadas especificidade, sensibilidade,
reprodutibilidade e aplicações variadas em diversos campos." (OLIVEIRA, E. H. D;
PEREIRA, T. C)
Referências:
OLIVEIRA, E. H. D; PEREIRA, T. C. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Genética na Escola,
São Paulo, 2019, Vol. 14, n°2. Disponível em: <https://www.flipsnack.com/Eveli/revista-gen-tica-na-escola-
vol-14-n-2/full-view.html>. Acesso em: 12 abr. 2021
CÂMARA, Bruno. Reação em Cadeia da Polimerase - PCR. Biomedicina Padrão. Disponível em:
<https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/10/reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr.html> Acesso em:
12 abr. 2021
HAAS, D. J.; TORRES, A. C. D. Aplicações das Técnicas de PCR no Diagnóstico de Doenças Infecciosas
dos Animais. Revista Científica de Medicina Veterinária, São Paulo, 2016, n° 26. Disponível em:
<http://faef.revista.inf.br/imagens_arquivos/arquivos_destaque/5D3Iu05EHeEnqPl_2017-1-12-8-29-47.pdf>
Acesso em: 16 abr. 2021
NOVAIS, C.M; ALVES, M.P. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Edição nº
33. 2004. Disponível em:
<https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4355693/course/section/2085886/real%20time%20pcr%20basic
o.pdf> Acesso em: 21 abr. 2021
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