PRÁTICA 5 - ATIVIDADE PEROXIDÁSICA EM EXTRATO BRUTO VEGETAL

Prévia do material em texto

PRÁTICA 5 - ATIVIDADE PEROXIDÁSICA EM EXTRATO BRUTO VEGETAL
19.09.2023
1 Fundamento da técnica
A medição da atividade peroxidásica em extratos brutos vegetais é uma técnica fundamental na pesquisa e na indústria alimentícia. Ela se baseia na capacidade das peroxidases (POD), uma classe de enzimas amplamente encontradas em plantas, de catalisar a oxidação de substratos específicos, como o guaiacol, na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2). Essa reação enzimática resulta na formação de um produto oxidado com coloração castanha. O processo começa com a preparação do extrato bruto vegetal, que contém uma variedade de proteínas, incluindo a enzima peroxidase. Em seguida, é adicionado o substrato guaiacol e o peróxido de hidrogênio ao extrato. A peroxidase presente no extrato age como catalisadora na reação de oxidação do guaiacol pelo H2O2. A reação química envolve a transferência de elétrons, onde o guaiacol é oxidado para formar um produto oxidado, e o H2O2 atua como o agente oxidante.
A formação do produto oxidado resulta em uma mudança de cor no meio de reação, passando de incolor para castanho. Esta alteração de cor é diretamente proporcional à quantidade de produto oxidado formado, que, por sua vez, está relacionada à atividade da peroxidase presente no extrato vegetal. Quanto maior a atividade enzimática da peroxidase, mais rápido ocorre o escurecimento do extrato devido à formação do produto oxidado.
A quantificação da atividade enzimática é realizada através de um espectrofotômetro, um instrumento que mede a absorvância da luz em diferentes comprimentos de onda. Neste caso, a leitura é feita a 470 nm, que é a faixa de comprimento de onda na qual o produto oxidado absorve a luz. Quanto maior a absorvância a 470 nm, maior a atividade enzimática da peroxidase no extrato.
A atividade enzimática é expressa em unidades de atividade por unidade de tempo por quantidade de enzima, como µmol/min/g de proteína. O cálculo é realizado com base na variação na absorvância ao longo do tempo, refletindo a taxa de formação do produto oxidado. A quantidade de proteína presente no extrato é usada para normalizar a atividade, garantindo uma medida precisa da atividade por unidade de proteína.
Essa técnica desempenha um papel crítico na pesquisa científica, na indústria alimentícia e em diversas outras áreas, permitindo a avaliação da atividade peroxidásica em extratos vegetais. Ela é essencial para compreender e controlar o escurecimento de alimentos após a colheita e o processamento, bem como para a produção de peroxidases vegetais de alto valor comercial com inúmeras aplicações, desde análises clínicas até o tratamento de resíduos. Portanto, a aula prática sobre esse tema apresenta grande validade para o conhecimento sobre a importância da atividade das peroxidases na área dos alimentos.
2 Objetivo do experimento
Construir curvas de progresso da oxidação de guaiacol catalisada por peroxidase de fonte vegetal em diferentes concentrações de enzima; quantificar atividade geral (A - U/mL) e atividade específica peroxidásica (Ae – U/mg de proteína) em extrato bruto vegetal.
3 Material/equipamento utilizados na prática
Extrato bruto de fonte vegetal (EB), Béquer (50 mL) (20 unidades), Pisseta com água destilada, Pipetas automáticas (P1000 (01), P100 (01) ou P200 (01)), Ponteiras, Cronômetro, Espectrofotômetro, Cubetas.
4 Roteiro dos procedimentos
5 Dados obtidos no experimento
	Tabela 1: Dados de absorbância para oxidação do guaiacol catalisada por peroxidase de Guaiacol
	Tempo (seg)
	Volume de amostra 
	 
	0,01 mL
	0,02 mL
	0,03 mL
	0,04 mL
	0,05 mL
	20
	0,0060
	0,0330
	0,0280
	0,0130
	0,0550
	40
	0,0080
	0,0390
	0,0320
	0,0290
	0,0840
	60
	0,0110
	0,0480
	0,0500
	0,0510
	0,1110
	90
	0,0140
	0,0650
	0,0770
	0,0830
	0,1480
	120
	0,0180
	0,0800
	0,1010
	0,1110
	0,1820
	150
	0,0240
	0,0930
	0,1250
	0,1380
	0,2130
	180
	0,0280
	0,1080
	0,1430
	0,1610
	0,2430
	240
	0,0390
	0,1350
	0,1830
	0,2070
	0,3000
	Coef. x
	0,0001
	0,0005
	0,0005
	0,0010
	0,0016
Tabela 2. Atividade peroxidásica de extrato bruto de Rabanete: Vi (µmol/min), A (U/ml) e Ae (U/mg).
	#
	Volume de amostra (mL)
	Coef angular
	Vi (µmol/min) 
	A
	Ae 
	
	
	
	
	 (U/mL) 
	(U/mg)
	1
	0,01
	0,0001
	0,0007
	0,0677
	0,2165
	2
	0,02
	0,0005
	0,0034
	0,1692
	0,5414
	3
	0,03
	0,0005
	0,0034
	0,1128
	0,3609
	4
	0,04
	0,0010
	0,0068
	0,1692
	0,5414
	5
	0,05
	0,0016
	0,0108
	0,2165
	0,6929
	 
	Média A:
	0,1504
	0,4812
6 Resultados da aula
Figura 1. Curvas de progresso para oxidação do guaiacol catalisada por diferentes quantidades de extrato bruto de peroxidase de rabanete.
7 Conclusão/comentários finais sobre a resolução
Na presente prática, foi avaliada a atividade peroxidásica em extrato bruto vegetal, no qual construímos curvas de progresso da oxidação de guaiacol catalisada por peroxidase de fonte vegetal em diferentes concentrações de enzima. A partir disso, quantificamos a atividade geral e específica em extrato bruto vegetal. 
Conforme o exposto da aula prática presente, é possível afirmar que é fundamental a compreensão da atividade das enzimas. A sua importância é inenarrável, visto que são bastante utilizadas na indústria de alimentos para realizar a obtenção dos produtos de forma rápida e grande aproveitamento do substrato.