AULA 5

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BIOLOGIA MOLECULAR E
DIAGNÓSTICO POR DNA
AULA 5
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Prof. Thiago Yuiti Castilho Massuda 
IDENTIFICAÇÃO HUMANA PELO DNA
CONVERSA INICIAL
A identificação humana sempre foi um desafio para a humanidade, e com os recentes avanços da
genética e da biologia molecular, os exames de dna para fins forenses tornaram-se rotina.
Nesta aula estudaremos o processo de identificação humana pelo dna, as  técnicas empregadas e
os marcadores utilizados na rotina atual.
Os avanços da biologia molecular popularizaram esses exames, e conhecer profundamente os
princípios desses métodos é fundamental para o profissional do futuro.
TEMA 1 – HITÓRIA DA IDENTIFICAÇÃO HUMANA E DA GENÉTICA
FORENSE
Neste tópico, veremos inicialmente alguns conceitos importantes e um pouco da história da
identificação humana até a descoberta dos marcadores moleculares.
1.1 CONCEITOS
1.1.1 IDENTIDADE
Vem do latim identitatis, idem (“o mesmo”). Segundo Rabello (1996), identidade “É a propriedade
de cada ser, concreto ou abstrato, animado ou inanimado de ser ele próprio e não outro”.
Princípio de identidade de Aristóteles: “Uma coisa não pode, ao mesmo tempo, ser e não ser”.
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Conceito prático de identidade: é um conjunto de sinais, propriedades e características que
individualizam um ser ou uma coisa, entre muitas ou entre todas.
1.1.2 IDENTIFICAÇÃO
Trata-se do ato de identificar. São processos e manifestações mediante os quais se pode
determinar e estabelecer uma identidade.
Identidade seria um conjunto de atributos, e identificação, a determinação desses atributos,
obedecendo a métodos e processos.
Dispositivos legais:
Art. 5º, inciso lviii, da Constituição Federal;
Lei n. 12.037/2009, art. 3º, i-iv.
1.1.3 RECONHECIMENTO
Reconhecer é o ato de “conhecer para depois reconhecer”; ou seja, precede um ato de conhecer.
Trata-se de um método subjetivo para lembrar de algo ou alguém e, pelo caráter subjetivo, não serve
como identificação.
1.2 IDENTIFICAÇÃO HUMANA
São os diversos processos, métodos e sistemas que estabelecem a identidade de uma pessoa
viva ou morta, ou ainda seus restos cadavéricos.
Na história da identificação humana, os primeiros registros dão conta de que as pessoas eram
identificadas apenas pelo nome, o que obviamente permitia muita alteração, sem contar a
possibilidade de pessoas com o mesmo nome – fato que chamamos de homonímia.
Do século xviii temos registros do uso de ferretes (ferro em brasa), mutilação ou tatuagens para
marcar criminosos e possibilitar sua identificação. Já no século xix, a fotografia passou a ser
amplamente utilizada para o mesmo fim, ainda que permitisse alguns tipos de fraude.
1.3 FORMAS DE IDENTIFICAÇÃO
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Judiciária/policial:
Cível (cnh, rg, cpf, título de eleitor, passaporte);
Criminal (ficha criminal, i.p., processo penal).
Pericial:
Cível (medicina legal, odontolegal, dna e papiloscopia);
Criminal (medicina legal, odontolegal, dna, papiloscopia, fonética forense, retrato falado).
1.4 HISTÓRICO DA GENÉTICA FORENSE
Como em outras áreas, a genética forense emergiu e se desenvolveu de forma gradual ao longo
do tempo. Após a descoberta dos grupos sanguíneos abo por Landsteiner em 1900, os tipos
sanguíneos humanos foram usados para identificação humana, e uma base científica sólida começou
a fundamentar a genética forense.
Em 1910, o criminologista francês Edmond Locard propôs o princípio de troca de Locard,
sintetizado na frase “Todo contato deixa vestígios”, e estabeleceu as bases para a ciência forense
moderna. Dezesseis anos depois, Thomas Hunt Morgan propôs a teoria cromossômica da herança,
indicando as estruturas celulares responsáveis pela hereditariedade.
Em 1953, a descoberta da estrutura helicoidal da dupla hélice do dna permitiu o início da
pesquisa genética em nível molecular. Outras descobertas após a década de 1950 aprimoraram o
conhecimento que hoje temos sobre genética forense.
Ao longo do tempo, a genética forense apresentou quatro fases, caracterizadas pelo uso de
marcadores:
1. Morfológica;
2. Citológica;
3. Bioquímica;
4. Molecular.
Diferentes tipos de polimorfismos ou marcadores genéticos são utilizados para estudos de
genética médica, identificação humana, análise forense e de genética de populações. Historicamente,
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não raro a descoberta de um marcador em uma dessas áreas fomenta estudos em outra.
Embora se acredite que a genética forense seja uma área recente da ciência, e que somente com
a genética molecular os crimes passaram a ser investigados com polimorfismos genéticos, isso não é
correto. Por muito tempo predominaram estudos que envolviam polimorfismos proteicos – hoje
também chamados de polimorfismos clássicos –, como objetos de estudo sobre a variabilidade
genética humana.
Os estudos de polimorfismo mais difundidos foram os de grupos sanguíneos, de proteínas de
complexo de histocompatibilidade (hla), de imunoglobulinas e de outras proteínas plasmáticas ou
presentes nas hemácias. Alguns desses polimorfismos clássicos foram amplamente utilizados tanto
em investigações criminais quanto em exames de exclusão de paternidade.
Entretanto, é consenso o fato de que, após os avanços da biologia molecular nos últimos 30
anos, a genética forense passou a ser indispensável em investigações criminais e exames de vínculo
de parentesco genético. O dna pode ser encontrado em todos os fluidos e tecidos biológicos
humanos, tem alta estabilidade química e está presente em todas as células nucleadas do organismo,
o que facilita sua obtenção. Regiões não codificantes do dna – ou seja, em que o dna não produz
proteínas – são justamente as que possibilitam análises de dna para identificação humana, vínculo
genético em casos criminais, testes de paternidade cíveis ou estudos populacionais.
As décadas de 1970 e 1980 foram cruciais para o desenvolvimento das principais técnicas
moleculares que permitiram lançar as bases para o avanço da genética forense como ferramenta
fundamental na identificação humana. Entre esses avanços, destacam-se a análise de polimorfismos
de minissatélites por Alec Jeffreys, o aprimoramento da técnica da reação em cadeia da polimerase
(polymerase chain reaction – pcr) por Kery Mullis e o sequenciamento de moléculas de dna por
Frederick Sanger.
A década de 1980 foi fundamental para o avanço da biologia molecular e da genética forense. Foi
nesse período que Alec Jeffreys, da Universidade de Leicester, desenvolveu a técnica que permitiu
analisar os polimorfismos do tipo minissatélites – ou, como ele denominou, simple tandem-repetitive
regions of dna, ou variable number of tandem repeats (vntrs) – dispersos em grande número pelo
genoma humano como ferramenta de identificação.
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Na mesma década, Kery Mullis conseguiu aprimorar a pcr, técnica que permitiu a duplicação in
vitro de forma exponencial de determinadas regiões do dna, possibilitando analisar amostras mesmo
com reduzidas concentrações de material genético. Foi uma revolução em várias áreas,
particularmente na forense, visto que a maioria dos vestígios apresenta quantidades reduzidas de
amostra, muitas vezes degradadas ou ricas em contaminantes.
Com os avanços do período, a identidade genética pelo dna passou a ser empregada para
demonstrar a culpabilidade dos criminosos, exonerar os inocentes, identificar corpos e restos
humanos em desastres aéreos e campos de batalha, determinar paternidade com confiabilidade
praticamente absoluta, elucidar trocas de bebês em berçários e detectar substituições e erros de
rotulaçãoem laboratórios de patologia clínica.
TEMA 2 – REVISANDO CONCEITOS
Vamos revisar conceitos importantes de genética que serão fundamentais para entendermos o
uso do dna na identificação humana e nos testes de paternidade. Esses conceitos formam a base da
genética forense, e é extremamente importante que estejam bem consolidados antes de avançarmos.
A seguir, os principais conceitos que utilizaremos:
Alelos: formas alternativas do mesmo gene. Alelo dominante expressa seus efeitos no fenótipo,
mesmo em seres heterozigóticos; já o alelo recessivo é aquele cujos efeitos fenotípicos não se
verificam nos seres heterozigotos, apenas nos homozigotos recessivos;
Alossomo: cromossomos relacionados à determinação do sexo;
Árvore genealógica: árvores de família que demonstram a segregação de fenótipos e alelos ao
longo de várias gerações em indivíduos com relação de parentesco;
Autossomo: qualquer cromossomo não sexual;
Cariótipo: conjunto de todos os cromossomos de uma célula, como visto durante a metáfase
mitótica;
Citogenética: enfoque citológico da genética, envolvendo principalmente o estudo
microscópico dos cromossomos;
Cromatina: complexo formado por dna e proteínas (histonas) que constitui os cromossomos
das células eucarióticas;
Cromossomos: estruturas formadas por dna, às vezes associadas a proteínas ou rna;
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Cromossomos homólogos: cromossomos que se pareiam um com o outro na meiose;
Eucromatina: região cromossômica que se cora normalmente. Contém os genes normalmente
funcionais;
Éxon: qualquer trecho não intron da sequência codificante de um gene; juntos, os éxons
constituem o mrna e são traduzidos em proteína;
Fenótipo: características observáveis num indivíduo que podem ser morfológicas ou funcionais
e que resultam da expressão do seu genótipo em interação com o ambiente;
Gene: sequência de nucleotídeos do dna, codificadora de uma informação (proteína ou rna);
Gene dominante: alelo expresso do mesmo modo em cópia única ou em dupla cópia;
Gene recessivo: alelo fenotipicamente expresso apenas no estado homozigoto ou hemizigoto;
Genoma: conjunto de todo o material genético de um organismo;
Genótipo: composição genética específica de um indivíduo em relação a determinada
característica;
Hemizigótico: termo usado para genes ligados ao cromossomo x no homem e em outros seres
vivos que só tenham um cromossomo x;
Heterocromatina: regiões cromossômicas densamente coradas, tidas como geneticamente
inativas em sua maior parte;
Heterozigoto: indivíduo com dois alelos diferentes para uma mesma característica;
Homozigoto: indivíduo com dois alelos iguais para uma determinada característica;
Íntron: segmento de função desconhecida dentro de um gene;
Lócus (plural – loci): posição do gene no cromossomo;
Mutantes: indivíduos cujo patrimônio genético sofreu uma ou mais mutações;
Mutações: alterações bruscas de genes ou de cromossomos que podem provocar uma variação
hereditária ou uma mudança no fenótipo. Podem produzir uma característica favorável num
ambiente e desfavorável noutro;
Polialelismo: existência de mais de dois alelos em dado gene numa população;
rna polimerase: enzima que catalisa a síntese de um filamento de rna por um molde de dna.
TEMA 3 – ETAPAS DA ANÁLISE
Sempre que precisamos obter a informação presente no dna, seja ele proveniente de qualquer
amostra biológica, precisamos cumprir algumas etapas laboratoriais. Vamos estudar agora quais são
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essas etapas e a função de cada uma.
De maneira resumida, temos que um exame de dna começa com a coleta da amostra, etapa
importante e que merece atenção, uma vez que falhas podem comprometer todo o restante do
exame. Após a coleta, será necessário extrair o dna do interior dos núcleos das células e, para isso,
utilizam-se soluções de lise que permitem a quebra das membranas plasmática e nuclear para liberar
o dna. Após a lise, todo o material composto por restos celulares e demais macromoléculas é retirado,
e o dna fica isolado e recuperado.
Com o dna purificado, os fragmentos de interesse em que se encontram os marcadores-alvo são
amplificados pela reação de pcr. Tal reação visa tirar milhares de cópias de um fragmento específico
de dna originalmente presente na amostra.
Amplificado o dna, o perfil genético é obtido com base na genotipagem, que tem sido realizada,
na maioria dos laboratórios, por eletroforese capilar, em que os fragmentos de dna amplificados são
submetidos a uma diferença de potencial elétrico e migram por um fino capilar metálico. Os
fragmentos maiores têm mais dificuldade para percorrer o trajeto e demoram mais que os
fragmentos menores. Com essa diferença de tempo, é possível identificar o tamanho dos fragmentos
amplificados na amostra e, consequentemente, identificar os diferentes alelos presentes numa
população.
3.1 COLETA
Conforme mencionamos, a coleta é uma das etapas mais importantes da análise forense do dna.
Tudo que acontece nessa etapa – ou seja, fora do laboratório – se refletirá na qualidade e na
confiabilidade do exame; em outras palavras, a coleta das amostras é importantíssima para a
qualidade do resultado final.
A coleta da amostra em geral deve atender critérios técnicos com materiais adequados, iniciando
uma longa cadeia de procedimentos muito além de simplesmente coletar uma amostra de sangue ou
swab bucal. Após a coleta propriamente dita, adotamos procedimentos corretos de
acondicionamento, manuseio, transporte, registro e responsabilização da amostra. Essa sequência de
eventos é denominada cadeia de custódia e visa garantir duas características básicas do material:
integridade e rastreabilidade.
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3.2 EXTRAÇÃO
Qualquer análise no dna em nível molecular precisa isolar essas moléculas dos demais
componentes celulares. A extração consiste em expor e purificar o dna no interior das células, e os
protocolos utilizados variam conforme o tipo celular empregado. Variações nos protocolos se devem
à maior ou menor resistência da membrana celular ou da parede celular nas células vegetais, o que
exige substâncias com diferentes graus de atividade lítica.
Outro aspecto importante na escolha do protocolo é a metodologia utilizada na purificação
(retirada de impurezas e restos celulares do dna a ser extraído).
A extração do dna consiste em tratar quimicamente a amostra biológica para romper as
membranas celulares (membrana plasmática e carioteca), purificar o dna presente na amostra com
lavagens para retirar as impurezas e, por fim, isolar o dna purificado. O correto manuseio e a
metodologia aplicada nessa etapa têm influência direta na quantidade e qualidade do dna extraído.
3.3 AMPLIFICAÇÃO
pcr é uma técnica que revolucionou a biologia molecular pela sua capacidade de produzir bilhões
de cópias de uma região específica do dna em poucas horas. Essa viabilidade técnica possibilitou os
exames de genética clínica, de paternidade e de dna forense hoje em prática.
A pcr consiste numa reação enzimática com o propósito de aumentar a concentração de
determinada região de interesse do dna molde – sendo por isso chamada de etapa de amplificação –,
realizando in vitro o que o organismo faz naturalmente, em condições fisiológicas.
A reação em si tem uma série de componentes: alguns prioritários, sem os quais a reação não
seria viável (componentes básicos); e outros cuja presença permite maior eficiência, mesmo diante de
inibidores ou contaminantes.
Os componentes básicos da pcr são: dna molde, Taq dna polimerase, oligonucleotídeos
iniciadores – primers, desoxinucleotídeos trifosfato (dntps), cloreto de magnésio (mgcl2) e solução-
tampão. Trata-se de um sistema interdependente; isto é, todos os componentes básicos têm um nível
de interação com a dna polimerase e são essenciais à sua atividade.
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Atualmente, a pcr é realizada numa máquina conhecida como termociclador, aparelho capaz de
executar automaticamente as variações cíclicas das temperaturas necessárias ao processo. Todos
esses compostos interagem em meio a ciclos térmicos compostos de três etapas: desnaturação,
ligação dos primers às fitas-moldes e extensão.
3.4 DETECÇÃO E ANÁLISE
A amplificação de alvos gênicos por pcr gera inúmeros produtos com tamanhos distintos, isto é,
com um número de nucleotídeos variável. Assim, as técnicas de eletroforese visam, por matrizes
distintas, isolar e identificar tais alvos de forma precisa.
A técnica de eletroforese em capilar será o tema deste capítulo. Contudo, é preciso ter em mente
os fundamentos matemáticos que regem essa técnica e a mobilidade do dna, além das técnicas
desenvolvidas anteriormente, que servirão de alicerce.
Frequentemente, cargas elétricas positivas e negativas se associam a biomoléculas, de modo que,
se colocadas num campo elétrico, as moléculas carregadas migram em direção ao eletrodo de carga
oposta por atração eletrostática.
Conceitualmente, a eletroforese consiste na separação de moléculas carregadas eletricamente
num campo elétrico, de maneira que a mobilidade relativa das moléculas depende de uma série de
fatores, como razão carga/massa, forma molecular e temperatura, viscosidade e porosidade da matriz
pela qual a molécula migra. Assim, misturas complexas e diversos produtos de pcr de tamanhos
diferentes podem se separar com alta resolução.
TEMA 4 – MARCADORES MOLECULARES
4.1 SHORT TANDEM REPEATS (STR)
Genética pode ser definida como o “estudo da hereditariedade”, isto é, como a informação
relativa aos caracteres biológicos se transmite de geração em geração. Além disso, é seu objetivo
estudar como essa informação se mantém no decorrer da vida dos organismos, suas eventuais
variações e a expressão da informação nas características individuais. A palavra genética vem do
grego genetikos (“capaz de procriar”), sendo gene o radical e o cerne de seu significado.
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4.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS APLICADOS À IDENTIFICAÇÃO HUMANA
O genoma dos organismos eucariotos tem diversas sequências de dna repetitivas, presentes em
diversos tamanhos e caracterizadas por uma unidade (motivo) de repetição cujo número é variável. O
tamanho dessas unidades de repetição pode ser de dois a centenas de nucleotídeos. Tais sequências
frequentemente são denominadas dna satélite e podem ser encontradas ao redor da região
centromérica do cromossomo.
A terminologia-satélite refere-se ao fato de que essas repetições tendem a produzir uma
frequência diferente de nucleotídeos a, c, t e g, apresentando uma densidade diferente do dna total.
Assim, em experimentos relacionados à gradiente de densidade, apresentam-se com bandas
secundárias ao redor da banda relacionada ao dna total.
O tamanho das unidades de repetição é variável. Uma classe de sequências repetitivas
denominada minissatélites (ou vntr) tem unidades de 10 a 100 nucleotídeos de extensão. Por
exemplo, o marcador genético d1s80 é um vntr cuja unidade de repetição tem 16 nucleotídeos e
apresenta alelos de 16 a 41 unidades de repetição.
Figura 1 – Representação de vntr
Fonte: Massuda, 2021.
Outro tipo de classe de sequências repetitivas são os microssatélites (ou (strs), cuja abordagem
será o objetivo deste capítulo. Diferem-se dos vntrs em relação ao tamanho das repetições, que
variam de dois a seis nucleotídeos. A diferença no tamanho, juntamente com o advento da técnica de
pcr, tornou esses marcadores amplamente aplicáveis na análise forense.
Milhares de strs polimórficos têm sido caracterizados no dna humano. Em teoria, pode haver
mais de um milhão de loci str presentes no genoma. Independentemente disso, microssatélites
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representam cerca de 3% do genoma humano, e os marcadores strs estão difundidos por todo o
genoma e ocorrem em média a cada mil nucleotídeos.
Pesquisas computacionais recentes têm buscado sequências do tipo em regiões do genoma
humano disponíveis em bancos de dados online.
Figura 2 – Representação de str
Fonte: Massuda, 2021.
TEMA 5 – PCR MULTIPLEX
A reação de pcr convencional permite amplificar apenas uma sequência-alvo por reação.
Contudo, as reações denominadas pcr multiplex permitem amplificar mais de uma região-alvo
simultaneamente. Para uma reação multiplex funcionar adequadamente, é preciso que os
oligonucleotídeos iniciadores sejam compatíveis uns aos outros, isto é, que não formem dímeros de
primers e tenham temperaturas de anelamento similares. Além disso, os iniciadores devem ser
conjugados a fluorocromos – moléculas que emitem fluorescência de determinados comprimentos de
onda. Isso permite diferenciar fragmentos de tamanho similar, conforme a Figura 3.
Figura 3 – Representação da pcr multiplex
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Fonte: Massuda, 2021.
Perceba que três loci são amplificados simultaneamente e analisados por métodos de separação
com base no tamanho do fragmento.
Há alguns anos, ensaios de amplificação de strs comerciais que permitiam a coamplificação de 16
loci simultaneamente faziam parte da rotina dos laboratórios de genética forense. Contudo, o
constante investimento em inovação e superação de desafios operacionais permitiu que os sistemas
atuais fornecessem resultados para mais de 20 loci strs autossômicos e 23-27 loci do cromossomo y.
5.1 ELETROFORESE CAPILAR
Amplificados os loci str, os produtos de pcr conjugados aos fluoróforos são detectados pela
excitação dessas moléculas por um laser durante a corrida eletroforética no capilar.
Diferentemente da eletroforese em gel, a capilar envolve um tubo muito estreito, preenchido
com um polímero (poliacrilamida) para separar os produtos de pcr.
Figura 4 – Eletroforese capilar
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Fonte: Massuda, 2021.
Os produtos de pcr são submetidos a uma determinada voltagem e injetados no capilar
preenchido com um polímero. Os fluoróforos nos produtos de pcr são excitados por laser e emitem
fluorescência, detectada por filtros específicos que convertem o sinal luminoso em picos num
eletroferograma.
NA PRÁTICA
A análise de dna evoluiu e se tornou indispensável no estudo de casos forenses por empregar
técnicas extremamente sensíveis. Com ela, suspeitos podem ser ligados a locais de crime – e um local
de crime ser ligado a outro – ao se estudarem pequenos vestígios biológicos oriundos, por exemplo,
da saliva impregnada em tocos de cigarro, células da pele em volantes ou pelos e cabelos em roupas.
Grandes bancos de dna podem rapidamente indicar a combinação de perfis encontrados no
cenário do crime, ou mesmo pela combinação parcial, ao se aproximar de parentes do perpetrador.
Casos de crimes sexuais considerados insolúveis estão começando a ser resolvidos décadas após sua
investigação pela análise de dna degradado em swabs ou lâminas de microscopia guardadas. Vítimas
de desastre em massa – como acidentes aéreos, atos de terrorismo e catástrofes naturais, em que a
identificação física era impossível – podem hoje ser identificadas em dias, sem qualquer dúvida.
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FINALIZANDO
Na aula de hoje estudamos as bases da identificação humana pelo dna. A busca por marcadores
moleculares é a base do processo, baseando-se na pcr para amplificar alvos específicos conhecidos e
estudados para diferenciar pessoas.
Com esses marcadores, é possível identificar pessoas e estabelecer vínculos genéticos, o que,
para a sociedade atual, tem aplicações tanto na área criminal (perícias) quanto civil (testes de
paternidade).
REFERÊNCIAS
BUTLER, J. M. Forensic dna typing: biology, technology, and genetics ofstr markers. Amsterdam:
Academic Press, 2005.
DIAS FILHO, C. R.; FRANCEZ, P. A. C. Introdução à biologia forense. 2. ed. Campinas: Millennium,
2018. 374 p.
KOCH, A.; ANDRADE, F. M. A. Utilização de técnicas de biologia molecular na genética forense:
uma revisão. RBAC, [S.l.], v. 40, n. 1, p. 17-23, 2008.
RABELLO, E. Curso de criminalística: uma sugestão de programa para as faculdades de Direito.
Porto Alegre: Sagra, 1996.
VELHO, J.; GEISER, G. C.; ESPINDULA, A. Ciências forenses: uma introdução às principais áreas da
criminalística moderna. 3. ed. Campinas: Millennium, 2017.
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