19

Prévia do material em texto

Em 1993, Telenti e colaboradores propuseram um método para identificação molecular rápida de micobactérias com a restrição por endonucleases de uma sequência parcial do gene hsp65, seguida da análise do polimorfismo dos fragmentos resultantes, denominada PRA-hsp65. Considerando conceitos e aspectos técnicos da metodologia citada, assinale a alternativa incorreta.
Alternativas
Dentre as vantagens da técnica PRA-hsp65estão: (i) a rapidez; (ii) a possibilidade de identificação da maioria das espécies de micobactérias incluindo cepas não identificáveis por métodos fenotípicos ou HPLC, com exceção daquelas pertencentes ao complexo M. tuberculosis; e (iii) possibilidade de implantação em laboratórios públicos em território nacional.
A técnica envolve a amplificação parcial de um fragmento de aproximadamente 439pb do gene codificante para a proteína de choque térmico de 65kDa a partir do DNA extraído das cepas isoladas. Para a reação de polimerização em cadeia são usados os iniciadores Tb11 e Tb12. O DNA amplificado é submetido a restrição pelas enzimas BstEII e HaeIII independentemente e eletroforese em gel de agarose em concentração igual ou acima de 3%. A análise do tamanho dos fragmentos está disponível nana página http://app.chuv.ch/prasite/index.html.
O polimorfismo de outros genes conservados, de maneira similar ao gene hsp65, já foi proposto como variações da técnica para a identificação de micobactérias, como os genes rpoB, dnaJe o espaçador 16S-23S rRNA.
A técnica PR -hsp65, apesar de não comercializada, foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) na última década, porém é recomendada validação efetivain-house.
Dentre as desvantagens da metodologia PRA-hsp65 estão: (i) a não inclusão de espécies recentemente descritas no banco de dados on-line; (ii) diferenciação dificultada de fragmentos de restrição com dimensões próximas após a eletroforese; (iii) subjetividade; e (iv) identificação ambígua de espécies que compartilham de fragmentos de restrição com as mesmas dimensões.