Relatorio_Microbiologia_coloracao_Gram

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Relatório Microbiologia coloração Gram
Introdução
Por volta de 1884, o médico bacteriologista e farmacologista dinamarquês, Hans Christian Joachim Gram, descobriu, em suas pesquisas, que as bactérias poderiam ser divididas em dois grandes grupos, partindo da observação da maneira como as bactérias reagiam a agentes descolorantes, no caso, o álcool. Suas conclusões foram baseadas na quantidade de lipídios que diferentes bactérias possuíam em suas membranas, de tal modo que isto influenciaria na coloração final após a utilização do álcool. Trata-se, portanto, de um método para diferenciar as bactérias em GRAM-Positivas e GRAM-Negativas.	
Antes de se descrever os passos para a realização da coloração, é necessário que se entenda de que forma a bactéria em sua ultraestrutura se comporta durante o procedimento. Para isso descreve-se a bactéria como possuidora de diferentes formatações para as estruturas de revestimento externo. No caso das gram positivas, temos que, do mais externo para o mais interno, há um revestimento de proteoglicanos com moléculas de ácido teicoico aderidas, consistindo esta estrutura na parede celular. 
Logo mais profundamente, temos a membrana celular, composta por estruturas proteicas, lipídicas e filamentos de ácido lipoteeicoico. Já com as bactérias gram negativas, temos a presença de uma membrana lipopolissacaridica mais externa com porinas em pontos específicos. Mais profundamente a esta, temos uma camada de peptídeoglicanos, sendo esta fixada a camada mais externa por lipoproteínas. Por fim, mais internamente a esta última, temos a membrana citoplasmática. 
Desse modo temos que a membrana gram positiva possui uma camada muito maior de peptídeoglicanos em relação à membrana de bactérias gram negativas. Esta e outras diferenças podem ser observadas na imagem abaixo. 
Imagem comparativa das membranas
Objetivos
· Compreender os procedimentos realizados na coloração de Gram. 
· Entender o motivo das diferenças de coloração entre bactérias Gram positivas e Gram negativas. 
· Observar e diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas. 
Material
· Água
· Alça Bacteriológica
· Álcool 
· Bico de Bunsen
· Cetona 
· Cristal violeta (violeta Genciana)
· Fucsina
· Lâminas
· Lugol 
· Microscópio
· Óleo de imersão
· Papel absorvente
· Pinça metálica
Método
Em uma lâmina limpa, dentro da zona de segurança do bico de Bulsen, adicionam-se com a alça bacteriológica devidamente aquecida, uma amostra do meio de cultura e espalha-se. Para a fixação da bactéria à lâmina devemos seca-la, de modo a matar as bactérias existentes na lâmina.
Com o esfregaço preparado, adiciona-se cristal violeta, corante principal, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto. Lava-se o esfregaço com água para retirar o excesso de cristal violeta da amostra até que não mais seja observada a coloração roxa na água.
Posteriormente, adiciona-se lugol, que possui a função de mordente, aumentando a afinidade do corante pela célula, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto.
Em seguida, adiciona-se o álcool cetona, com a função de desidratar os carboidratos existentes na parede celular de bactérias gram-positvas e reter o corante primário. Vale lembrar que sua adição deve ser rápida e precisa, durando de 5 a 10 segundos.
Após, lava-se novamente a amostra com água e adiciona-se Fucsina diluída, corante secundário, que irá corar as células anteriormente descoradas com o álcool cetona. Sua ação deve ser de 30 segundos.
Por fim, lava-se com água novamente e seca-se delicadamente a amostra de modo a retirar qualquer excesso de água. Coloca-se algumas gotas de óleo de imersão e observa-se a diferenciação das bactérias Gram-positivas das Gram-negativas ao microscópio óptico, utilizando a lente objetiva de imersão.
Resultados e discussão
	O mecanismo de coloração de Gram é baseado nas diferenças na estrutura das paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas e como cada uma dessas estruturas reage ao vários compostos. 
	A utilização do corante primário (cristal violeta) resultou em coloração púrpura tanto na bactéria gram-positiva, quanto na bactéria gram-negativa pois o corante é capaz de penetrar no citoplasma de ambos os tipos, ficando retido na camada de peptideoglicano, que é espessa no caso das gram-positivas e fina no caso das gram-negativas. 
	Posteriormente, utilizamos iodo de Gram, também conhecido como lugol, que, ao ser aplicado na lâmina, resultou na formação de cristais com o cristal violeta que são muito grandes para atravessar a parede celular, ou seja, ocorreu a fixação do complexo da violeta com o peptideoglicano. 
	Em seguida, utilizamos um solvente orgânico com função de agente descorante, no caso, a acetona. Nas células gram-positivas, tivemos a permanência do corante cristal de violeta no interior da célula pois a acetona tornou a membrana impermeável ao cristal, fazendo com que ele fique retido dentro da célula. Já nas células gram-negativas, a acetona dissolveu a membrana externa e o cristal violeta-iodo se difunde para o meio externo, tornando-as incolores. 
	Por fim, utilizamos o corante fucsina, o que resultou em entrada deste nas células gram-negativas. Isso foi possível pois a membrana externa se dissolveu na etapa anterior, graças a utilização do solvente orgânico, resultando na difusão do cristal violeta-iodo para o meio externo e permitindo, dessa forma, a impregnação do novo corante, ao contrário do que acontece nas células gram-positivas, que por terem tido suas membranas impermeabilizadas pela acetona, não perdem o cristal violeta-iodo. Assim, as gram-negativas, através da dissolução dos lipídios, tem a porosidade ou permeabilidade da parede celular aumentada, evitando que o complexo corante seja retido. Tanto a presença do cristal violeta-iodo, quanto a integridade da parede celular das células gram-positivas impediram que a fucsina adentrasse essas células. 
	Como resultado, observa-se no microscópio óptico que as bactérias gram-positivas ficam coradas de roxo – devido a presença do cristal violeta-iodo – enquanto as bactérias gram-negativas adquirirem a coloração da fucsina (rosa). 
	
Conclusão 
	A coloração de Gram demonstrou ser um importante método para distinção dos dois grandes grupos de bactérias, as bácterias Gram positivas e Gram negativas. Tal distinção é possível através da observação da cor obtida ao final da técnica de coloração de Gram, sendo que as bactérias Gram positivas adquirem coloração violeta, enquanto que as bactérias Gram negativas, coloração rosa. As colorações obtidas são explicadas pelas diferenças na composição das paredes celulares bacterianas. Vale ressaltar que o formato das bactérias, bem como sua coloração, são determinantes para identificação clínica da bactéria analisada, facilitando o diagnóstico.