Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
ARQUIVO TRADUZIDO PADRÕES DISTINTOS DE CONTROLO DE ÁGUA E OSMÓLITO ENTRE MARÉS (Bunodosoma caissarum) E SUBTIDAIS (Anemonia sargassensis) EM ANÉMONAS-DO-MAR Enelise M. Amado b, Denilton Vidolin b, Carolina A. Freire b, Marta M. Souza a, a Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil b Departamento de Fisiologia, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná, Brazil RESUMO As anêmonas são freqüentemente encontradas em costas intertidais rochosas. Como eles têm superfícies de corpo altamente permeáveis, A exposição ao ar ou a variações de salinidade dentro das piscinas de maré pode representar osmótica e iónica intensa Desafios. O Bunodosoma caissarum intertidal tem sido comparado com o Anemonia sargassensis subtidal sobre a sua resposta à exposição ao ar ou mudanças de salinidade. B. caissarum mantém hidratação dos tecidos através Produção de muco e formação de forma de cúpula quando desafiada com exposição ao ar ou salinidades extremas (fresco Água ou água de mar hipersalina, 45 psu) durante 1-2 h. Após exposição a choques osmóticos leves durante 6 h (hipossômico: 25 psu, ou hiperosmótico: 37 psu), B. caissarum foi capaz de manter a sua fluido coelenteron (CF) a osmolalidade estável, mas apenas em 25 psu. A. sargassensis CF osmolalidade seguido o meio externo em ambas as salinidades. As culas isoladas do disco do pedal de B. caissarum mostrou capacidade total para o volume de regulação dependente de cálcio diminuir (RVD) sobre 20% de choque hiposmótica, envolvendo pelo menos parcialmente a libertação de KCI através de K + -Cl - Cotransport, e também de osmolytes orgânicos. Aquaporinas (HgCl2 -inhibited) provável participam neste processo. Células de A. sargassensis mostrou RVD parcial, após 20 min. As células de ambas as espécies não eram capazes de Aumento do volume regulatório após o choque hiperosmótico (20%). O organismo inteiro e os mecanismos celulares permitem B. caissarum a viver no habitat intertidal desafiador, muitas vezes enfrentando exposição ao ar e diluição de água do mar. 1. Introdução A ocupação de habitats intermareais ou subtidais rochosos significa Exposição a vários estressores ambientais, ditados pela amplitude corrente da área (Richardson et ai, 1997;.. Cha et al, 2004). Os organismos que habitam a zona do litoral superior podem ser expostos ao Ar e até mesmo organismos que permanecem submersos em piscinas de maré durante Maré baixa pode ser exposta a fortes flutuações na salinidade da água, Temperatura, oxigênio dissolvido e pH (Connell, 1972; Nybakken, 1988). As anêmonas são habitantes freqüentes das zonas intermareais. Por tal Animais, com superfícies corporais altamente permeáveis, exposição ao ar ou a Variações de salinidade podem representar um desafio severo. Algumas anêmonas Verrugas adesivas presentes na coluna que causam retenção de detritos, criando um "casaco protetor úmido", reduzindo assim a taxa de perda de água (Hart e Crowe, 1977). Anêmonas que vivem na zona intermareal tais como Phymactis Clematis e anthothoe chilensis também têm sido mostrou reter a água em suas cavidades gastrovasculares durante o ar exposição, uma resposta não observada em achates Antholoba, um submaré Espécies (Stotz, 1979). Quando expostos à variação da salinidade, o fluido de coelenteron rapidamente (Dentro de 6 h) se equilibra com o novo meio, como observado com Bunodosoma cavernata e Condylactis gigantea (Pierce e Minasian, 1974; Bursey e Harmer, 1979; Benson-Rodenbough e Ellington, 1982). Por sua vez, a diluição ou a concentração do fluido de coelenteron Representa um desafio de regulação do volume celular para células e tecidos (Kirschner, 1991;. Scemes et al, 1991; Ruiz e Souza, 2008). Um pode Espera que as espécies de osmoconformadores que sofram vida em habitats Caracterizado por mudanças rápidas de salinidade, como o habitat intermareal, Deve poder depender de mecanismos eficientes de volume celular Regulamento (Kirschner, 1991; Foster et al., 2010). Se uma célula, após inchaço (choque hiposmótico), ativa mecanismos para reduzir seu volume, esse processo é denominado volume regulatório Diminuição (RVD). Por outro lado, os mecanismos utilizados para restaurar o volume perdido Devido a um choque hiperosmótico são chamados de aumento do volume regulatório (RVI) (Chamberlin e Strange, 1989; Hoffmann e Dunham, 1995; Lang e Waldegger, 1997; Wehner et al., 2003; Choe and Strange, 2008; Hoffmann et al., 2009). Tanto RVD como RVI são o resultado do Participação de caminhos de transporte orgânicos e / ou inorgânicos. Solutos. Durante RVD, as células reduzem o edema através do efluxo de solutos Seguido de água. No RVI, o volume perdido é recuperado através do influxo de solutos, que também é seguida de água (Hallows e Knauf, 1994; Wehner et al., 2003; Estranho, 2004). Mudanças na taxa de produção Ou a oxidação de aminoácidos livres intracelulares também são muito relevantes, e têm sido relatados para as anémonas Metridium senil, Diadumene leucolena e B. cavernata (Pierce e Minasian, 1974; Benson-Rodenbough e Ellington, 1982; Kasschau et al., 1984; Howard et al., 1987; Deaton e Hoffmann, 1988). Mecanismos de regulação do volume nos coelentados até agora foi amplamente inexplorado. La Spada et al. (1999), ao estudar nematocysts isolados de Aiptasias diaphana, foram o primeiro grupo de Relatar a dependência da regulação do volume de células do coelentado em osmolitos inorgânicos: K + e Cl - durante RVD, e a mobilização de Na +, K + e Cl - durante RVI. Ainda assim, não há literatura sobre o volume celular Regulação em tecidos externos, como o disco de pedal de anêmonas. As anêmonas Bunodosoma caissarum e Anemonia sargassensis São amplamente distribuídos ao longo da costa brasileira. As duas espécies ocupam costas rochosas, mas em padrões de distribuição distintos: B. caissarum é intermareal e pode ser encontrado exposto ao ar durante a maré baixa, ou Preso dentro das margens do litoral superior. Por outro lado, A. sargassensis é subtidal e sempre submersa, quando em Grandes piscinas de maré. A única avaliação fisiológica encontrada no A literatura para estas espécies era uma descrição da transmissão química. Sion (Mendes, 1976) ou de mecanismos de toxicidade (Malpezzi et al., 1993; Alés et al., 2000; Oliveira et al., 2004), Para B. caissarum. Assim, este estudo teve como objetivo descrever respostas fisiológicas de essas duas anêmonas para exposição ao ar e desafios de salinidade. A hipótese testada foi que a B. caissarum intertidal seria mais tolerante aos desafios de salinidade e exposição ao ar, sendo mais capaz de mantendo a hidratação do tecido, quando comparado com a sub-média A. sargassensis. Células de B. caissarum também seria esperado para ser mais eficiente em RVD / RVI do que as células de A. sargassensis. Caminhos Envolvidos no transporte de iões durante a regulação do volume celular também foram investigados, para ambas as espécies. 2. Materiais e métodos 2.1. Animais Espécimes de B. caissarum e A. sargassensis foram suavemente removidas à mão do seu substrato rochoso durante a maré baixa, em Itapema do Praia Norte, localizada em Itapoá, Estado de Santa Catarina, sul do Brasil (26 ° 04'S; 48 ° 36'W). Anêmonas foram trazidas para o laboratório em Caixas de isopor contendo água do mar local. Eles foram aclimatados Condições de laboratório em um aquário estoque (salinidade 30-32 psu, pH 7,4) em ~ 20 ° C, sob fotoperíodo natural e aeração constante. Animais foram alimentados aproximadamente uma vez por semana com pequenos pedaços de peixe ou Camarão, oferecido diretamente na boca, usando uma pinça. Um total de 60 foram usadas anémonas de cada espécie, medindo ~ 6 cm (B. caissarum) e ~ 3 centímetros (A. sargassensis) de diâmetro disco do pedal. 2.2. Dados de salinidade do campo O ambiente intertidal habitada pelas anêmonas B. caissarum e A. sargassensis foi caracterizadoatravés de medições salinidade. As medições foram realizadas durante as marés baixas em janeiro 2004, tomando amostras de água por hora, a partir de 06:00 à meia-noite (Fig. 1). 1 A maré baixa foi examinada, sob a luz do sol, e outra debaixo da chuva Precipitação, durante o dia. A salinidade foi medida em: água do mar, Piscinas de marés e fendas de rocha. No caso de piscinas de maré, amostras de água de três camadas diferentes foram coletadas: 1) da superfície Água, 2) meio da água em aproximadamente metade da coluna de água e 3) perto da parte inferior. FIG. 1. A salinidade da água (psu) de água do mar e rocha fendas (A, sob a luz do sol; C, sob precipitação de chuva) e de água do mar e três camadas de uma associação maré representativo (B, sob brilho do sol; D, sob precipitação de chuva) da Praia de Itapema do Norte, com medidas horárias, das 7:00 às 22:00 h. As marés baixas foram observadas aproximadamente entre 8 e 13:00 h. * = significativamente diferente da salinidade da água do mar naquele momento. 2.3. Experimentos in vivo 2.3.1. Experimentos de exposição ao ar O teor de água no tecido das anêmonas foi determinado in situ, no Campo, durante uma maré baixa em um dia ensolarado de verão (em janeiro de 2006), sob uma temperatura do ar de 28 ° C. Os fragmentos de tecido foram removidos do Disco de pedal de 12 espécimes de cada espécie. De cada espécie, 6 dos As anêmonas escolhidas foram encontradas submersas (e não expostas ao ar). Durante a maré baixa), sendo então considerado como o grupo controle, e 6 As anêmonas foram expostas ao ar / sol por um período de ~ 1 h durante a baixa maré. B. caissarum ocorrem naturalmente descoberto por água durante a maré baixa. No entanto, A. sargassensis tinha que ser removido manualmente da sua Substrato subtidal e colocado em uma bandeja de plástico por aproximadamente 1 h para as amostras de tecido são removidas. Fragmentos de tecido obtidos (~ 0,05 g) foram transferidos para tubos que foram selados, colocados em gelo e trouxe para o laboratório. Cada fragmento foi pesado (peso úmido) usando um Balanço analítico (precisão 0,1 mg, Celtac, FA2104N, Brasil) e foi depois desidratou-se durante 36 h a 60 ° C. Após a desidratação, o fragmento foi pesou novamente (peso seco) e calculou-se a água dos tecidos: peso Perda como porcentagem do peso inicial úmido. A exposição ao ar debaixo do sol no laboratório foi realizada em Para fotografar a parede exterior do corpo das anêmonas. Eles eram colocados em bandejas de plástico (n = 6, todos os animais ao mesmo tempo), por um período de 1:30 h. Após o período de exposição ao sol / ar, os animais foram foto- Grapei usando um microscópio estéreo, e foram retornados ao full- Água de mar de força para recuperação. 2.3.2. Experimentos de desafio de salinidade 2.3.2.1. Exposição a extremos de salinidade: tolerância à exposição a água doce, Diluição da água do mar ou concentração de água do mar. No laboratório, depois de Pelo menos 4 dias de aclimatação no aquário estoque, anêmonas de as duas espécies (n = 6 para cada espécie) foram submetidas a Água (salinidade b0,5 psu), água do mar diluída (5 psu) ou concentrada Água do mar (45 psu), por um período de 2 h. Este tempo de exposição aproxi- Uma situação possivelmente enfrentada por esses animais em suas características naturais Ambiente, durante a maré baixa. Anêmonas foram observadas durante a Exposição às diferentes salinidades (em aquários de 2 L, individualmente) e após as 2h foram autorizados a recuperar em água do mar de força total (32psu) stock aquário. Foram observados indivíduos testados por um Período de 3 dias após o experimento. 2.3.2.2. A exposição a choque osmótico suave: Coelenteron fl uid osmo-iónico Concentrações, íons de tecido e substâncias positivas para ninhidrina. Ambos as espécies foram submetidas a hipo- (25 psu) e hiperosmóticas (37 psu) de água salgada (750 e 1130 mOsm kg H2O - 1, respectivamente) para 6h (2 anêmonas em cada aquário de 1 litro). Depois destas 6h de Exposição, o fluido de coelenteron (CF) foi facilmente amostrado (~ 300-500 μl) usando uma seringa e uma agulha, e perfurando o disco oral a uma profundidade de alguns milímetros dentro da cavidade do fluido do coelenteron. Uma fatia de pedal Disco (~ 0,05 g) também foi removido. A osmolalidade foi medida no CF, usando amostras não diluídas (osmômetro crioscópico Gonotec Osmomat 30, Alemanha). Os íons foram medidos no disco de fluido e pedal Homogeneiza. As substâncias positivas de Ninhidrina (NPS) foram ensaiadas tanto no CF quanto nas amostras de tecido do disco do pedal. Na + e K + centração as quantias foram quantificadas através de fotometria de chama (Analiser 900, Brasil), e Cl - concentração foi determinada utilizando um colorimétrico Método (kits de laboratório comercial, Brasil). CF foi apropriadamente diluído em água desionizada para determinação iônica. Tecido iónico os conteúdos foram ensaiados depois de pesar as fatias, secando-as Microtubos por 36 h a 60 ° C, e depois extraindo íons inorgânicos usando 0,5 ml de HNO3 0,75N por 24h. Após centrifugação das amostras (5000 x g), o sobrenadante foi reservado e o sedimento foi exposto a 0,5 ml de NaOH 1,0 N para solubilização de proteínas. Teor de íons de tecido (Nmol) foi então expresso por mg de proteína total do tecido. O teor de proteína foi medido colorimetricamente de acordo com Lowry et Al. (1951). As substâncias positivas de Ninhidrina (NPS) foram ensaiadas empregando um método originalmente descrito por Clark (1968), e adaptado para pequenas amostras de tecido e fluido (Amado et al., 2006). O método quantifica o nitrogênio total ninhidrina positivo, em citrato Tampão, e é expresso como μg NPS / ml (fluido de coelenteron) ou μg / mg de Peso molhado da fatia do pedal. 2.4. Experimentos in vitro 2.4.1. Preparação de células para análise de volume celular Capacidade de regulação do volume celular após choque osmótico (com ou sem cálcio) foi testada, em células isoladas do pedal da anêmona disco. Pequenos fragmentos (~ 5 mg) de tecido do disco do pedal foram colocados num tubo de plástico contendo 5 ml de solução salina isosmótica Ca2 + -livre. o A solução salina isosmotica foi isosmótica para o fluido coelenteron de anêmonas aclimatados à água do mar (900 mOsm kg H2O - 1). Composição (mM): NaCl 500; KCl 10; MgSO4 50; De NaHCO 3 3; CaCl 2 10; HEPES ácido 2,5 e HEPES sal de na + 2,5. A osmolalidade medida da solução salina isosmotica foi de 980 ± 8 mOsm kg H2O - 1. Após 1 h, a dissociação foi realizada me- Chanicamente por sucção suave / expulsão usando uma pipeta Pasteur, vários Vezes. A suspensão foi então transferida para um novo tubo, e centrifugadas (290 x g). O sobrenadante foi descartado e girou as células baixas foram ressuspensas em solução salina isosmótica. As células foram transferidas para uma lamínula (22 mm de diâmetro) adaptada a uma câmara acrílica. Eles foram autorizados a descansar (pelo menos 2 h) para aderir à lamínula. Para cada Condição experimental, pelo menos 3 dissociações foram preparadas, cada uma De um animal independente. Para garantir a integridade celular, desde o passo de dissociação até os Uso em ensaios de volume celular, alíquotas da suspensão foram submetidas para um teste de viabilidade celular, usando azul de tripano. O teste foi realizado em Células recentemente dissociadas, em células que descansaram durante ~ 2 h em isosmotic salina. Uma alíquota foi submetida durante 20 minutos a hipo e hiper- Choques osmóticos, e também teve sua viabilidade testada no final do experimentar. Em todas as condições, a viabilidade celular variou entre 91,2 ± 3,6% e 92,7 ± 1,1%, tornando os nossos resultados confiáveis. 2.4.2. Medições do volume celular em estresse e dependência osmótica em Ca 2+ A análise do volume celular foi realizada em um inverso microscópio (Motic AE31) submeter as células a cada controlo ou de teste Solução: 1) controle isosmotico, 2) hipossmótico, 3) hiperosmótico,4) hiposmótica sem Ca 2+, e 5) hiperosmótico sem Ca 2+. o As soluções de hiperosmótica experimental e hipossmota foram respectivamente 125% e 80% dos níveis de controle de todos os sais presentes no Solução salina isosmotica. Osmolalidades medidas foram de 1229 ± 2 e 775 ± 15 mOsm kg H2O - 1, respectivamente (n = 4 soluções). Para testar O efeito da remoção, controle, hiperosmotismo e hiposmotismo de cálcio salinas foram preparadas sem a adição de CaCl2, e comple- Misturado com EDTA (5 mM). Cada experiência de volume de células durou um total de 20 min. O acrílico A câmara contendo as células na solução salina isosmótica foi fotografada (Tempo 0), a solução salina isosmótica foi substituída pelo método experimental Solução salina e, em seguida, as mesmas células foram fotografadas novamente 2, 5, 10, 15 e 20min após exposição a condições experimentais. o imagens foram capturadas por uma câmera digital (Moticam 480) e foi submetido a análise de imagem (Imagens Motic 2000-1.3). Diâmetro celular foi medido, e as células foram consideradas como esferas, a fim de Calcular o volume de células tridimensional a partir de células bidimensionais diâmetro: V = 4 / 3πr 3. 2.4.3. Análise de caminhos de soluto empregados para regulação do volume celular O volume celular também foi examinado na presença de alguns bloqueadores de as principais vias de transporte de íons conhecidas por estar envolvidas em células Regulação do volume sob choque anisosmotico. As células foram fotografadas em solução salina isosmótica (tempo 0), e a solução salina isosmótica foi Substituído pela solução salina experimental (hiposmotica ou Hiperosmótica) mais o bloqueador iónico específico do transportador. A fim de bloquear a Na + / K + -ATPase, 100 uM de ouabaína foi usado, tanto em hipo E hiper-experimentos. Furosemida 3 mM foi utilizado para bloquear K + - Cl - co-transporte (hipo), enquanto que a 100 uM para bloquear na + -K + -2Cl - Cotransporte (hiper). DIDS (4,4-diisotiocianatostilbeno 2,2-dissulfónico ácido) 200? M foi utilizado para bloquear o permutador de aniões Cl - / HCO 3 - (Hipo e hiper-). Sob choque hiposmótico, o permutador de aniões é uma via prevista de efluxo osmólito orgânico durante RVD (Kirk et al., 1992; Pasantes-Morales et al., 1999). Utilizou-se amilorida (100 μM) para bloquear o permutador de catiões de na + / H +. Além dos bloqueadores de transporte de íons, HgCl2 foi empregado, como bloqueadores do canal de água. Aquaporins AQP1, AQP2, AQP3 e AQP5 são inibidos por inorgânicos Mercúrio, a concentrações de ≥ 300 μM (Marinelli et al., 1997; Meinild et Al., 1998; Belyantseva et al., 2000; Watanabe et al., 2005). Assim, a água O fluxo através das aquaporinas foi avaliado pela adição de 300 μM HgCl2 durante choque hiposmótica. 2.5. Análise estatística Os dados são apresentados como média ± SEM. As salinidades de Microhabitat foram em comparação com a salinidade do mar usando intervalos de confiança (95%). 1- Análise de variância de maneira (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (SNK) teste post-hoc para localizar as diferenças foram usadas para in vivo Coelenteron fluido e pedal disco concentrações, e in vitro Experimentos em inibidores de via. Medições repetidas de dois Foram empregues maneira ANOVA seguido por teste post-hoc de Holm-Sidak Com as experiências de volume de células in vitro, testar o efeito de Remoção de cálcio e tempo de exposição a meios anisostáticos. o O nível de significância adotado foi de 95% (Pb0,05) em todos os casos. 3. Resultados 3.1. Dados de salinidade da água Durante marés baixas sob a luz do sol, água retida em fendas de rocha ou a exposição das marés piscinas aumentou salinidades, atingindo 34-36 psu (Fig. 1 UMA, B). Por outro lado, como esperado, quando chove durante a maré baixa, a salinidade cai para 12-15 psu tanto em fendas de rocha quanto em piscinas de maré, especialmente em suas camadas superficiais (Fig. 1 C, D). A estratificação da salinidade foi observada em piscinas de maré sob chuva, com valores de salinidade decrescentes, de baixo para cima dentro da piscina (FIG. 1 D). 3.2. Experimentos in vivo 3.2.1. Exposição ao ar B. caissarum, o que normalmente ocorre durante a maré baixa exposto, fez não perca água após ~ 1 h exposto ao ar sob o sol (no Campo): níveis de controle de hidratação do tecido foram de 75,9 ± 1,1%, e foram não diferentes após a exposição ao ar: 77,2 ± 0,5%. No entanto, o subtidal A. sargassensis tinha 73,1 ± 1,2% de hidratação dos tecidos quando submerso, mas perdeu água quando forçado o ar exposto no campo: 69,2 ± 0,9% (P<0,05). Quando as anêmonas foram expostas ao ar sob o sol no laboratório, para 01:30 h, B. caissarum produzido muco, claramente visto que cobre as verrugas E bolhas da parede do corpo da coluna (FIG. 2 A, B). Todos os indivíduos Recuperado em água de 32 psu após o experimento. Quarenta e oito horas após o experimento, as anêmonas permaneceram presas às paredes de os aquários e acenou seus tentáculos normalmente. Por outro lado, A. sargassensis secas inteiramente após a experiência, nenhuma das opções Espécimes recuperados, e todos morreram, como visto na aparência encolhida de anêmona inteira (FIG. 2 C, D). 3.2.2. Exposição a extremos de salinidade Todos os indivíduos de B. caissarum exibida forma “cúpula”, recuperando São tentáculos para o interior de sua cavidade gastrovascular em todas as salinidades (b0.5, 5, e 45 psu), imediatamente após a exposição, enquanto A. sargas- sensis nunca fez isso. B. caissarum apresentada a produção de muco intenso (Todos os indivíduos) e libertação quando expostos às baixas salinidades, mas não a água salgada concentrada, enquanto A. sargassensis nunca produziu muco. Os três mais jovens / menores indivíduos de ambos B. caissarum e A. sargassensis destacada do substrato quando colocado em fresco agua; este comportamento não foi observado com os animais maiores ou em As outras salinidades. Com a exceção de A. sargassensis na Situações de salinidade reduzida (b0.5 e 5 psu), todos os animais recuperados Depois de ser colocado em água de 32 psu. Após a exposição à água doce, B. espécimes caissarum foram muito mórbidas, e exibida deterioração de tecido de parede corporal. Depois de ser transferido para uma água do mar de força total Aquário para recuperação (32 psu), levaram cerca de 2 h para começar a se mover os tentáculos, mas todos os indivíduos recuperaram após 6 h. Todos os indivíduos de A. sargassensis morreram após a exposição de água doce. FIG. 2. Parede exterior do corpo da coluna de B. caissarum (A) e A. sargassensis (C), em condições de controlo, coberta pela água do mar. Parede do corpo de ambas as espécies, após 1:30 h de exposição ao ar sob luz do sol: verrugas abundantes e bolhas e a produção de muco por B. caissarum (B), e secou-se, encolheu aparência de A. sargassensis (D). (Visão do estereomicroscópio, barras de escala: 0,5 cm). 3.2.3. Exposição ao choque osmótico leve 3.2.3.1. Coelenteron fl uid - osmolalidade, iões e concentrações NPS. A osmolalidade do fluido de coelenteron (CF) manteve-se estável em Choque hiposmótico, mas aumentado após o choque hiperosmotico em B. caissarum (Fig. 3 UMA). De forma diferente, em A. sargassensis (Fig. 3 D), A osmolalidade de FC seguiu a osmolaridade média em 25 e em 37 psu. Em B. caissarum, sódio, cloreto, potássio e exibida significativa diminui em 25 psu: Na + em 28%, Cl - 21%, e K + de 25% (Fig. 3 UMA). Quando em 37 psu, K + aumentou 24% em relação ao valor de controlo. Dentro A. sargassensis, de forma semelhante, Na + e Cl - também diminuiu em 25 psu: Na + até 22%, e Cl - 17%. Em 37psu, Cl - aumento de 43%, e K + aumentou 20% em A. sargassensis (Fig. 3 D). Em B. caissarum, os níveis de NPS Aumentou em 25 (49%) e em 37 psu (39%), quando comparado a controlos em 30 psu (Figura 3. UMA); em A. sargassensis, exposição a 25 psu resultou em um aumento de 177% no CF NPS, e nenhuma alteração em 37psu (Fig. 3 D). 3.2.3.2. Pediros íons do disco e as concentrações de NPS. Os níveis de cloreto mudaram de acordo com a salinidade em B. caissarum tecido: 25 em psu houve um aumento de 51% Redução, e em 37 psu com aumento de 49%. O sódio não mudou em 25, mas aumentou 81% em 37 psu (FIG. 3 B). Em ambos os iões A. sargassensis diminuiu em tecido quando submetida a 25 psu: Cl - até 31%, e de Na + pela 54%. Em 37 psu, A. sargassensis tecido tinha redução de 30% em Cl -. Tecido K + não alterou em ambas as espécies e ambos os tratamentos de salinidade (FIG. 3 E). NPS no tecido de B. caissarum diminuiu em ambos os choques osmóticos: 13% de redução em 25psu e 22% diminuem em 37psu (FIG. 3 C). Dentro A. sargassensis NPS diminuída (44%) apenas em 25 psu (FIG. 3 F). FIG. 3. As concentrações de fluido e disco do pedal Coelenteron em B. caissarum (símbolos a negro) e A. sargassensis (símbolos brancos), após a exposição ao hipo leve (25 psu) e hiper-osmótico (37 psu) choques; Controle a salinidade: 30 psu. Osmolalidade (OSM, mOsm kg H2O -1 - ● -) e as concentrações dos iões (mM) Na + (- ▼ -), Cl - (- ■ -), K + (- ♦ -), e ninhydrin- positivo substâncias (NPS, ug / ml - ▲ -) do fluido coelenteron de B. caissarum (A) e A. sargassensis (D). Concentrações do disco de pedal de íons (μmol / mg de proteína) e NPS (μg / mg de peso húmido tecido) em B. caissarum (B, C) e A. sargassensis (E, F). Os dados são mostrados como média ± SEM n = 3-7. Dentro de cada espécie e cada análise, o asterisco indica diferença do controle Valor (30 psu). 3.3. Experimentos in vitro 3.2.3.1. Coelenteron fl uid - osmolalidade, iões e concentrações NPS. A osmolalidade do fluido de coelenteron (CF) manteve-se estável em Choque hiposmótico, mas aumentado após o choque hiperosmotico em B. caissarum (Fig. 3 UMA). De forma diferente, em A. sargassensis (Fig. 3 D), A osmolalidade de FC seguiu a osmolaridade média em 25 e em 37 psu. Em B. caissarum, sódio, cloreto, potássio e exibida significativa diminui em 25 psu: Na + em 28%, Cl - 21%, e K + de 25% (Fig. 3 UMA). Quando em 37 psu, K + aumentou 24% em relação ao valor de controlo. Dentro A. sargassensis, de forma semelhante, Na + e Cl - também diminuiu em 25 psu: Na + até 22%, e Cl - 17%. Em 37psu, Cl - aumento de 43%, e K + aumentou 20% em A. sargassensis (Fig. 3 D). Em B. caissarum, os níveis de NPS Aumentou em 25 (49%) e em 37 psu (39%), quando comparado a controlos em 30 psu (Figura 3. UMA); em A. sargassensis, exposição a 25 psu resultou em um aumento de 177% no CF NPS, e nenhuma alteração em 37psu (Fig. 3 D). 3.2.3.2. Pedir os íons do disco e as concentrações de NPS. Os níveis de cloreto mudaram de acordo com a salinidade em B. caissarum tecido: 25 em psu houve um aumento de 51% Redução, e em 37 psu com aumento de 49%. O sódio não mudou em 25, mas aumentou 81% em 37 psu (FIG. 3 B). Em ambos os iões A. sargassensis diminuiu em tecido quando submetida a 25 psu: Cl - até 31%, e de Na + pela 54%. Em 37 psu, A. sargassensis tecido tinha redução de 30% em Cl -. Tecido K + não alterou em ambas as espécies e ambos os tratamentos de salinidade (FIG. 3 E). NPS no tecido de B. caissarum diminuiu em ambos os choques osmóticos: 13% de redução em 25psu e 22% diminuem em 37psu (FIG. 3 C). Dentro A. sargassensis NPS diminuída (44%) apenas em 25 psu (FIG. 3 F). 3.3. Experimentos in vitro 3.3.1. Análise de volume celular Células disco do pedal caissarum B. mostraram regulação do volume celular completo após 20% de choque hiposmótico, mantendo o seu volume inalterado Durante todo o experimento. Distintamente, A. sargassensis as células mostraram inchaço de 49,2 ± 8,6% nos primeiros dois minutos de Choque hiposmotico, seguido de um ajuste parcial do volume em Os minutos seguintes. Apesar deste ajuste parcial, no final de O experimento (20 min), essas células ainda mostraram um inchaço de 24,5 ± 5,8%. As células de ambas as espécies se comportaram de forma semelhante ao hiperossômico choque: células caissarum B. diminuiu em 18,3 ± 4,5%, e os de A. sargassensis de 22,8 ± 2,9%, após 20 min (FIG. 4). 3.3.2. Ca 2+ -dependence da regulação do volume celular O único efeito da remoção de cálcio na regulação do volume celular foi observado para as células B. caissarum, quando eles foram expostos à Choque hiposmótico. Na presença de cálcio, eles mostram completo regulação do volume, enquanto que na ausência de Ca2 + eles exibiram um Inchaço de 47,8 ± 11% nos primeiros 2 minutos de exposição, atingindo 62,5 ± 13,7% após 20 min (FIG. 4 A). Ca 2+ remoção não afetou a a resposta das células de B. caissarum ao choque hiperosmótico, ou que de A. sargassensis células a ambos os desafios (FIG. 4 B, C, D). FIG. 4. Curso de tempo de variação no volume da célula (como% do volume inicial) ao longo de 20 min de exposição a uma hipoglicemia (A, B. caissarum; C, A. sargassensis) ou hiper-osmótico (C, B. caissarum; D, A. sargassensis) salinas, na presença (- ● -) ou na ausência (- ○ -) de cálcio. Osmótico Desafios: redução de 20% (hipoglicemia) ou aumento (hiper). Dados das células 7bnb16, Dissociação de 3 indivíduos de cada espécie, * = significativamente diferente do valor na presença de cálcio, mesmo tempo experimental. Nas linhas de controle, na presença de cálcio, os valores de volume para todos os pontos de tempo eram diferentes dos respectivos iniciais valores, para todas as linhas, excepto para a experiência de hiposmótica caissarum B. (A), nos quais Nenhuma alteração no volume foi detectada. 3.3.3. Caminhos de solução empregue para regulação do volume celular Células B. caissarum foram afectadas pela adição de ouabaína, Furosemida e DIDS; ou seja, eles incharam mais do que na ausência dos bloqueadores (Fig. 5 UMA). Todas as células expostas à solução salina hiposmótica em a presença de HgCl2 lisadas dentro do primeiro 2 min de exposição. Na presença de inibidores, as células de A. sargassensis inchou à mesma Grau como quando exposto ao choque hiposmotico em sua ausência (FIG. 5 C). Os inibidores testados não alteraram o grau de encolhimento medido em células de B. caissarum e A. sargassensis submetidos a choque hiperosmótico, excepto para furosemida e células de A. sargassensis (FIG. 5 B, D): as células encolhido menos na presença do inibidor. FIG. 5. Variação máxima de volume da célula após exposição a uma hipoglicemia (A: B. caissarum, C: A. sargassensis) ou hiper-osmótico (B: B. caissarum:, D A. sargassensis salinas, na ausência)(hipoglicemia, hiper) ou na presença de alguns bloqueadores dos transportadores de membrana. Bloqueadores testados com choque hiposmótica: ouabaína (100 uM), furosemida (3 mM), DIDS (200 uM), e HgCl 2 (300? M). Bloqueadores testados com choque hiperosmótico: ouabaína (100 uM), amilorida (100), furosemida (100 uM), e DIDS (200 m). Dados de 7bnb15 células, a partir de 3 dissociações indivíduos de cada espécie. * = significativamente diferente do valor na ausência do bloqueador, para o mesmo tempo de exposição. 4. Discussão 4.1. Adaptações de B. caissarum para suportar o áspero habitat intermareal O habitat intertidal rochosa de B. caissarum foi mostrado aqui para exibir mudanças significativas na salinidade da água da piscina de maré, durante Marés baixas sob a luz do sol ou sob chuva. Além disso, séssível intertemal animais tais como B. caissarum pode muito bem ser exposta ao ar durante Marés baixas. Em contraste, A. sargassensis é limitado a áreas subtidais, nunca mais exposto ao ar. Quando presentes em piscinas de maré, A. sargassensis sempre ocupa os estratos inferiores (inferiores) das piscinas maiores. Além disso, espécimes de A. sargassensis frequentemente ocorrem em grupos agregados, que auxilia na proteção contra a desidratação. Assim, intertidal espera-se que as espécies de anêmonas demonstrem alterações morfológicas, fisiológicas Adaptações sociais e comportamentais à vida sob tais condições. Animais que não possuem conchas ou carapaces grossos ou testes, como Anêmonas, com seus corpos moles,tendem a ser especialmente sensíveis para a exposição ao ar. Então, como eles resistem a viver no intertidal habitat? Adaptações morfológicas e comportamentais intertidal Anêmonas já foram descritas, como a presença de Verrugas ou bolhas, secreção de muco pela parede do corpo, adesão de detritos E conchas para reter umidade, formação de forma de cúpula durante a maré baixa, ou a sua restrição às áreas abrigadas da rocha, mesmo quando o ar exposto (por exemplo, Hart e Crowe, 1977; Stotz, 1979). B. caissarum tem apresentado várias adaptações do organismo para lidar com os estresses de água e salinidade do habitat intermareal, enquanto A. sargassensis não tem. A secreção de muco e a presença de verrugas têm sido observadas em B. caissarum, mas não em A. sargassensis, que exibe uma parede de corpo muito suave. Após 1:30 h de exposição ao ar sob luz do sol, A. sargassensis era claramente seco e encolheu, enquanto B. caissarum mostrou a secreção de muco intensa, impedindo assim Perda de umidade, mantendo a sua forma e tamanho normais. Quando A. sargassensis foi forçosamente exposto ao ar por 1 h in situ, mostrou uma redução em hidratação dos tecidos, ao passo que B. caissarum não tem. B. caissarum exibido A forma de cúpula protetora (o que reduz a área de contato com o Médio) tanto no campo como durante a exposição a salinidades extremas em o laboratório. Por outro lado, A.sargassensis nunca assumiu que forma. Além disso, A. sargassensis morreram após a exposição à água doce ou muito diluir a água do mar, ao passo que B. caissarum recuperada após a exposição para todas as salinas extremas. Assim, B. caissarum exibe adaptações suportar a exposição ao ar e a variação da salinidade extrema durante a maré baixa, como seria esperado, dada a sua distribuição nas costas rochosas intermareais. Na verdade, B. caissarum é duas vezes maior que A. sargassensis. No entanto, o que representa a capacidade de B. caissarum de suportar o intertidal dura O habitat não é o tamanho maior e, portanto, a superfície relativa mais pequena, mas a Presença de verrugas, produção de muco e formação de Forma de cúpula. 4.2. Choque hiposmótico in vivo Quando ambas as espécies foram submetidas a um desafio osmótico leve em O laboratório, comparável com o que eles podem enfrentar dentro de piscinas de maré em natureza, A. sargassensis exibido um padrão mais clara de osmoconforma- ção (fluido de tratamento coelenteron como fluido extracelular), enquanto B. caissarum manteve seu fluido de coelenteron mais estável após a redução da salinidade. UMA resposta semelhante à de A. sargassensis foi relatado para o Anemone C. gigantea para salinidades de 20 a 46 psu, também dentro de 6 horas de exposição (Bursey e Harmer, 1979). B. cavernata também equilibrada a osmolalidade de seu coelenteron fluido rapidamente (6h) quando submetidos a salinities variando 11-49 psu (Benson- Rodenbough e Ellington de 1982). Não há relatos sobre as capacidades de cnidários para regular coelenteron concentrações de fluido; literatura disponível mostra osmoionic as concentrações de fluido estritamente seguindo as variações da externo médio (Bursey e Harmer, 1979; Benson- Rodenbough e Ellington, 1982). Após choque hiposmótica, em B. caissarum, o fluido coelenteronconcentrações de Na + , K + e Cl - diminuiu 28%, 25% e 21%respectivamente, que razoavelmente se segue a proporção de salinidade diluição do hiposmótica chocar-se (~ 20%). Apesar da redução no conteúdo iônico, osmolaridade do fluido não se alterou, possivelmente indicando um aumento em osmolitos orgânicos extracelulares. No entanto, o aumento NPS não foi suficiente para explicar a estabilidade observada da osmolalidade, o que pode resultar a partir do movimento de outros osmolitos orgânicos não medido aqui. A. sargassensis, de forma diferente, não apresentou estabilidade nacoelenteron osmolalidade fluido mediante choque hiposmótica. iões variou em conformidade, que mostra a conformação essencial. No entanto, o conteúdo NPS do fluido coelenteron de A. sargassensis apresentado um aumento de 177%após exposição para diluir a água do mar, e isto pode reflectir a redução em conteúdo NPS dos tecidos. Liberação NPS celular para extracelular médio (fluido coelenteron) seria um resultado da sua participação ção na regulação do volume celular em cima choque hiposmótica. Sabe-se que anémonas, tais como M. senil e B. cavernata, quando submetidos astress osmótico, utilizar osmolitos orgânicos para manter a seu celular de volume (Benson-Rodenbough e Ellington, 1982; Howard et al., 1987; Deaton e Hoffmann, 1988). É relevante notar que NPS de A. sargassensis tecidos (2-4 ng / mg de peso húmido de tecido) era muito acimaos respectivos valores para B. caissarum (0,5-0,8 pg / mg de peso molhadolenço de papel). Tal como descrito por Amado et al. (2006), qualquer rotulagem de espaço extracelular foi realizada, assim, uma parte do tecido medido iões ou tecido NPS podem não ser exclusivas de origem intracelular. No entanto, este erro pode ser visto como sistemática, onde a absolutas magnitudes das medições pode ser sujeito a erros, mas a direção da mudança é o que importa. Os resultados do conteúdo in vivo iónico tecido aparentemente indicam que A. sargassensis células utilizam tanto inorgânicos (Na + e Cl -) e osmolitos orgânicos (NPS) para ajustes de volume durante choque hiposmótica, enquanto B. caissarum não parece usar NPSpara o efeito, única possivelmente empregando Cl - . Este mecanismo duploobservado em A. sargassensis já tinha sido descrito em miocárdiocélulas do caranguejo polyphemus de Limulus , que quando sob hiposmóticao stress, a libertação de Na + e Cl - , seguido, após 12 h, por ácidos aminados(Warren e Pierce, 1982), Mas isso não foi observado anteriormente em cnidários. 4.3. Em choque hiperosmótico vivo B. caissarum sob condições hiperosmóticas comporta-se como um“Osmoconformer”. No entanto, não houve aumento significativo em Na + ou Cl - iões foi observado no fluido coelenteron. As únicas osmolytes que alterada no fluido interno foram: K + aumentando até 24%, e o NPSum aumento de 39%, o que pode indicar danos nos tecidos, como nenhum aumento em Na + ou Cl - foi observada. A ausência de mudança de CF de Na + ou Cl - pode significar a absorção celular destes iões para a regulação da água do tecido, como níveis teciduais destes iões em B. caissarum, sob tensão, hiperosmóticona verdade aumentou: respectivamente 81% e 49%. osmoconformer marinha invertebrados exibir envolvimento de solutos inorgânicos em volume da célula Regulamento (Smith e Pierce, 1987; McCarty e O'Neil, 1992; Deaton e Pierce, 1994; Souza e Scemes de 2000). Este parece ser o caso com B. caissarum sob anisosmoticity. Esta espécie tende aacumular de Na + e Cl -, quando expostos a um choque hiperosmótico, quantotambém observada em outros animais (Natochin et al., 1979; MacKnight e col., 1994; Deaton, 1997). Quando A. sargassensis foi exposta ao choque hiperosmótico, Cl - e K + aumentada no fluido, respectivamente,por 44% e 20%, seguido de osmolalidade. No entanto, há acumulação de osmolitos foi detectado no tecido. Contrariamente à conclusão desenhado para o choque hiposmótica, osmolitos orgânicos, tal como medido pela NPS, não parecem estar envolvidos na regulação da água tecido quando estes anémonas estão sob tensão hiperosmótico. Ambas as espécies estudadas aqui parecem exibir mais mecanismos de regulação, como uma resposta a diluída meios de comunicação do que para os meios de comunicação de alta salinidade, pelo menos na parte experimental tempos seleccionados para este estudo. 4.4. Em desafio osmótico vitro Em experiências in vitro, em seguida, foi realizada a fim de mais caracterizar as respostas das células destas duas anémonas para osmótico estresse. Através da aplicação de choques hiposmótico e hiperosmóticas para células isoladas, poderíamos examinar directamente as suas respostas de volume. Os resultados indicam um padrão distintode regulação do volume celular quando sua as células foram sujeitas a choque hiposmótica. Caissarum B. células exibiramregulação do volume total. Não só eles possuem RVD mecanis- mos, mas eles não inchar em tudo sob choque hiposmótica; deles volume de isosmótica foi mantida durante todo o experimento. Relatos de uma manutenção tão eficiente do volume celular ainda não tem sido descrito para as células cnidários. Esta situação, onde não observamos inchaço em tudo durante uma grande mudança abrupta para uma condição hiposmótica, é normalmente observado apenas durante a aplicação gradual de um choque hiposmótica, o que permite uma activação mais eficiente dos mecanismos reguladores (Driessche et al., 1997; Tuz et al., 2001). Diferentemente, quase 50% inchaço ocorre imediatamente após a aplicação do choque hiposmótica (~ 21% de diluição) para A. sargassensis células. Após 20 min de exposição achoque hiposmótica, as células começam a reduzir o volume da célula, mostrando, assim, um RVD resposta parcial. No entanto, eles não retornam ao seu originais volume até ao final da experiência. Contrariamente a estes dados, um terceiro resposta foi observada em nematocysts isolado a partir do Anemone A. diaphana quando submetido a choque hiposmótica (diluição a 35%), quemostraram inchaço proporcional ao choque osmótico, mas que estava seguido de uma RVD rápida (dentro de 5 min) (La Spada et al., 1999). O cálcio desempenha um papel central na activação e o controlo do volume da célula mecanismos de regulação e RVD na maioria das células expostas a hiposmótica situações (McCarty e O'Neil, 1992; Hoffmann e Dunham, 1995; Wehner et al., 2003). Os aumentos no cálcio intracelular são relatados para activar K + e / ou efluxos de aminoácidos na RVD (Reuss e Cotton, 1994). Aqui, o único efeito da remoção de cálcio na regulação do volume do Anemone de células foi em RVD por B. caissarum. Resultados semelhantes foram encontrados emnematocytes isolados a partir de A. diaphana , onde RVD foi bloqueada se Ca 2+ influxo foi impedida, quer pela aplicação de um Ca 2+ solução livre ou pelatratamento das células com Gd 3+ (como Ca 2+ estiramento bloqueador do canal) (La Spada et al., 1999). Além disso, Marino e La Spada (2007) estudou a participação de Ca 2+ durante RVD e RVI em A. mutabilis nematocytes, e encontraramque Ca 2+ é necessário para realizar RVD e RVI. Contrariando estesevidências, a participação de extracelular de Ca 2+ na RVD parcialresposta de A. sargassensis não foi observado. Relatórios sobre o cálciosinalização durante RVI não são comuns (Marchenko e Sage, 2000; Erickson et al., 2001). Tecido cardíaco do sapo Rana catesbeiana, quando submetidos a solução salina hiperosmótica, também não mostraram qualquer envolvimento de Ca 2+ nos mecanismos de regulação observados (Cruz e Souza, 2008). Quando as células anêmona foram expostos a solução salina hiperosmótica, eles não o fizeram essencialmente exibir verdadeira RVI, mas certamente minimizar encolhendo (fazer não apresentam um comportamento osmometric). E esses mecanismos não são de cálcio-dependente. 4.5. Vias envolvidas na RVD e RVI Na literatura, de Na + / K + inibição -ATPase leva a muito variávelresultados em termos de regulação do volume celular. Pode causar inchaço celular, célula encolhimento, ou nenhuma alteração no volume da célula (Lang et al., 1998). Em nossos resultados, com choque osmótico mais ouabaína, houve apenas um efeito quando ouabaína foi associada ao choque hiposmótica, em caissarum B. células; células têminchado ainda mais do que quando submetidos ao choque hiposmótica sozinho. Este aumento de volume também foi observada no hiposmótica choque sob condições isentas de cálcio. Aumento da intracelulares de Ca 2+ execuçõesum papel importante na regulação do volume celular, estimulando Na + / K + ATPase (Reuss e Cotton, 1994). Assim, como B. caissarum células mostram uma Ca 2+ -RVD dependente (extracelular de Ca 2+ influxo e / ou intracelular de Ca 2+ libertação), que pode muito bem ser que o aumento no Ca 2+ durante o hiposmóticachoque estimula o de Na + / K + ATPase. O lançamento electroneutral de KCl parece ser um dos principais características do RVD em muitos sistemas celulares (Lang et al., 1998; Wehner et al., 2003). Uma maneira de liberar esses osmolytes é através activação do K + -Cl - co-transportador. A participação desta transportadorafoi aparente durante o RVD de células de B. caissarum, como oaplicação de um choque hiposmótica na presença de furosemida (3 mM, um bloqueador desta via com esta concentração) inibiu a capacidade de concluir RVD. Este resultado demonstra que a liberação de K + e Cl - iões através da K + -Cl - co-transportador é de fundamental importânciapara B. caissarum para manter o volume da célula normalmente durante hiposmótica choque. Além disso, esta via parece ser muito rapidamente activado, vez que as células não inchar. Quando nematocysts isolado a partir da Anemone A. diaphana foram submetidas a um choque hiposmótica (35%), umaRVD foi observada através do efluxo de KCl (La Spada et al., 1999). La Spada e colaboradores foram os primeiros a denunciar o envolvimento de osm�ito caminhos de fluxo na regulação do volume celular anêmona. Para Caissarum B. células realizando RVD, de Na + / K + -ATPase e K + -Cl - parecemestar em ação, provavelmente ambas as vias de ser estimulado por Ca 2+ ; a aumento da actividade da bomba contribui para o aumento da fora gradiente químico para K + . Desde a literatura descreve que osmolytes orgânicos pode usar vias com características semelhantes às que de aniões inorgânicos, fluxo orgânico pode então ser sensível aos bloqueadores de vias de cloreto de (Kirk et al., 1992; Pasantes-Morales et al., 1999). As células de ambas as espéciesforam expostas a choque hiposmótica na presença de DIDS (200? M), um bloqueador de transportadores de cloreto. Somente caissarum B. células respondeu aesse bloqueador, ou seja, eles mostraram um aumento de volume que não ocorreu com a aplicação do choque hiposmótica. Este resultado sugere que a libertação de osmolitos orgânicos para efeitos de regulação do volume celular é, pelo menos em parte, através de uma via sensível à DIDS. Através da exposição das células de B. caissarum a um hiposmóticachoque na presença de cloreto de mercúrio, que poderia sugerir a envolvimento de aquaporinas (tais como AQP1, AQP2, AQP3, e AQP5) em RVD. A célula não conseguiu manter o seu volume celular de controlo e inchou dramaticamente, causando a ruptura das suas membranas plasmáticas. Estes dados, no entanto, indicam que a via para o fluxo de água é outra aquaporina, insensível ao cloreto de mercúrio, o que explica o inchaço e rebentamento. Portanto, no caso de B. caissarum expostos asalina hiposmótica além de Hg 2+ , água fica em, mas não pode sair, assimfazendo com que células de explosão. O mesmo não foi observado em A. sargassensis células. O padrão de inchaço encontrada na presença de cloreto de mercúrio estava novamente a mesma como quando as células foram expostas apenas para um hiposmótica choque. Em ambas as situações, a célula inchou perto de 50%. Na presença de Hg 2+ , estas células não estourar, o que é consistente com uma propostaque as células de A.sargassensis não empregam HgCl 2 canais de água senselpara efluxo de água durante a sua RVD parcial. Não foi possível, considerando os bloqueadores utilizados na presença de choque hiposmótica, para realçar o transporte osmólito em vias A. sargassensis células. Assim, estas células podem ser utilizar outrosrotas, mas provavelmente não Na + K + ATPase, a K + Cl - co-transporte, oua libertação de osmolitos orgânicos através de vias inorgânicos. Falta de efeito de ouabaina como aqui observado com A. sargassensis células expostas ao choque hiposmótica também foi descrito para as células embrionárias de ratinho (Pogorelov e Pogorelova de 2009). Houve uma indicação de uma tarde mobilização osm�ito (cerca de 20minpós-exposição), que é provavelmente a libertação de NaCl por uma via condutora não testado, ou talvez aminoácidos. Deve ser lembrado que A. sargassensis tecidosvisualizar tulos elevados de NPS, e que os resultados in vivo apontar para uma libertação de NPS no fluido coelenteron mediante choque hiposmótica. As células de ambos B. caissarum e A. sargassensis não mostrou acapacidade para RVI após choque hiperosmótica. Houve uma redução o volume que foi proporcional ao grau de choque. Mais uma vez, em Contrastando com estes dados, nematocysts isolados a partir de A. diaphana apresentaram a capacidade para regular o volume, em condições hiperosmóticas (RVI). Este processo envolveu a absorção de iões por meio de Na + canais eatravés do co-transportador de Na + -2Cl - K + (Marino e La Spada, 2004). Curiosamente, quando as células de A. sargassensis foram submetidos ahyperosmoticity na presença de furosemida, Na + -2Cl - -K + inibidor (a 100 uM), as células perderam menos volume do que quando simplesmente submetido para a solução salina hiperosmótico. De alguma forma, o bloqueio deste transporter apareceu para ativar outra via que aumentou captação osm�ito, ou talvez, mais simplesmente, gerado a retenção de osmolytes. Se Na + -2Cl - K + nas células anêmona trabalha promovendo efluxode Na + , K + e Cl - , em vez da sua absorção, o seu bloqueio porfurosemida seria realmente causar retenção de osmolytes. De fato, dependendo gradientes e as forças motrizes, esta co-transportador pode operar de forma reversível, promovendo osm�ito efluxo (Russell de 2000). Um alto (por exemplo, ~ 7 vezes) para dentro gradiente químico de cloreto de ([Cl - ] a / [Cl - ] em) favoreceria a operação deste transportador para o influxo do iônica osmolitos, mas uma ~ 2-dobre para dentro gradiente químico para cloreto faria favorecer a sua operação oposta, para o efluxo osm�ito (Russell, 2000). Isto é também um resultado do gradiente químico para fora mais forte para o potássio, e considerando a 1: 1: 2 de Na + : K + : Cl - estequiometria, o que resulta emelectroneutral transporte de osmolitos iónicos (Russell, 2000). Este comportamento de Na + -2Cl - K + em células anêmona pode ser esperado, comocélulas osmoconformer marinhos muitas vezes exibir uma substância química para o exterior maior gradiente de K efluxo (~ gradiente de concentração de 10 vezes), do que um para dentro gradiente químico para Na + ou Cl - captação (~ 2-4-dobra gradiente de concentração). Com efeito, o cloreto de sódio intracelular em esses invertebrados pode ser extraordinariamente alta (Wilmer, 1978; Kirschner, 1991; Stucchi-Zucchi e Salomão, 1998). Em conclusão, morfológica e adaptações comportamentais do organismo inteiro aliada a mecanismos celulares de volume da célula regulação, especialmente após diluição de água do mar, permitem B. caissarum paraviver no intertidal, enquanto A. sargassensis não pode. B.caissarum 1)exibe cúpula-forma formação e a produção de muco para reduzir a perda de água, através de uma diminuição aparente na sua permeabilidade à água, 2) está capaz de manter a sua osmolaridade fluido coelenteron ligeiramente regulada mediante choque hiposmótica, e 3) executa RVD completa. Por outro lado, A. sargassensis, restrito ao submaré, utiliza essencialmente para o NPScapacidade RVD parcial. Reconhecimentos Autores gostariam de agradecer ao Dr. Robert T Boyle pela leitura crítica o manuscrito, e Dr. Horst Onken para gentilmente doar o transporte bloqueadores. EM Amado teve o apoio da CAPES, Brasil. Os autores afirmar que todos os experimentos foram conduzidos de acordo com leis brasileiras de Ética em Experimentação Animal. Referencias Alés, E., Gabilan, N.H., Cano-Abad, M.F., García, A.G., López, M.G., 2000. The sea anemone toxin Bc2 induces continuous or transient exocytosis, in the presence of sustained levels of high cytosolic Ca2+ in chromaffin cells. J. Biol. Chem. 275, 37488–37495. Amado, E.M., Freire, C.A., Souza, M.M., 2006. Osmoregulation and tissue water regulation in the freshwater red crab Dilocarcinus pagei (Crustacea, Decapoda), and the effect of waterborne inorganic lead. Aquat. Toxicol. 79, 1–8. Belyantseva, I.A., Frolenkov, G.I., Wade, J.B., Mammamo, F., Kachar, B., 2000. Water permeability of cochlear outer hair cells: characterization and relationship to electromotility. J. Neurosci. 20, 8996–9003. Benson-Rodenbough, B., Ellington, W.R., 1982. Responses of the euryhaline sea anemone Bunodosoma cavernata (Bosc) (Anthozoa, Actinaria, Actiniidae) to osmotic stress. Comp. Biochem. Physiol. A 72, 731–735. Bursey, C.R., Harmer, J.A., 1979. Induced changes in the osmotic concentration of the coelenteron fluid of the sea anemone Condylactis gigantea. Comp. Biochem. Physiol. A 64, 73–76. Cha, H.-R., Buddemeier, R.W., Fautin, D.G., Sandhei, P., 2004. Distribution of sea anemones (Cnidaria, Actiniaria) in Korea analyzed by environmental clustering. Hydrobiology 530, 497–502. Chamberlin, M.E., Strange, K., 1989. Anisosmotic cell volume regulation: a comparative view. Am. J. Physiol. 257, C159–C173. Choe, K., Strange, K., 2008. Volume regulation and osmosensing in animal cells. In: Evans, D.H. (Ed.), Osmotic and Ionic Regulation: cells and animals. CRC press, New York, pp. 37–67. Clark, M.E., 1968. Free amino acid levels in the coleomic fluid and body wall of polychaetes. Biol. Bull. 134, 35–47. Connell, J.H., 1972. Community interactions on marine rocky intertidal shores. Annu. Rev. Ecol. Syst. 3, 169–192. Cruz, L.N., Souza, M.M., 2008. Volume regulation mechanisms in Rana castebeiana cardiac tissue under hyperosmotic stress. Zoology 111, 287–294. Deaton, L.E., 1997. Comparative aspects of cellular-volume regulation in cardiomyocytes. Physiol. Zool. 70, 379–390. Deaton, L.E., Hoffmann, R.J., 1988. Hypoosmotic volume regulation in the sea anemone Metridium senile. Comp. Biochem. Physiol. C 91, 187–191. Deaton, L.E., Pierce, S.K., 1994. Introduction: cellular volume regulation mechanisms and control. J. Exp. Zool. 268, 77–79. Driessche, W.V., Smet, P.D., Li, J., Allen, S., Zizi, M., Mountian, I., 1997. Isovolumetric regulation in a distal nephron cell line. Am. J. Physiol. 272, C1890– C1898. Erickson, G.R., Alexopoulos, L.G., Guilak, F., 2001. Hyper-osmotic stress induces volume change and calcium transients in chondrocytes by transmembrane, phospholipid, and G-protein pathways. J. Biomech. 34 (12), 1527–1535. Foster, C., Amado, E.M., Souza, M.M., Freire, C.A., 2010. Do osmoregulators have lower capacity of muscle water regulation than osmoconformers? A study on decapod crustaceans. J. Exp. Zool. A 313, 80–94. Hallows, K.R., Knauf, P.A., 1994. Principles of cell volume regulation. In: Strange, K. (Ed.), Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. CRC press, Boca Raton, pp. 3–24. Hart, C.E., Crowe, J.H., 1977. The effect of attached gravel on survival of intertidal anemones. Trans. Am. Microsc. Soc. 96, 28–41. Hoffmann, E.K., Dunham, P.B., 1995. Membrane mechanisms and intracellular signalling in cell volume regulation. Int. Rev. Cytol. 161, 173–262. Hoffmann, E.K., Lambert, I.H., Pedersen, S.F., 2009. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol. Rev. 89, 193–277. Howard, C.L., Swank, P., Kasschau, M.R., 1987. Environmental and seasonal influences of the free amino acid pool of the sea anemone Bunodosoma cavernata (Bosc) under natural conditions. Comp. Biochem. Physiol. A 87, 319–325. Kasschau, M.R., Ragland, J.B., Pinkerton, S.O., Chen, E.C.M., 1984. Time related changes in the free amino acid pool of the sea anemone, Bunodosoma cavernata, during salinity stress. Comp. Biochem. Physiol. A 79, 155–159. Kirk, K., Ellory, J.C., Young, J.D., 1992. Transport of organic substrates via a volume-activated channel. J. Biol. Chem. 267, 23475–23478. Kirschner, L.B., 1991. Water and ions. In: Prosser, C.L. (Ed.), Environmental and metabolic animal physiology. : Comparative animal physiology. Wiley-Liss, NewYork, pp. 13–107. La Spada, G., Biundo, T., Nardella, R., Meli, S., 1999. Regulatory volume decrease in nematocytes isolated from acontia of Aiptasia diaphana. Cell. Mol. Biol. 45 (2), 249–258. Lang, F., Waldegger, S., 1997. Regulating cell volume. Am. Sci. 85, 440–447. Lang, F., Busch, G.L., Ritter, M., Volkl, H., Waldegger, S., Gulbins, E., Haussinger, D., 1998. Functional significance of cell volume regulatorymechanisms. Physiol. Rev. 78, 247–306. Lowry, O.H., Rosebrough, A.L., Farr, A.L., Randall, R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265– 275. Macknight, A.D.C., Gordon, L.G.M., Purves, R.D., 1994. Problems in the understanding of cell volume regulation. J. Exp. Zool. 268, 80–89. Malpezzi, E.L., Freitas, J.C., Muramoto, K., Kamiya, H., 1993. Characterization of peptides of sea anemone venom collected by a novel procedure. Toxicon 31 (7), 853–864. Marchenko, S.M., Sage, S.O., 2000. Hyperosmotic but not hyposmotic stress evokes a rise in cytosolic Ca2+ concentration in endothelium of intact rat aorta. Exp. Physiol. 85 (2), 151–157. Marinelli, R.A., Pham, L., Agre, P., LaRusso, N.F., 1997. Secretin promotes osmotic water transport in rat cholangiocytes by increasing aquaporin-1 water channels in plasma membrane. J. Biol. Chem. 272, 12984–12988. Marino, A., La Spada, G., 2004. Regulatory volume increase in nematocytes isolated from acontia of Aiptasia diaphana (Cnidaria, Anthozoa). Cell. Mol. Biol. 50, 533–542. Marino, A., La Spada, G., 2007. Calcium and cytoskeleton signaling during cell volume regulation in isolated nematocytes of Aiptasia mutabilis (Cnidaria: Anthozoa). Comp. Biochem. Physiol. A 147, 196–204. McCarty, N.A., O'Neil, R.G., 1992. Calcium signaling in cell volume regulation. Physiol. Rev. 72, 1037–1061. Meinild, A.K., Klaerke, D.A., Zeuthen, T., 1998. Bidirectional water fluxes and specificity for small hydrophilic molecules in aquaporins 0–5. J. Biol. Chem. 273, 32446–32451. Mendes, E.G., 1976. Chemical mediation in Coelenterata. An. Acad. Bras. Ciênc. 47, 101–104. Natochin, Yu.V., Berger, V.Ya., Khlebovich, V.V., Lavrova, E.A., Michailova, O.Yu., 1979. The participation of electrolytes in adaptation mechanisms of intertidal molluscs' cells to altered salinity. Comp. Biochem. Physiol. A 63, 115–119. Nybakken, J.W., 1988. Marine Biology: An Ecological Approach. Harper-Collins Publishers, New York. Oliveira, J.S., Redaelli, E., Zaharenko, A.J., Cassulini, R.R., Konno, K., Pimenta, D.C., Freitas, J.C., Clare, J.J., Wanke, E., 2004. Binding specificity of sea anemone toxins to Nav 1.1–1.6 sodium channels: unexpected contributions from differences in the IV/S3-S4 outer loop. J. Biol. Chem. 279 (32), 33323–33335. Pasantes-Morales, H., Ochoa De La Paz, L.D., Sepulveda, J., Quesada, O., 1999. Amino acids as osmolytes in the retina. Neurochem. Res. 24, 1339–1346. Pierce, S.K., Minasian, L.L., 1974. Water balance of a euryhaline sea anemone, Diadumene leucolena. Comp. Biochem. Physiol. A 49, 159–167. Pogorelov, A.G., Pogorelova, V.N., 2009. Osmotic behavior of mouse embryonic cells subjected to hypotonic shock. Biofizika 54, 482–487. Reuss, L., Cotton, C.U., 1994. Volume regulation in epithelia: transcellular transport and cross-talk. In: Strange, K. (Ed.), Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. CRC press, Boca Raton, pp. 31–47. Richardson, D.L., Harriott, V.J., Harrison, P.L., 1997. Distribution and abundance of giant sea anemones (Actiniaria) in subtropical eastern Australian waters. Mar. Freshw. Res. 48 (1), 59–66. Ruiz, J.L., Souza, M.M., 2008. Osmotic stress and muscle tissue volume response of a fresh water bivalve. Comp. Biochem. Physiol. A 151, 399–406. Russell, J.M., 2000. Sodium–potassium– chloride cotransport. Physiol. Rev. 80, 211–276. Scemes, E., Salomão, L.C., McNamara, J.C., Cassola, A.C., 1991. Lack of osmoregulation in Aplysia brasiliana: correlation with response of neuron R15 to osphradial stimulation. Am. J. Physiol. 260, R777–R784. Smith, L.H., Pierce, S.K., 1987. Cell volume regulation by molluscan erythrocytes during hypoosmotic stress: Ca2+ effects on ionic and organic osmolyte effluxes. Biol. Bull. 173, 407–418. Souza, M.M., Scemes, E., 2000. Volume changes in cardiac ventricles from Aplysia brasiliana upon exposure to hyposmotic shock. Comp. Biochem. Physiol. A 127, 99–111. Stotz, W.B., 1979. Functional morphology and zonation of three species of sea anemones from rocky shores in Southern Chile. Mar. Biol. 50, 181–188. Strange, K., 2004. Cellular volume homeostasis. Rev. Adv. Physiol. Educ. 28, 155–159. Stucchi- Zucchi, A., Salomão, L.C., 1998. The ionic basis of membrane potentials and adaptation to hyposmotic stress in Perna perna, an osmoconforming mollusk. Comp. Biochem. Physiol. A 121, 143–148. Tuz, K., Ordaz, B., Vaca, L., Quesada, O., Pasantes-Morales, H., 2001. Isovolumetric mechanisms in cultured cerebellar granule neurons. J. Neurochem. 79, 143–151. Warren, M.K., Pierce, S.K., 1982. Two cell volume regulatory systems in the Limulus myocardium: an interaction of ions and quaternary ammonium compounds. Biol. Bull. 163, 504–516. Watanabe, S., Kaneko, T., Aida, K., 2005. Aquaporin-3 expressed in the basolateral membrane of gill chloride cells in Mozambique tilapia Oreochromis mossambicus adapted to freshwater and seawater. J. Exp. Biol. 208, 2673–2682. Wehner, F., Olsen, H., Tinel, H., Kinne-Saffran, E., Kinne, R.K.H., 2003. Cell volume regulation: osmolytes, osmolytes transport, and signal transduction. Physiol. Biochem. Pharmacol. 148, 1–80. Wilmer, P.G., 1978. Sodium fluxes and exchange pumps: further correlates of osmotic conformity in the nerves of an estuarine bivalve (Mytilus edulis). J. Exp. Biol. 77, 207– 223.
Compartilhar