Papel do sistema Nociceptina Orfanina FQ receptor NOP no processamento da memória de reconhecimento de objetos

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Biociências
Bacharelado em Ciências Biológicas
ELIS BRISA DOS SANTOS
Papel do sistema Nociceptina/Orfanina FQ – receptor NOP no processamento
da memória de reconhecimento de objetos
Natal
2023
ELIS BRISA DOS SANTOS
Papel do sistema Nociceptina/Orfanina FQ – receptor NOP no processamento
da memória de reconhecimento de objetos
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado à Faculdade de Ciências
Biológicas, do Centro de Biociências (CB) da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN), como parte dos requisitos
para obtenção do título de bacharel em
Ciências Biológicas.
Orientadora: Profª Dra. Janine Inez Rossato
Natal, 2023
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Santos, Elis Brisa dos.
Papel do sistema Nociceptina/Orfanina FQ - receptor NOP no
processamento da memória de reconhecimento de objetos / Elis
Brisa dos Santos. - Natal, 2023.
45 f.: il.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Centro de Biociências, Graduação em Ciências
Biológicas. Natal,RN, 2023.
Orientação: Profa. Dra. Janine Inez Rossato.
1. Receptor NOP - Monografia. 2. N/OFQ - Monografia. 3.
Hipocampo - Monografia. 4. Codificação da memória -
Monografia. 5. Consolidação - Monografia. I. Rossato, Janine
Inez. II. Título.
RN/UF/BSCB CDU 577.175.8
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
Papel do sistema Nociceptina/Orfanina FQ – receptor NOP no processamento
da memória de reconhecimento de objetos
ELIS BRISA DOS SANTOS
Apresentada em 14 de dezembro de 2023.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Profª. Drª. Andressa Radiske - Membro Externo
Instituto Internacional de Neurociências Edmond e Lily Safra - ISD
____________________________________________
Profª. Drª. Elaine Cristina Gavioli - Membro Interno
Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN
____________________________________________
Profª. Drª. Janine Inez Rossato - Orientadora
Departamento de Fisiologia e Comportamento - UFRN
AGRADECIMENTOS
Aqui, neste trabalho, está a conclusão de mais uma etapa da minha vida.
Finalizar uma segunda graduação, tendo passado por uma pandemia mundial, com
o Brasil em meio a uma crise governamental e econômica, ao mesmo tempo que
faço um doutorado e enfrento tantas coisas em minha vida pessoal e profissional…
Só me fazem ser imensamente grata ao Pai Celestial, o Grande Arquiteto do
Universo, que me deu forças e ferramentas para enfrentar cada passo de toda essa
jornada. Meu primeiro agradecimento só poderia ser esse, sem mais.
Reconheço que absolutamente nada disso seria possível sem que meus pais,
Andréa e Francisco, estivessem onde sempre estão, me amparando e sendo meu
suporte emocional em tantos momentos, devo tudo o que sou e tudo o que eu
conquisto a vocês. Aos meus irmãos Sol e Mar também, mesmo quando longe ou
quando perto, tudo que aprendi com vocês fez e faz a diferença. Meu avô José
Fernandes, apresentei esse trabalho no dia do seu aniversário, então esse trabalho
eu dedico à você. Tenho em vocês, família, todo o amor que existe dentro de mim,
deixo aqui expresso que vencemos, essa conquista é plural e é de vocês também.
Aos meus grandes amigos de todos os momentos, Andressa, Ana, Gustavo e
Dêverton, vocês foram essenciais para que eu nunca desistisse e tivesse forças, dia
após dia. Aos meus demais amigos e familiares que fizeram a diferença, em especial
Renata, André, João, Carine, Gênedy, Caio, Annara, Joseph, Davi, Camila, Jhones,
Marcel e Joel, e as crianças que estiveram presentes nesse período, Nico e Zazá.
Agradeço profundamente à Janine, a melhor orientadora e profissional que já
tive o prazer em conhecer. Obrigada por topar fazer comigo esse TCC, mesmo eu
sendo tão “enrolada” às vezes, haha. Agradeço às profissionais incríveis da minha
banca, Andressa e Elaine, por todos os comentários e ajuda na arguição deste
trabalho. Agradeço a todos do Laboratório de Pesquisa da Memória, aos membros
atuais e anteriores, Martín, Lia, Andressa, Caro, Gênedy, João, Johseph, Raquel,
Carla, Samuel, Gustavo, Luizi, Lívia, Rodrigo, Líginy, Marina, Vitória e Gabi.
Agradeço ao Instituto do Cérebro e Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, pelo espaço e infraestrutura para o desenvolvimento das atividades deste
trabalho, e pelo espaço de formação e desenvolvimento profissional. Por último e
não menos importante, agradeço também ao CNPq, pelo financiamento de insumos
ao laboratório no qual esse estudo foi realizado.
Si hortum in bibliotheca habes deerit nihil
Cícero (106-43 a.C.)
RESUMO
A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um peptídeo endógeno de 17 aminoácidos
relacionado aos peptídeos opióides, mas que possui seu próprio receptor, NOP. Em
sua via canônica, a atividade do receptor NOP medeia abertura e fechamento de
canais iônicos que induzem a inibição da atividade neural e, por estar amplamente
distribuídos no SNC, sendo particularmente abundantes em áreas corticais e
límbicas (hipocampo, giro denteado, áreas septais e amígdala), sugere-se que esse
receptor esteja diretamente associado ao processamento cognitivo complexo. De
fato, o sistema N/OFQ - NOP é capaz de modular o processamento nociceptivo, de
aprendizado, do estado emocional, do controle neuroendócrino, da ingestão de
alimentos, do controle motor e das vias de recompensa e prazer. Trabalhos
anteriores demonstraram que o receptor NOP participa da formação de diversas
memórias, como as aversivas e espaciais, porém pouco se sabe de sua participação
nas memórias de reconhecimento. O objetivo central deste trabalho é avaliar o papel
do sistema N/OFQ - NOP hipocampal nas diferentes fases do processamento da
memória de reconhecimento de objetos, utilizando ratos como modelos
experimentais. Como principais achados, verificamos que a ativação dos receptores
NOP hipocampais antes da sessão de treino, prejudica a formação da memória de
reconhecimento, porém quando administrada imediatamente após o treino esse
efeito amnésico não é observado, mostrando que esse receptor tem papel na
formação do engrama mnemônico, porém não na sua estabilização a longo prazo.
Para garantir que esse efeito não ocorreu em detrimento de fatores inespecíficos,
verificamos que as diferentes doses utilizadas nesse estudo não foram capazes de
modificar o comportamento exploratório e ambulatório dos animais, tampouco
modificou estados relacionados à ansiedade nos animais experimentais. Esses
achados representam avanços no entendimento da ação do receptor NOP na região
do hipocampo e abre caminho para que novos estudos envolvendo sua ação em
outros processos cognitivos sejam realizados.
Palavras-chave: Receptor NOP; N/OFQ; Hipocampo; Codificação de memórias;
Consolidação.
ABSTRACT
Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is an endogenous peptide, made of 17 amino acids,
related to the opioid peptides, but having its own receptor, NOP. In its canonical
pathway, the activity of the NOP receptor mediates the opening and closing of ion
channels that induce the inhibition of neural activity and, because it is widely
distributed in the CNS, being particularly abundant in cortical and limbic areas
(hippocampus, dentate gyrus, septal areas and amygdala), it is suggested that this
receptor is directly associated with complex cognitive processing. Indeed, the N/OFQ
- NOP system can modulate nociceptive processing, learning, emotional states,
neuroendocrine control, food intake, motor control,and reward and pleasure
pathways. Previous studies have demonstrated the involvement of the NOP receptor
in the formation of various memories, including aversive and spatial memories, but
little is known about its role in recognition memory. The main objective of this study is
to evaluate the role of the hippocampal N/OFQ - NOP system in different phases of
object recognition memory processing, using rats as experimental models. As
primary findings, we observed that the activation of hippocampal NOP receptors
before the training session, using different doses of the endogenous ligand N/OFQ,
impairs the formation of recognition memory. However, when administered
immediately after training, this amnestic effect is not observed, indicating that this
receptor plays a role in the formation of the mnemonic engram but not in its long-term
stabilization. To ensure that this effect did not occur due to nonspecific factors, we
confirmed that the different doses used in this study did not alter the exploratory and
ambulatory behavior of the animals, nor did they induce anxiety-related states in the
experimental animals. These findings contribute to advancing the understanding of
the NOP receptor's action in the hippocampal region and pave the way for further
studies involving its role in other cognitive processes.
Keywords: NOP receptor; N/OFQ; Hippocampus; Memory encoding; Consolidation.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1.2.1: Modelagem molecular do complexo N/OFQ-NOP 14
Figura 1.2.2: Resumo da sinalização do receptor NOP 15
Figura 5.1.1: Ação da ativação do receptor NOP utilizando a N-OFQ antes
do treino 26
Figura 5.1.2: Análise do comportamento ambulatório dos animais que
receberam veículo ou diferentes doses de N/OFQ antes do treino 27
Tabela 5.1: Exploração em segundos durante a sessão de treino para o
experimento com administração farmacológica pré-treino 27
Tabela 5.2: Exploração em segundos durante a sessão de treino para o
experimento com administração farmacológica pós-treino 30
Figura 5.2.1: Ação da ativação do receptor NOP utilizando a N-OFQ depois
do treino 31
Figura 5.2.2: Análise do comportamento ambulatório dos animais que
receberam veículo ou diferentes doses de N/OFQ depois do treino 32
Figura 5.3: Atividade exploratória e ambulatória espontânea 33
Tabela 5.3: Atividade exploratória e ambulatória espontânea 34
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 11
1.1 A memória de reconhecimento e o hipocampo 11
1.2 O Sistema Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP 13
1.3 O Sistema N/OFQ – NOP e memória 17
2. JUSTIFICATIVA 18
3 OBJETIVOS 19
3.1 Objetivo central 19
3.2 Objetivos específicos 19
4 MATERIAIS E MÉTODOS 20
4.1 Animais experimentais 20
4.2 Procedimentos cirúrgicos 20
4.3 Procedimentos comportamentais: 21
4.3.1 Tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON) 21
4.3.2 Tarefa do campo aberto 22
4.4 Infusão de drogas 22
4.5 Análise estatística dos dados 23
5 RESULTADOS 24
5.1 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, afeta a
codificação da memória de reconhecimento de objetos 24
5.2 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, não afeta a
consolidação da memória de reconhecimento de objetos 28
5.3 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, não afeta a
atividade exploratória e ambulatória espontânea no campo aberto 32
6 DISCUSSÕES 35
7 CONCLUSÕES 37
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38
11
1 INTRODUÇÃO
1.1 A memória de reconhecimento e o hipocampo
Numa perspectiva evolucionista, as memórias são criadas de modo que
possamos armazenar informações relevantes sobre o ambiente que estamos
inseridos. Tê-las nos permite uma análise aprofundada das situações, a partir
desses conhecimentos prévios, para que possamos direcionar o nosso
comportamento de forma assertiva, favorecendo a sobrevivência dos indivíduos e a
reprodução.
Entretanto, nem todas as memórias são iguais. Elas podem ser relacionadas
ao aprendizado motor, de procedimentos, de localização espacial, ou mesmo sobre
nossa capacidade de reter conhecimentos e lembrar acontecimentos passados;
podendo durar poucos segundos ou permanecer por vários dias ou anos, sendo
portanto classificadas em diferentes categorias (Squire e Kandel, 2003). As
memórias que podem ser acessadas de forma consciente e verbalizadas são
chamadas de memórias declarativas, ou explícitas, enquanto as que não o são
podem ser chamadas implícitas, ou não-declarativas (Bear et al., 2015).
Nas memórias declarativas baseia-se nosso conhecimento acerca do mundo,
e são elas as que definem a maneira como interagimos com outros indivíduos e com
os diferentes componentes ambientais que nos rodeiam (Prado et al., 2007; Prado et
al., 2008). A memória de reconhecimento é um componente central das memórias
declarativas, elas permitem discriminar características, elementos, situações e/ou
artefatos familiares e novos, uma capacidade obviamente significativa no que diz
respeito à sobrevivência (Wan et al., 1999).
Mas como essas memórias são armazenadas? Diversos estudos
neurocientíficos vêm demonstrando a existência de diferentes substratos físicos que
sustentam os engramas, em especial as alterações na eficiência da transmissão
sináptica de diferentes populações neuronais em diferentes regiões cerebrais,
permitindo o armazenamento dos diferentes tipos de memória (Ramon y Cajal, 1899;
Morris et al., 1949; Goelet et al., 1986; Martin et al., 2000; Dayan e Abbott, 2001).
Em outras palavras, cada tipo de memória possui diferentes marcos anatômicos,
eletrofisiológicos e bioquímicos (Stangor e Walinga, 2014). A codificação e o
12
armazenamento inicial de uma memória são seguidos pelo processo de
consolidação permitindo que os traços mnemônicos se tornem estabilizados (Muller
e Pilzecker, 1900; McGaugh, 1966).
Para estar disponível como memória de longo prazo, as informações
precisam passar por três estágios de processamento, precisando ser codificadas,
armazenadas para depois poderem ser evocadas no momento oportuno (Melton,
1963). A codificação refere-se à experiência inicial de perceber e adquirir a
informação. Em geral, a codificação é seletiva e está relacionada com a relevância
do fato a ser recordado, estando diretamente relacionada com mecanismos
atencionais (Hunt, 2003). O armazenamento/consolidação é entendido como a
manutenção das informações ao longo do tempo. As experiências criam rastros de
memória, ou engramas, que são como impressões produzidas por alterações
morfofuncionais no sistema nervoso (Tulving e Bower, 1975). Já a recuperação, ou
evocação das memórias, é a etapa no qual a informação armazenada é acessada,
sendo este o processo chave da memória (Tulving e Bower, 1975).
Análises neuropsicológicas de pacientes amnésicos e experimentos com
lesões cerebrais em animais indicam que a integridade do lobo temporal medial, em
particular do hipocampo, é essencial para adquirir, manter e expressar as memórias
de reconhecimento (Alvarez et al., 1995; Meunier et al., 1996; Scoville e Milner,
1957). Em concordância com esses achados, estudos farmacológicos demonstraram
que a consolidação da memória de reconhecimento requer síntese protéica e
atividade de diferentes cascatas de sinalização em diferentes estruturas do lobo
temporal, além de neurogênese no giro denteado hipocampal (Kelly et al., 2003;
Akirav e Maroun, 2005; Jessberger et al., 2009; Rossato et al., 2007).
A tarefa de reconhecimento de objetos foi desenvolvida para acessar a
memória de reconhecimento em roedores, de forma análoga aos testes psicológicos
realizados em humanos (Reed e Squire, 1997). Ela baseia-se na atração natural
desses animais pela novidade, que passam mais tempo explorando o objeto
identificado como novo (Ennaceur e Delacour, 1988). Com esse teste se torna
possível avaliar os diferentes processos mnemônicos das memórias de
reconhecimentos enquanto se executa as diferentes intervenções experimentais.
13
1.2 O Sistema Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOPCom a clonagem dos receptores opióides kappa, mu e delta, um quarto
receptor foi clonado por homologia aos receptores opióides, sendo também um
receptor acoplado à proteína G, com estrutura e sequência de aminoácidos muito
semelhante aos demais receptores opióides. Por esta alta homologia, diversos
grupos o descobriram e o denominaram quase simultaneamente (Mollereau et al.,
1994; Bunzow et al., 1994; Fukuda et al., 1994; Wang et al., 1994; Pan et al., 1995).
Entretanto, apesar de sua semelhança, esse receptor não era ativado nem ligava-se
aos ligantes opióides padrão, pois apresentava o aminoácido fenilalanina no lugar do
aminoácido tirosina, que inviabiliza essa ligação, sendo considerado um receptor
órfão (Lachowicz et al., 2002; Donica et al., 2013). Posteriormente foi
convencionalmente denominado receptor NOP (nociceptin opioid peptide) pela
descoberta de seu ligante nociceptina (Cox et al., 2014).
A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um neuropeptídeo de 17 aminoácidos
(FGGFTGARKSARKLANQ) que foi isolado pela primeira vez em 1995, em cérebros
de ratos e porcos, por técnicas pioneiras de farmacologia reversa, que permitiu
identificar pela primeira vez um ligante posteriormente à descoberta do receptor
(Civelli et al., 2013). Esse composto foi denominado diferentemente por dois grupos
de pesquisa diferentes. Meunier e colaboradores (1995) denominaram o composto
de nociceptina, devido ao efeito hiperalgésico evocado pela administração
supraespinal em camundongos expostos ao teste de placa quente e ao teste de
retirada da cauda. Enquanto que Reinscheid e colaboradores (1995) denominaram o
composto de orfanina FQ, devido ao fato de que este se ligava a um receptor
anteriormente órfão e por conter os aminoácidos fenilalanina e glicina nas suas
extremidades amino e carboxi terminal, respectivamente. Apesar da estreita
semelhança com os opióides endógenos, a N/OFQ não apresenta afinidade pelos
receptores opióides clássicos, sendo específico do receptor NOP (Cox et al., 2000;
Toll et al., 2016). Uma visualização da estrutura tridimensional pode ser observado
na Figura 1.2.1.
14
Figura 1.2.1: Modelagem molecular do complexo N/OFQ-NOP. Peptídeo N/OFQ (1-13) estão
representados como os bastões verdes centrais, interagindo com diferentes alças da estrutura
quaternária do receptor NOP, em seu estado ativo (Autoria: Toll et al., 2016).
Como dito anteriormente, em sua sinalização canônica, o receptor NOP é um
receptor acoplado à proteína G (GPCR), do tipo Gi/o, sendo assim a sua ativação
ocasiona a redução da formação de AMPc, bloqueia canais de Ca2+ e estimula a
condutância do K+ (Connor e Henderson, 1996; Vaughan e Christie, 1996; Wu et al.,
1997). Portanto, a sinalização mediada pela ativação do receptor NOP induz efeitos
inibitórios, causando redução da neurotransmissão (Schlicker e Morari, 2000) e/ou
inibição do disparo neuronal (Heinricher, 2003). Além disso, a ativação do receptor
NOP por N/OFQ aumenta os níveis de quinases reguladas por sinal extracelular
(ERK) e de quinases c-Jun N-terminal (JNK) fosforiladas (Lou et al., 1998; Zhang et
al., 1999; Chan e Wong, 2000; Zhang et al., 2012a), estas são responsáveis por
respostas celulares ao estresse ambiental e modulação de fatores de crescimento,
sugerindo que o receptor NOP pode ter papel nesses processos.
Entretanto, existe um outro caminho de sinalização do receptor NOP.
Semelhante aos demais receptores opióides, as GPCRs acoplam-se às vias das
proteínas quinase A e C (PKA e PKC, respectivamente), além de proteínas quinases
15
ativadas por mitógenos (MAPK) (Bruchas e Chavkin, 2010; Whalen et al., 2011;
Chang e Bruchas , 2013). Dessa forma, a inibição desse receptor pode não
representar simplesmente um estado inativo, mas recrutar diversas cascatas
alternativas via MAPKs, como de dessensibilização via GRK3 e GRK2, na mediação
da sinalização de citocinas inflamatórias e agindo na sinalização da arrestina que
podem iniciar a sinalização a jusante para as vias JNK e ROCK (Al-Hasani e
Bruchas, 2011; Mittal et al., 2013). A Figura 1.2.2 representa graficamente um
resumo das diferentes vias de sinalização do receptor NOP.
Figura 1.2.2: Resumo da sinalização do receptor NOP. Note o caráter modulatório nos diferentes
canais iônicos em seu estado ativado pela N/OFQ, agindo diretamente no potencial de membrana
celular, e no seu estado inativo modula principalmente a fisiologia da célula via cascatas de
sinalização por diferentes quinases (Autoria: Toll et al., 2016)
Esse sistema N/OFQ - NOP está expresso em uma boa parte das regiões que
os receptores opióides padrão estão. No sistema nervoso periférico está distribuída
principalmente nos cornos dorsal e ventral da medula espinhal e nos corpos
celulares dos gânglios da raiz dorsal, no sistema nervoso central encontram-se
vastamente expressos, sendo particularmente abundantes em áreas corticais e
límbicas (hipocampo, giro denteado, áreas septais e amígdala), em núcleos
hipotalâmicos e do tronco encefálico (Boom et al., 1999; Neal et al., 1999). Além do
mais, o receptor NOP também se encontra expresso em núcleos serotoninérgicos,
noradrenérgicos e dopaminérgicos, tais como núcleo da rafe, locus ceruleus, núcleo
do trato solitário, área tegmental ventral e substância negra (Mollereau e Mouledous,
2000).
16
Baseado nesse padrão de expressão e pelo seu caráter inibitório, pode-se
postular que a ativação do sistema N/OFQ - NOP é capaz de modular diferentes
funções cognitivas e comportamentais (Lambert, 2008). De fato a bibliografia mostra
que os receptores NOPs estão envolvidos em diversos processos cerebrais, como
percepção de dor, aprendizado, memória, estados emocionais, ingestão alimentar e
controle motor (Meunier et al., 1995; Reinscheid et al., 1995; Sandin et al., 1997;
Jenck et al., 1997; Murphy et al., 1999; Polidori et al., 2000; Sandin et al., 2004).
A nível perceptual e comportamental, o papel da N/OFQ no sistema opióide e
na nocicepção foi a primeira ação investigada, mostrando que o efeito depende da
dose e da via de administração e é específico sobre o receptor NOP (Calo et al.,
2000; Calo et al., 2002; Erb et al., 1997; Hao et al., 1998; Kamei et al., 1999; King et
al., 1997; Yamamoto et al., 1997). No entanto a ativação intensa deste sistema,
causada por concentrações ou dosagens mais elevadas, causa prejuízos sobre a
atividade locomotora espontânea em roedores (Devine et al., 1996; Noble e Roques,
1997; Reinscheid et al., 1995), Neste sentido, os antagonistas do receptor NOP
facilitam a coordenação motora e atenuam déficits motores em modelos de
Parkinson em roedores e primatas não humanos (Mabrouk et al., 2010; Marti et al.,
2004; Marti et al., 2005; Viaro et al., 2008; Volta et al., 2010).
A nível de expressão emocional, existem indícios que o sistema N/OFQ -
NOP é um modulador importante em transtornos como ansiedade e depressão. Um
crescente corpo de evidências sugere que o sistema N/OFQ - NOP desempenha
papéis opostos na modulação da ansiedade e dos transtornos do humor. De fato, a
ativação da sinalização do receptor NOP evoca consistentemente efeitos do tipo
ansiolítico, enquanto seu bloqueio causa ações do tipo antidepressivo (Gavioli et al.,
2019; Gavioli et al., 2003, 2004; Gavioli e CALO, 2006; Lu et al., 2010; Post et al.,
2015; Redrobe et al., 2002; Rizzi et al., 2007; Uchiyama et al., 2008; Varty et al.,
2005; Vitale et al., 2009; Witkin et al., 2016). Importantemente, a injeção
intracerebroventricular (icv) de N/OFQ não induz nenhuma modificação
comportamental em camundongos submetidos a testes comportamentais de
desespero, mas reverte o efeito do tipo antidepressivo dos antagonistas dos
receptores NOP (Gavioli et al., 2003, Gaviolli et al., 2004; Gavioli e Calo, 2006;
Redrobe et al., 2002; Rizzi et al., 2007).
17
1.3 O Sistema N/OFQ – NOP e memória
O sistema N/OFQ - NOP apresenta uma distribuição tão ampla no cérebro
que seus efeitos sobre a memória são provavelmente mediadospor uma
multiplicidade de mecanismos envolvendo muitas regiões como o hipocampo, a
amígdala, o córtex pré-frontal e núcleos aminérgicos (Gavioli e Calo, 2013;
Mollereau e Mouledous, 2000; Witkin et al., 2014). Os primeiros estudos de memória
envolvendo esse sistema foram realizados em ratos e focaram na memória espacial,
mostrando que a administração intra-CA3 (hipocampo) de 10 nmol bloqueia a
aquisição dessa memória (Mamiya et al., 1998; Sandin et al., 1997). No entanto,
estudos posteriores mostraram que essa dose prejudica o comportamento motor, o
que pode ser considerado um confundidor em relação à interpretação correta dos
dados (Devine et al., 1996; Noble e Roques, 1997; Reinscheid et al., 1995).
Outros tipos de memória, como é o caso da memória de medo condicionado
ao contexto, também dependente de hipocampo, são afetadas pela administração
intracerebral ou icv do peptídeo N/OFQ, com doses que variam de 1 a 2.5 nmol em
ratos (Fornari et al., 2008; Goeldner et al., 2009). Na maioria dos estudos
executados, os tratamentos com agonistas NOP são realizados antes do
aprendizado, o que dificulta o entendimento de qual fase do processamento
mnemônico, codificação, consolidação ou ambas, está sendo afetada. Mais ainda,
paradigmas comportamentais, como o labirinto aquático de Morris, envolvem
múltiplos dias de treino, criando mais confundidores (Sandin et al., 2004; Fornari et
al., 2008; Higgins et al., 2002; Hiramatsu e Inoue, 1999; Kuzmin et al., 2009; Mamiya
et al., 2003; Redrobe et al., 2000; Roozendaal et al., 2007).
Um conjunto de dados utilizando camundongos nocaute (KO) para receptores
NOP sugere que os efeitos amnésicos produzidos pela administração de agonistas
do receptor NOP, e/ou a liberação de N/OFQ endógena poderiam inibir os processos
de aprendizagem e memória. Diferentes grupos relataram que a exclusão do
receptor NOP em camundongos transgênicos aumenta a LTP dependente do
receptor NMDA no hipocampo e melhora o desempenho em testes de memória que
são altamente dependentes do funcionamento do hipocampo, como o labirinto
aquático de Morris (Mamiya et al., 1998; Manabe et al., 1998; Taverna et al., 2005).
18
2. JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos, a associação entre o sistema N/OFQ - NOP e as funções
de memória ganhou interesse considerável. Apesar dos esforços na tentativa de
explicar como as funções cognitivas são afetadas, ainda não é claro como esse
sistema altera as memórias, e muito pouco se sabe sobre que fase do
processamento mnemônico está sendo afetado. A utilização de uma tarefa de
sessão única, permite essa diferenciação das fases do processamento mnemônico.
Esse trabalho é de particular importância uma vez que estuda um modelo de
memória declarativa dependente de hipocampo, região encefálica particularmente
enriquecida por receptores NOP e bastante envolvida nos transtornos de humor e
ansiedade, alvos proeminentes do estudo do sistema N/OFQ - NOP.
Este trabalho de conclusão de curso compreende as primeiras etapas desse
estudo, através da elucidação da dose de infusão intrahipocampal necessária para
que o receptor NOP module a formação de novas memórias de reconhecimento em
ratos, sem que efeitos inespecíficos sejam gerados, como alterações no
comportamento ambulatório dos animais e estados emocionais.
19
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo central
Avaliar a participação do sistema N/OFQ – NOP no processamento da
memória de reconhecimento de objetos.
3.2 Objetivos específicos
● Avaliar se a ativação do receptor NOP, utilizando uma curva dose-resposta de
N/OFQ, afeta a codificação da memória de reconhecimento de objetos.
● Avaliar se a ativação do receptor NOP, utilizando uma curva dose-resposta de
N/OFQ, afeta a consolidação da memória de reconhecimento de objetos.
● Avaliar se a ativação do receptor NOP, utilizando uma curva dose-resposta de
N/OFQ, produz alterações comportamentais diversas, como alterações no
comportamento ambulatório e exploratório dos animais.
20
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais experimentais
Trata-se de um estudo quantitativo com desenho de pesquisa do tipo
experimental com a utilização de ratos como modelo experimental. Foram utilizados
116 ratos machos adultos da linhagem Wistar. Todo o estudo foi realizado no
Laboratório de Pesquisas da Memória do Instituto do Cérebro (ICe) da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) localizado em Natal, Rio Grande do Norte.
Os animais foram tratados conforme a Lei número 6638 de 8 de maio de 1979 que
regulamenta o uso de animais para prática didático-científica. Eles receberam ração
e água ad libitum e permaneceram em ciclo de 12h claro/escuro, tendo a
temperatura controlada (21°C). Os animais foram mantidos em suas caixas moradia,
5 animais/caixa (caixa padrão de polisulfona 49 x 34 x 16 cm), em um mini-isolador,
com 60 trocas de ar por hora (Alesco®, Ltda., Monte Mor - São Paulo - Brasil). O
protocolo experimental foi desenvolvido de acordo com as diretrizes da Lei AROUCA
(Lei número 11.794, de 08 de outubro de 2008), que estabelece procedimentos para
uso científico de animais, sendo submetido à Comissão de Ética no Uso de
Animais/UFRN para avaliação.
4.2 Procedimentos cirúrgicos
Os animais foram anestesiados por administração i.p. de cloridrato de
ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e posteriormente submetidos à cirurgia
estereotáxica para implantação bilateral de cânulas na região CA1 do hipocampo
dorsal (AP - 4,2; ML ± 3,0; DV - 2,0), coordenadas estereotáxicas em mm (Paxinos e
Watson, 2006). Também foram inseridos parafusos que auxiliam na fixação
mecânica das cânulas. A associação de ketamina + xilazina possui efeito anestésico
de leve a moderado. As cirurgias para implantação de cânulas no hipocampo duram
em média 25-30 min, o que possibilita o uso dessa combinação anestésica. Os
animais receberam meloxicam (2 mg/kg, s.c.) como analgésico e antinflamatório
imediatamente antes da cirurgia e nos três dias subsequentes. Os animais foram
mantidos nas suas gaiolas moradia originais e os experimentos começaram 7 a 10
dias após a cirurgia.
21
4.3 Procedimentos comportamentais:
4.3.1 Tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON)
Quando roedores são apresentados a objetos familiares e novos, eles
despendem um tempo maior explorando o objeto novo. Este comportamento típico
tem sido utilizado no desenho de um paradigma comportamental conhecido como
tarefa de reconhecimento de objetos (Antunes e Biala, 2011), o qual vem sendo
amplamente utilizado para avaliar os mecanismos envolvidos na formação de
memórias declarativas (Reed e Squire, 1997; Moses et al., 2005). O aparato para
estudar o reconhecimento de objetos consiste de um campo aberto de 60 x 60 x 60
cm, localizado em uma sala com baixa luminosidade e isolamento acústico. Os
objetos-estímulo utilizados na tarefa de reconhecimento de objetos não possuem
significância comportamental para os animais experimentais. Durante a tarefa
comportamental, analisamos a exploração dos objetos pelos animais, o que é
definido como cheirar ou tocar os objetos-estímulo com o focinho ou patas
dianteiras. Usamos a ferramenta computacional TopScan Lite para gravar vídeos dos
experimentos bem como fazer o cálculo do tempo de exploração dos objetos.
Antes de serem submetidos ao protocolo de treino, os animais passaram por
um processo de habituação ao aparato comportamental que consistiu em uma
sessão diária de vinte minutos por quatro dias. Nesta sessão os animais foram
colocados individualmente no campo aberto para que o explorassem livremente. Na
sessão de treino os animais foram colocados no campo aberto na presença de dois
objetos iguais, por 5 minutos. A sessão de teste, realizada um dia mais tarde,
consistiu na re-exposição dos animais ao campo aberto na presença de um objeto
familiar (apresentado na sessão de treino) junto a um objeto novo, por 5 minutos
(Rossato et al., 2022).
Para avaliar o aprendizado e comparar os diferentes tratamentos foi utilizadoo índice de discriminação. Os animais que não atingiram o critério de exploração,
definido como no mínimo 10 s de exploração para cada objeto, foram excluídos das
análises estatísticas. Nesse cálculo, valores positivos indicam exploração diferencial
pelo objeto novo.
𝐼𝐷 = 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑜𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑏𝑗. 𝑛𝑜𝑣𝑜 − 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑜𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑏𝑗. 𝑓𝑎𝑚𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟
𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑜𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑏𝑗. 𝑛𝑜𝑣𝑜 + 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑜𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑏𝑗. 𝑓𝑎𝑚𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟 
22
4.3.2 Tarefa do campo aberto
Para avaliar a influência da cirurgia e dos tratamentos na atividade locomotora
e/ou comportamento exploratório de animais, utilizou-se a tarefa denominada de
campo aberto. O aparelho utilizado para esta tarefa consiste em uma caixa de
madeira (60 X 60 X 60 cm). O assoalho da caixa foi dividido conceitualmente em
duas regiões, bordas e centro (28 X 28 cm). Durante o experimento, o animal foi
colocado no aparato para que o explorasse livremente por 5 minutos, durante os
quais se registrou distância percorrida e velocidade, comportamentos nos roedores
que denotam atividade locomotora e exploratória. Para avaliar o estado de
ansiedade dos animais nesta tarefa, se avaliou o tempo que o animal despende se
locomovendo no centro e nas bordas do campo aberto, bem como o número de
visitas ao centro. Quanto mais ansioso estiver o animal, menor o tempo de
permanência no centro do aparato comportamental.
4.4 Infusão de drogas
Nos experimentos farmacológicos/comportamentais, os animais receberam
microinjeções bilaterais através de cânulas posicionadas na região CA1 do
hipocampo dorsal mediante cirurgia estereotáxica. Os fármacos foram administrados
no volume de 1 μL/lado, das seguintes drogas e concentrações:
- Peptídeo nociceptina/orfanina (N/OFQ; 0.1; 0.3 e 1 nmol/lado).
- Solução veículo (VEH, NaCl 0.9 %).
Todas as doses das drogas utilizadas foram baseadas em estudos prévios
(Duzzioni et al., 2011; Asth et al., 2015). As drogas foram diluídas, aliquotadas e
armazenadas em Freezer -20°C até a realização dos experimentos, quando foram
diluídas na concentração de uso e infundidas. A infusão da droga/veículo foi
realizada por meio de uma agulha gengival conectada a uma microseringa Hamilton
(Hamilton Company®, USA). A agulha gengival foi acoplada à cânula de infusão
permitindo que a droga/veículo seja administrada na região de estudo. A velocidade
de infusão foi controlada por uma bomba de infusão (Insight) que permite controlar o
volume e a velocidade da infusão (0,25 μL/min). Ao término de cada infusão, a
agulha foi mantida no local por 30 segundos para evitar refluxo.
23
Para a verificação do posicionamento das cânulas, ao final dos experimentos
comportamentais, os animais foram perfundidos com PBS 0.1 M seguido por solução
PFA 4%, após tiveram os cérebros removidos e mantidos em solução PFA 4%
overnight e após solução de glicose 30% por aproximadamente 3 dias.
Posteriormente, secções coronais de 50 µm de espessura foram obtidas utilizando
um equipamento criostato, seguido da montagem das lâminas e coloração Nissl.
Visões gerais das secções foram fotodocumentadas em mosaico em microscopia de
campo claro em objetiva de 10X no microscópio Stereo Investigator (Zeiss Imager
M.2 ApoTome 2).
4.5 Análise estatística dos dados
A análise estatística dos resultados foi realizada usando o programa
GraphPad Prism. Para comparações cuja distribuição de dados obedece uma
distribuição normal, foi empregado o Teste T de Student para amostra única (valor
fixo=0 para o ID e valor fixo=50 para % Exploração total). Para comparações entre
dois grupos usamos o teste-t de Student, e para comparações entre três ou mais
grupos, foi empregada ANOVA de uma via seguida de teste de Bonferroni.
24
5 RESULTADOS
5.1 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, afeta a
codificação da memória de reconhecimento de objetos
No primeiro experimento deste trabalho, avaliamos se o receptor NOP gera
prejuízos mnemônicos na medida que seu caráter inibitório impediria os mecanismos
que geram a codificação inicial do engrama (Higgins et al., 2002; Yu et al., 1997).
Desta forma, realizamos a intervenção farmacológica antes da sessão de treino,
onde os animais receberam infusão intrahipocampal de veículo (VEH, NaCl 0.9 %)
ou N/-OFQ em diferentes doses (0.1; 0.3 e 1 nmol/lado) e vinte minutos depois foram
treinados na tarefa de reconhecimento de objetos na presença de dois objetos
iguais. Para avaliar a retenção da MRO, um dia mais tarde, os animais foram
reapresentados a um dos objetos familiares e a um objeto novo (protocolo na Figura
5.1.1-A). A confirmação da localização da cânula na região hipocampal está
representada na Figura 5.1.1-B.
Inicialmente analisamos o tempo de exploração de cada objeto para cada dia
experimental e tratamento. Os animais que receberam veículo discriminaram o
objeto novo do objeto familiar durante a sessão de teste, assim como na menor dose
de 0.1 nmol/lado de N/OFQ (Figura 5.1.1-C painel superior: VEH, t(9) = 6.842, p <
0.001; Figura 5.1.1-D painel superior: 0.1 nmol, t(8) = 5.21 p < 0.001; Teste T de
amostra única comparado com 50). No entanto, os animais que receberam as doses
de 0.3 ou 1 nmol/lado de N/OFQ 20 minutos antes do treinamento, foram incapazes
de discriminar entre os objetos familiar e novo na sessão de teste realizado 1 dia
mais tarde (Figura 5.1.1-E painel superior: 0.3 nmol, t(9) = 1.021, p = 0.3337; Figura
5.1.1-F painel superior: 1 nmol, t(7) = 1.15, p = 0.2879; Teste T de amostra única
comparado com 50).
Durante a sessão de treino, nenhum dos grupos apresentou número de
eventos de exploração diferencial entre os objetos. Entretanto, no dia do teste, os
eventos de exploração direcionados ao objeto novo são maiores nos animais
controle (VEH) e nos animais que receberam 0.1 nmol/lado de N/OFQ antes do
treino (Figura 5.1.1-C painéis inferiores: VEH, t(9) = 3.085, p = 0.013; Figura 5.1.1-D
painéis inferiores: 0.1 nmol, t(8) = 3.00, p = 0.0171; em um Teste t pareado), no
entanto essa variável não é alterada nos animais que receberam 0.3 ou 1 nmol/lado
25
de N/OFQ 20 minutos antes do treino (Figura 5.1.1-E painéis inferiores: 0.3 nmol,
t(9) = 0.239, p = 0.8166; Figura 5.1.1-F painéis inferiores: 1 nmol, t(7) = 0.2647, p =
0.799; em um Teste t pareado).
Para uma análise comparativa entre os grupos usamos a variável índice de
discriminação como inferência de aprendizado (Figura 5.1.1-G). Podemos observar,
que os animais que recebem as doses mais alta de N/OFQ (0.3 e 1 nmol/lado) não
discriminam o objeto familiar do novo e (VEH: t(9) = 6.946, p < 0.001; 0.1: t(8) =
5.173, p < 0.001; 0.3: t(9) = 1.01, p = 0.339; 1.0: t(7) = 0.5384, p = 0.607, em um
teste T de amostra única comparado com 0), na análise comparativa o grupo com a
dose maior é diferente dos grupos VEH e 0.1 nmol de N/OFQ (F(3,33) = 5.741, p =
0.0028, ANOVA de uma via; p > 0.999 para VEH vs N/OFQ 0.1 nmol, p = 0.0571
para VEH vs N/OFQ 0.3 nmol, p = 0.0261 para VEH vs N/OFQ 1 nmol, no teste de
Bonferroni de comparações múltiplas).
Ao avaliar o comportamento ambulatório, verificamos que as diferentes doses
não prejudicaram a distância percorrida (Figura 5.1.2-A; F(3,33) = 0.6899, p =
0.5647 para a sessão do treino; F(3,33) = 0.080, p = 0.9703 para a sessão de teste,
ANOVA de uma via para o tratamento).
Bem como não alterou a velocidade média de cada minuto da sessão de
treino (Figura 5.1.2-B painel da esquerda; F(3,34) = 1.246, p = 0.3084 para o 1°
minuto; F(3,34) = 0.3393, p = 0.797 para o 2° minuto; F(3,34) = 0.2672, p = 0.8485
para o 3° minuto; F(3,34) = 0.3067, p = 0.8203 para o 4° minuto; F(3,34) = 1.076, p =
0.3724 para o 5° minuto; ANOVA de uma via), e no dia teste (Figura 5.1.2-B painel
da direita; F(3,34) = 0.01378, p = 0.9977 para o 1° minuto; F(3,34) = 0.1113, p =
0.9529 para o 2° minuto; F(3,34) = 0.662, p = 0.5811 para o 3° minuto; F(3,34) =
1.502, p = 0.2316 para o 4° minuto; F(3,34)= 0.8508, p = 0.4759 para o 5° minuto;
ANOVA de uma via).
É importante salientar que no dia do treino, não foi observado preferências
intrínsecas dos animais por um dos objetos ou por um dos lados da caixa
experimental. A Tabela 5.1 mostra uma descrição detalhada dos valores exploração
e índice de discriminação para o treino.
26
Figura 5.1.1: A ativação do receptor NOP prejudica a codificação da memória de reconhecimento de
objetos. A: Protocolo experimental: os animais receberam infusão de veículo (VEH) ou diferentes doses de
N/OFQ (0.1; 0.3 ou 1 nmol/lado) vinte minutos antes do treino (TR) realizado na presença de dois objetos iguais A
e A’. 24 horas mais tarde os animais foram testados (TT) na presença de um objeto familiar A e um objeto novo B.
B: Histologia confirmando localização da cânula 1 mm acima do hipocampo. C-F: Painéis superiores:
Porcentagem de tempo de exploração aos objetos durante o treino (TR) e teste (TT); Painéis inferiores: número
de eventos de exploração dos objetos para cada sessão experimental, seguida da representação da diferença de
eventos de exploração para o objeto novo - o familiar. G: Índice de discriminação dos diferentes tratamentos na
seção de teste. Os dados são apresentados como média ± EPM, n = 8-10 animais por grupo. As linhas
pontilhadas marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de Student com média teórica = 0. *p<0.05 em
uma ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. ObjB-ObjA: *p<0.05,
**p<0.01 em um teste t pareado. Fonte: Autoria própria.
27
Figura 5.1.2: A infusão de N/OFQ antes do treino não altera os comportamentos exploratórios e
ambulatórios. Análise do comportamento ambulatório dos animais que receberam veículo ou
diferentes doses de N/OFQ antes do treino na tarefa de reconhecimento de objetos. A: Distância total
percorrida dada em metros para a sessão de treino (esquerda) e teste (direita). B: Velocidade média
em cm/s para cada minuto nas sessões de treino (esquerda) e teste (direita). Os dados são
apresentados como média ± EPM, n = 8-10 animais por grupo. Fonte: Autoria própria.
Tempo de exploração do objeto (s)
Par de objetos Objeto 1 Objeto 2 Total ID p n
A-A' 27.49 ± 3.99 26.59 ± 2.68 54.08 ± 4.98 -0.008 ± 0.064 0.896 13
B-B' 26.64 ± 3.53 24.65 ± 3.31 51.28 ± 6.37 -0.053 ± 0.043 0.246 12
C-C' 30.69 ± 2.17 27.34 ± 2.40 58.03 ± 4.22 -0.052 ± 0.033 0.234 13
Tabela 5.1: Exploração em segundos durante a sessão de treino para o experimento com
administração farmacológica pré-treino. Os dados apresentados representam a média da exploração
dos distintos objetos durante o treino na TRON. Os dados estão apresentados como média da
exploração dos objetos e ID (índice de discriminação) para os pares utilizados; p em um teste t de
Student com média teórica igual a zero. A exploração total não difere nos distintos pares de objetos
utilizados para o treino, F(2,34) = 0.4227, p = 0.6587 em ANOVA de uma via. Fonte: Autoria própria.
28
5.2 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, não
afeta a consolidação da memória de reconhecimento de objetos
No trabalho de Fornari et al. (2008), os autores realizaram experimentos com
memórias de medo utilizando a administração de diferentes doses de N/OFQ
intracerebroventricular antes da sessão de exposição ao evento aversivo, os
achados desses experimentos mostram que a ativação do receptor NOP prejudica a
formação desses tipos de memória. Semelhante a esse achado, Goeldner et al.
(2009) delineou um experimento utilizando outros agonistas não peptídicos do
receptor NOP no paradigma clássico de condicionamento ao medo, mostrando que a
atividade desse receptor diminuiu os escores de imobilidade pós-choque ainda na
sessão de treino.
Esse achado levantam a hipótese que, pelo caráter inibitório neuronal gerado
pela atividade do receptor NOP, a ativação dessa via pode estar prejudicando a
codificação inicial do engrama, alterando a percepção ou a valência do estímulo
aversivo, gerando o prejuízo observado na seção de teste, sem interferir diretamente
nos processos de armazenamento dessas memórias (Fornari et al., 2008; Goeldner
et al., 2009).
Para colocar a prova se o prejuízo causado pela administração
intrahipocampal de N/OFQ antes do treino na TRON ocorreria por sua influência na
codificação e não no armazenamento da memória, a configuração do segundo
experimento deste trabalho foi desenhada de modo a permitir a codificação inicial do
engrama, sendo a interferência farmacológica realizada imediatamente após a
sessão de treino.
No treino (TR) os animais foram apresentados a dois objetos iguais e,
imediatamente após receberam administração de veículo (NaCl 0.9 %) ou N/OFQ
em diferentes doses (0.1; 0.3 e 1 nmol/lado). No dia seguinte, os animais foram
re-apresentados a um dos objetos familiares e a um objeto novo (protocolo na
Figura 5.2.1-A). A confirmação da posição da cânula imediatamente acima da
região de interesse está representada na Figura 5.2.1-B.
Avaliamos a porcentagem de tempo de exploração de cada objeto, para cada
sessão do experimento e tratamento realizado. Foram encontradas diferenças
29
significativas apenas no dia do teste, mostrando preferência de exploração do objeto
novo (Figura 5.2.1-C painel superior: veículo, t(11) = 5.93, p < 0.001; Figura 5.2.1-D
painel superior: 0.1 nmol, t(9) = 3.99. p < 0.01; Figura 5.2.1-E painel superior: 0.3
nmol, t(10) = 3.296, p < 0.01; Figura 5.2.1-F painel superior: 1 nmol, t(11) = 3.139, p
< 0.01; Teste T de amostra única comparado com 50).
Outro parâmetro analisado foi a quantidade de eventos de exploração, onde
observamos que, no dia do treino, não houve diferença na quantidade de eventos de
exploração entre os objetos, ocorrendo exploração diferencial no dia do teste, que
está representado também pela média na diferença entre o objeto novo e o familiar
(Figura 5.2.1-C painéis inferiores: veículo, t(11) = 3.588, p < 0.01; Figura 5.2.1-D
painéis inferiores: 0.1 nmol, t(9) = 3.849, p < 0.01; Figura 5.2.1-E painéis inferiores:
0.3 nmol, t(10) = 2.459, p < 0.05; Figura 5.2.1-F painéis inferiores: 1 nmol, t(11) =
2.51, p < 0.05; em um Teste T pareado).
Nossos resultados mostram que a N/OFQ, em nenhuma das doses
administradas, foi capaz de impedir a consolidação da MRO. Os animais exploram
diferencialmente o objeto novo se comparado ao familiar. É importante salientar que
no dia do treino, foi possível observar a inexistência de preferências intrínsecas dos
animais por um dos objetos apresentados. A Tabela 5.1.1 mostra uma descrição
detalhada dos valores de tempo de exploração e índice de discriminação para cada
par de objetos utilizado nesse experimento.
Para uma análise comparativa entre os diferentes tratamentos, foi utilizado os
índices de discriminação para inferir aprendizado, onde todos os tratamentos foram
capazes de discriminar o objeto familiar do novo (VEH: t(11) = 5.893, p < 0.001; 0.1:
t(9) = 3.957, p < 0.01; 0.3: t(10) = 3.322, p < 0.01; 1.0: t(11) = 3.136, p < 0.01, em um
teste T de amostra única comparado com 0), como demonstrado pela média dos
índice de discriminação assumindo valores positivos e sem diferença significativa
entre os tratamentos (Figura 5.2.1-G; F(3,41) = 0.8941, p = 0.4524, ANOVA de uma
via).
Como foi demonstrado em estudos anteriores que doses mais elevadas (10
nmol) intra-hipocampal prejudicam o comportamento motor (Mamiya et al., 1998;
Sandin et al., 1997), foram também analisados parâmetros acerca do
comportamento ambulatório dos animais. Em relação ao deslocamento total durante
30
os comportamentos analisados, não foram encontradas diferenças significativas
entre os diferentes tratamentos (Figura 5.2.2-A; F(3,41) = 0.5818, p = 0.6303, para a
sessão de treino; F(3,41) = 1.885, p = 0.1472, para a sessão de teste; ANOVA de
uma via).
Também foi avaliada a velocidade média dos animais a cada minuto de
exploração, também não sendo encontrada diferença significativa entre os diferentes
tratamentosno dia do treino (Figura 5.2.2-B painel da esquerda; F(3,41) = 0.8678, p
= 0.4655 para o 1° minuto; F(3,41) = 0.6586, p = 0.5823 para o 2° minuto; F(3,41) =
0.259, p = 0.8545 para o 3° minuto; F(3,41) = 1.048, p = 0.3815 para o 4° minuto;
F(3,41) = 0.5222, p = 0.6695 para o 5° minuto; ANOVA de uma via), e também não
para o dia teste (Figura 5.2.2-B painel da direita; F(3,41) = 1.773, p = 0.1673 para o
1° minuto; F(3,41) = 2.097, p = 0.1154 para o 2° minuto; F(3,41) = 1.571, p = 0.211
para o 3° minuto; F(3,41) = 1.163, p = 0.3354 para o 4° minuto; F(3,41) = 0.9473, p =
0.4267 para o 5° minuto; ANOVA de uma via).
Tempo de exploração do objeto (s)
Par de objetos Objeto 1 Objeto 2 Total ID p n
A-A' 28.59 ± 3.17 27.14 ± 2.41 55.72 ± 5.44 -0.016 ±0.027 0.573 10
B-B' 27.12 ± 2.8 27.37 ± 2.95 54.48 ± 5.53 0.004 ± 0.03 0.906 8
C-C' 32.11 ± 2.7 29.81 ± 2.61 61.91 ± 5.03 -0.042 ± 0.026 0.136 10
I-I' 26.79 ± 3.84 25.93 ± 4.44 52.71 ± 8.01 -0.022 ± 0.037 0.588 6
P-P' 24.13 ± 1.8 25 ± 4.05 49.13 ± 5.54 0.005 ± 0.058 0.937 4
R-R' 19.72 ± 1.59 22.5 ± 1.94 42.22 ± 3.22 0.061 ± 0.037 0.134 9
Tabela 5.2: Exploração em segundos durante a sessão de treino para o experimento com
administração farmacológica pós-treino. Os dados apresentados representam a média da exploração
dos distintos objetos durante o treino na TRON. Os dados estão apresentados como média da
exploração dos objetos e ID (índice de discriminação) para os pares utilizados; p em um teste t de
Student com média teórica igual a zero. A exploração total não difere nos distintos pares de objetos
utilizados para o treino, F(5,41) = 1.295, p = 0.2848 em ANOVA de uma via. Fonte: Autoria própria.
31
Figura 5.2.1: A ativação do receptor NOP não afeta a consolidação da memória de reconhecimento de
objetos. A: Protocolo experimental: os animais foram treinados (TR) na presença de dois objetos iguais A e A´ e
imediatamente após receberam infusão de veículo (VEH; 0.9 % solução salina) ou diferentes doses de N/OFQ
(0.1; 0.3 ou 1 nmol/lado). Vinte quatro horas mais tarde os animais foram testados (TT) na presença de um objeto
familiar A e um objeto novo B. B: Histologia confirmando localização da cânula 1 mm acima do hipocampo. C-F:
Painéis superiores: Porcentagem de tempo de exploração aos objetos durante o treino (TR) e teste (TT); Painéis
inferiores: número de eventos de exploração dos objetos para TR e TT, seguida da representação da média da
diferença de eventos de exploração para o objeto novo - objeto familiar. G: Índice de discriminação dos diferentes
tratamentos na seção de teste. Os dados são apresentados como média ± EPM, n = 10-12 animais por grupo. As
linhas pontilhadas marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de Student com média teórica = 0. *p<0.05,
**p<0.01 e ***p<0.001 em um teste t pareado ou um teste t de amostra única. Fonte: Autoria própria.
32
Figura 5.2.2: A infusão de N/OFQ após o treino não altera os comportamentos exploratórios e
ambulatórios. Análise do comportamento ambulatório dos animais que receberam veículo ou
diferentes doses de N/OFQ antes do treino na tarefa de reconhecimento de objetos. A: Distância total
percorrida dada em metros para a sessão de treino (esquerda) e teste (direita). B: Velocidade média
em cm/s para cada minuto nas sessões de treino (esquerda) e teste (direita). Os dados são
apresentados como média ± EPM, n = 10-12 animais por grupo. Fonte: Autoria própria.
5.3 A ativação do receptor NOP hipocampal, com o peptídeo N/OFQ, não
afeta a atividade exploratória e ambulatória espontânea no campo aberto
Para avaliar se a ativação do receptor NOP hipocampal afeta a atividade
exploratória e ambulatória espontânea, além de verificar se as doses apresentaram
algum efeito ansiogênico ou ansiolítico, os animais receberam infusão intra
hipocampal de VEH ou N/OFQ (01; 0.3 ou 1 namol/lado) e vinte minutos antes foram
submetidos a uma sessão de 5 minutos no campo aberto (Figura 5.3-A). O campo
aberto foi dividido em duas regiões, bordas e centro e, analisamos os seguintes
comportamentos: número de visitas ao centro; tempo gasto em cada uma das
regiões e distância percorrida em cada uma das regiões.
Nossos resultados indicam que os tratamentos utilizados não afetam os
parâmetros comportamentais analisados. O número de visitas ao centro do campo
33
aberto não difere nos distintos grupos experimentais (Figura 5.3-B; F(3,30) =
0.1347, p = 0.9386). O tempo de exploração nas bordas do campo aberto é maior
em todos os grupos (Figura 5.3-C; F(3,30) = 1.573, p = 0.2164) e a distância
percorrida pelos animais nas bordas do campo aberto não difere nos distintos
tratamentos (Figuras 5.3-D; F(3,30) = 0.7632, p = 0.5236). A Tabela 5.3.1 mostra os
dados detalhados.
Figura 5.3: Atividade exploratória e ambulatória espontânea. (A) Protocolo experimental. Os animais
receberam infusão intra-hipocampal de VEH (salina 0.9 %) ou diferentes doses de N/OFQ (0.1; 0.3 ou
1.0 nmol/lado). Vinte minutos após a infusão os animais foram submetidos ao teste de campo aberto.
(B) Número de visitas ao centro do campo aberto. (C) Tempo de exploração nas bordas do campo
aberto. Inset: tempo de exploração no centro do campo aberto. (D) Distância percorrida (cm) nas
bordas do campo aberto. Inset: distância percorrida no centro do campo aberto. (E) Trajetória
representativa para cada grupo experimental. n = 8-9 animais por grupo. Os dados são apresentados
como média ± EPM.
34
VEH 0.1 nmol 0.3 nmol 1 nmol ANOVA
Tempo nas
bordas 288.4 ± 1.98 280.5 ± 6.17 288.7 ± 1.45 289.2 ± 1.52 F(3,30)=1.573
Tempo no centro 6.46 ± 1.88 9.04 ± 3.04 6.68 ± 0.96 6.67 ± 1.29 F(3,30)=0.390
Distância nas
bordas (cm) 14.4 ± 2.30 17.07 ± 2.09 15.75 ± 1.99 19.2 ± 2.89 F(3,30)=0.763
Distância no
centro (cm) 0.80 ± 0.19 0.95 ± 0.22 1.02 ± 0.13 0.96 ± 0.18 F(3,30)=0.261
Velocidade
bordas (cm/s) 0.05 ± 0.008 0.06 ± 0.007 0.06 ± 0.007 0.07 ± 0.011 F(3,30)=0.719
Velocidade
centro (cm/s) 0.13 ± 0.022 0.13 ± 0.019 0.17 ± 0.017 0.16 ± 0.012 F(3,30)=1.104
N° de entradas
no centro
4.67 ± 1.08 5.12 ± 1.24 4.75 ± 0.77 5.44 ± 0.82 F(3,30)=0.135
Tabela 5.3: Atividade exploratória e ambulatória espontânea. Os parâmetros comportamentais
representam o tempo gasto nas bordas e no centro do campo aberto, distância percorrida e
velocidade nas bordas e no centro do campo aberto, bem como número de entradas no centro do
campo aberto. Os dados estão apresentados como média e EPM para todos os tratamentos e valor
de ANOVA para comparação entre os grupos na variável analisada. n = 8-9 animais por grupo.
35
6 DISCUSSÕES
O potencial uso terapêutico do sistema N/OFQ - NOP tem gerado uma
atenção considerável da comunidade científica. A ideia de utilizar um receptor
homólogo ao receptores opióides clássicos, que altera a nocicepção sem gerar
comportamento aditivo, tem feito deste um importante alvo para intervenções
farmacológicas (Preti, Caló e Guerrini, 2019; Zaveri e Meyer, 2019). Entretanto as
funções exatas desse sistema ainda não foram totalmente descobertas.
Estudos mostram que a atividade do receptor NOP modula a abertura e
fechamento de canais iônicos na membrana celular, estando associado a supressão
da atividade elétrica neuronal que, entre outros fatores, podem modular diversos
estados cognitivos e perceptuais (Meunier et al., 1995; Reinscheid et al., 1995;
Sandin et al., 1997; Jenck et al., 1997; Murphy et al., 1999; Polidori et al., 2000;
Sandin et al., 2004).
Alguns estudos já mostraram que a atividade no receptor NOP prejudica a
formação de diferentes tipos de memória, como espacial e de medo (Mamiya et al.,
1998; Sandin et al., 1997; Fornari et al., 2008; Goeldner et al., 2009). Porém estudos
envolvendo as memórias de reconhecimento ainda não foram elucidados. O
presente trabalho de conclusão compõe os primeiros passos rumo a esse estudo,
através do teste de diferentes doses para verificar a dose e a fase do processamento
mnemônico em que o receptor NOP hipocampal possa estar atuando.
Encontramos que a intervenção com asdoses maiores (0.3 e 1 nmol/lado),
quando administradas antes do treino, gerou prejuízos na formação da memória de
reconhecimento nos animais experimentais. Esse resultado demonstra que o
receptor NOP, por seu caráter inibitório, pode estar prejudicando os mecanismos
eletrofisiológicos pelos quais o hipocampo forma o engrama inicial do objeto a ser
recordado (Schlicker e Morari, 2000). Em conjunto com isso, tendo em vista que os
tempos de exploração não foram prejudicados pelos diferentes tratamentos,
podemos inferir que a atividade do receptor NOP não foi capaz de prejudicar os
estados atencionais nos animais, neste estudo.
Esse efeito amnésico não foi observado nos animais que receberam as
intervenções farmacológicas após o treino, mostrando que a atividade deste receptor
36
parece não ser importante para os processos consolidatórios da memória de
reconhecimento, tendo em vista que os animais foram capazes de manifestar
comportamentalmente a lembrança do objeto familiar, durante a sessão de teste.
De modo geral, por não alterar parâmetros inespecíficos, como o
deslocamento, velocidade média e permanência no centro da arena, podemos
afirmar que as doses utilizadas também não foram capazes de modificar a
motricidade e o comportamento tipo ansioso nos animais experimentais. Dessa
forma, confirmamos que os prejuízos observados são específicos do processo de
codificação, não ocorrendo em detrimento de alterações motoras ou do estado
emocional dos animais.
37
7 CONCLUSÕES
Esse trabalho demonstra que a ativação do receptor NOP pode alterar a
formação da memória de reconhecimento de objetos, na medida que prejudica a
formação do engrama inicial durante o estágio de codificação. Esse trabalho abre
espaço para que estudos mais robustos envolvendo a ação do receptor NOP
possam ser realizados, de modo que possa ser verificada sua ação em outros
processos das memórias de reconhecimento, como nos processos reconsolidatórios
e nas memórias de curta duração, além de sua ação em outros tipos de memória,
como memórias sociais, espaciais, procedimentais, entre outras. Além disso, será
necessário investigar por quais vias o receptor NOP atua, como exemplo a alteração
no perfil de expressão de proteínas ou modificação da atividade elétrica hipocampal.
38
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