cultura de haplóides e duplo-haplóides - aula teórica 7 - 2023

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Cultura de haplóides e duplo-
haplóides
Profa. Dra. Cláudia Roberta Damiani
Plantas haplóides
• Plantas cujos esporófitos apresentam o número gametofítico 
de cromossomos
Origem:
➢ Células haplóides - gametófitos.
➢ Gametófitos femininos - sacos 
embrionários (dentro do óvulo);
➢ Gametófitos masculinos - grãos 
de pólen (nas anteras). 
➢ Para a obtenção de plantas 
haplóides in vitro, os 
gametófitos masculinos são 
mais utilizados por serem 
superiores em número.
Processos que levam à produção de plantas haplóides
➢ Androgênese: Planta haplóide derivada de um gameta masculino
➢ Partenogênese: Planta derivada de um óvulo não fertilizado
➢ Apogamia: Planta obtida de outras células do megagametófito
➢ Eliminação cromossômica: Eliminação de um complemento cromossômico em 
células somáticas.
Métodos de obtenção de haplóides in vitro
• Hibridação interespecífica com posterior eliminação cromossômica;
• Cultura de óvulos não fertilizados – partenogênese in vitro (via ginogenética);
• Cultura de anteras, pólen ou micrósporos (via androgenética).
Hibridação interespecífica e eliminação 
cromossômica
• Processo melhor documentado em cereais;
• O mecanismo envolvido é pouco conhecido:
– Ocorre dupla fecundação e nas subsequentes divisões 
celulares ocorre a eliminação do parental masculino, 
formando o embrião haplóide;
• O endosperma também sofre eliminação de cromossomos e 
degeneração;
• Resgate do embrião haplóide por cultura in vitro.
Hibridação interespecífica e eliminação cromossômica ...
Método bulbosum – alta frequência de cevada haplóide.
• Na natureza, as sementes desse cruzamento se desenvolvem por 
aproximadamente 10 dias e depois abortam.
• Método frequentemente adotado.
Vantagens: 
– Técnicas envolvidas (emasculação, polinização e cultura de embriões) são 
de fácil execução;
– Não ocorre mortalidade por albinismo;
– Contudo, necessita sincronia do florescimento dos parentais e posterior 
duplicação cromossômica. 
• Técnica utilizada em:
– Trigo (Triticum aestivum), 
– Triticale (X Triticosecale) - híbrido obtido do cruzamento 
entre o trigo e centeio,
– Centeio (Secale cereale),
– Aveia (Avena spp).
• Espécies utilizadas na hibridação:
– Hordeum bulbosum, 
– Teosinte (Zea mays subsp. mexicana), 
– Sorgo (Sorghum bicolor), 
– Milheto (Pennisetum glaucum), 
– Milho (Zea mays).
• Atualmente o milho é o mais eficiente.
Hibridação interespecífica e eliminação cromossômica ...
Exemplo: cruzamentos 
intergenéricos de trigo e 
milho (polinizador)
Mostarda-preta
colza ou canola
Repolho
Mostarda-amarelaMostarda da abissínia
O Triângulo mostra como a hibridação e a 
poliploidia deram origem a novas espécies 
no gênero Brassica. Cromossomos de 
cada um dos genomas A, B e C são 
representados em diferentes cores. A 
figura mostra a origem das espécies 
AABB, AACC e BBCC, que têm 
cromossomos parentais AA, BB e CC
Nabo 
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCJS09KnO3cgCFYwPkAod3koHzQ&url=http://www.oshims.com/herb-directory/m/mustard&psig=AFQjCNE0cdnzniaDVcRb5k0bpD8QL52VMg&ust=1445862065596216
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/70/Cabbage.jpg
Como ocorre a eliminação somática (de 
cromossomos)
• Hibridação interespecífica seguida pela eliminação somática 
de cromossomos de um dos genomas.
• Eliminação de um complemento cromossômico por causa da 
falta de sincronização de ciclos mitóticos, anomalias no fuso 
mitótico, levando à inativação do genoma paterno.
• Dependente do sentido do cruzamento e dos genótipos dos 
genitores.
Como ocorre a eliminação cromossômica?
Mitose dependente:
- Assincronismo do ciclo mitótico
Mitose independente
- Formação do “broto” do núcleo
Etapas para a produção de plantas haplóides e duplo-haplóides e 
eliminação somática
Protocolo para Trigo:
1. O melhorista idealiza os cruzamentos de acordo com os seus objetivos;
2. As sementes provenientes de hibridações em F1 ou até F2, são semeadas 
em estufas, com temperatura, umidade e luminosidade controladas, até 
a emasculação das flores (2 – 3 dias antes da antese);
3. De 4 a 5 dias após emasculação é efetuada a polinização com pólen de 
milho;
4. 24 e 48 horas após a polinização, injeta-se 2,4-D (0,01 mg.L-1) no entre-nó 
mais próximo da espiga, para favorecer a formação do embrião;
5. De 9 a 14 dias após são resgatados os embriões imaturos em câmaras de 
fluxo laminar, sob condições assépticas;
Antese: ato da abertura das flores, quando um de seus órgãos sexuais (ou 
todos) amadurece e o perianto abre-se, iniciando o ciclo reprodutivo das 
flores.
6. Após a esterilização dos grãos e o resgate dos embriões imaturos, estes 
são transferidos para meio de cultura P2 (Chuang et al, 1978) até a 
obtenção de uma planta haplóide (cromossomos do milho eliminados na 
primeira divisão).
7. A planta é transferida para vasos com vermiculita e aclimatada em 
câmara de crescimento por 15 dias, para estimular o perfilhamento.
8. A duplicação do genoma é feita com solução de colchicina (0,25%) + 
dimetilsulfóxido - DMSO (2%) por 3 a 4 horas.
9. Posteriormente as plantas são transferidas para vasos contendo 
substrato orgânico. Os novos perfilhos tornam-se duplo-haplóides.
10. Após estas etapas ocorrerá a formação de grãos e obtenção de sementes 
duplo-haplóides, que serão multiplicadas em condições de telado. 
Etapas para a produção de plantas haplóides e duplo-haplóides e eliminação somática ...
As sementes serão avaliadas de acordo com os objetivos do melhorista. 
Ex.: composição de gluteínas de alto peso molecular, estresses bióticos e 
abióticos, tipo agronômico, resistência a doenças, formas e coloração de 
grão, etc.
Condições: Temperatura: 5°C noite, 10°C dia; Fotoperíodo: 12 horas; 
UR: 60 – 70 %.
Germoplasma de 
trigo
Germoplasma de 
milho
Zigoto F1
Embrião Poli-haplóide
Diploidização
Resgate do embrião
Tratamento com 0.1% de colchicina por
5h (imersão) quando a planta apresentar
3-5 colmos
Os cromossomos do milho são
eliminados nos primeiros 3 ciclos
celulares
Injeção de 1 mL 2,4-
D (100 mg L-1)
Produção de haplóides por hibridização distante
Niroula et al., 
(2009)
Raj kumar (2009)
Trigo poli-haplóide
Trigo duplo-
haplóide
(Homozigoto)
Método in vivo 
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCN3C0urY3cgCFUGDkAodsYMJxg&url=http://www.uidaho.edu/extension/cereals/scseidaho/growstage/week-6&psig=AFQjCNGOHpTBph2ecXhT3ZywsYlnZfRFyw&ust=1445864954198900
Ginogênese
• Ginogênese Natural
– Partenogênese: formação de uma planta de um óvulo não 
fertilizado;
– Pseudogamia: causada por fertilização anormal onde o 
núcleo da célula gamética não se funde com a célula ovo. 
Os núcleos masculinos e femininos se dividem 
independentemente resultando num embrião quimérico 
com manchas de tecido haplóide e de origem materna e 
paterna.
– Semigamia: desenvolvimento partenogenético do gameta 
feminino que requer o estímulo da polinização, porém não 
há singamia completa. O núcleo do pólen penetra na célula 
ovo mas não se funde com o núcleo da célula ovo (não há 
emparelhamento cromossômico).
Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via 
ginogênese in vitro
• GINOGÊNESE – Cultura de ovários e óvulos in vitro: desenvolvimento de 
óvulos não fertilizados em plantas.
• Ovários polinizados por pólen de outra espécie ou de outro gênero ou 
então submetendo o pólen a Rx ou γ resultando no desenvolvimento do 
endosperma pela fusão do núcleo do tubo polínico com um dos núcleos 
centrais da megáspora. A fusão do outro núcleo generativo com a célula 
ovo não ocorre e a planta se desenvolve sem haver a fecundação.
• Relatada para arroz, milho, cana-de-açúcar, girassol, petúnia e batata-doce.
• Respostas baixas (< 15%).
• DESVANTAGEM - Número de sacos embrionários (um por óvulo).
A nucela é um 
tecido que constitui 
o interior do óvulo 
(saco embrionário),recobrindo a 
megáspora.
Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via 
androgênese in vitro
• Cultura in vitro de anteras, pólen e 
micrósporos;
– Vantagem: um mil a dois mil micrósporos/antera;
– Problema: Nem todos os genótipos são 
responsivos;
– Diploidização com colchicina por 4 -12 horas no 
frio.
Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via androgênese in vitro...
1. FUNDAMENTO DA CULTURA DE ANTERAS, PÓLEN E MICRÓSPOROS
• Em meio adequado micrósporos de algumas espécies podem originar 
células vegetativas ao invés de grãos de pólen.
• A transcrição de genes associados ao desenvolvimento gametofítico é 
bloqueada e os genes associados ao desenvolvimento esporofítico são 
ativados. 
– O resultado é a formação de pró-embriões haplóides ou calos.
• O método é utilizado em várias espécies, como exemplo: cevada, triticale, 
arroz, canola (colza), trigo, tabaco, pimentão...
• A grande vantagem é a simplicidade;
• O baixo rendimento das anteras (em razão da viabilidade e não do 
número) pode ser solucionado com o cultivo em larga escala.
Coleta das anteras
Inoculação das 
anteras
Proliferação das anteras
(micrósporos)
Formação de 
calos
Desenvolvimento do 
embrião
Planta haplóide
Tratamento com 
colchicina para 
diploidização
Transplante
Procedimentos para a cultura de anteras de trigo
Trigo duplo-
haplóide
Composição dos 
meios de cultura 
comumente 
utilizados para a 
cultura de 
anteras de 
cevada
Duplicação cromossômica via colchicina
Duplicação cromossômica via colchicina ...
✓A aplicação da colchicina deve ser feita quando os 
haplóides estão ainda em fases precoces do seu 
desenvolvimento.
✓Solução de 0,4% de colchicina esterilizada.
✓Atuação: durante a anáfase.
Ele que é 
usado!!!!
D0 – duplo-haplóide 
LATADO, R.R.; CRISTOFANI-YALY, M.; CARVALHO, C.R.; MACHADO, 
M.A. Plantas autotetraplóides de citros sob tratamento in vitro 
com colchicina. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2007, vol.42, n.10, 
pp. 1429-1435. 
Determinação do número de ploidia
• Contagem cromossômica;
• Contagem do número de cloroplastos; 
• Contagem do número de estômatos;
• Citometria de fluxo;
• Marcadores moleculares.
Contagem cromossômica
Citometria de fluxo
Marcadores Moleculares
APLICAÇÕES DOS
HAPLÓIDES E DUPLO-HAPLÓIDES
• Obtenção de linhas puras homozigotas após a diploidização;
• Redução para uma geração do tempo necessário para a obtenção de linhas 
homozigotas;
• Eliminação da interação dominância/recessividade;
• Obtenção de nova variabilidade através do isolamento de mutantes e da 
recuperação de recombinantes raros; 
• Mutações recessivas são expressas diretamente nos haplóides, devido à 
ocorrência de uma única cópia de genes.
• Redução no tempo de desenvolvimento de novas variedades: de 10 para 6 
anos ou menos;
• Linhas recombinantes homozigotas podem ser obtidas em uma geração ao 
invés de 3 ou 4 anos necessários para o retrocruzamento;
APLICAÇÕES DOS HAPLÓIDES E DUPLO-HAPLÓIDES...
• Seleção para características recessivas nas linhas recombinantes é mais 
eficiente, uma vez que, não há mascaramento pelo efeito de alelos 
dominantes;
• Hibridação somática de protoplastos haplóides;
• Aspargo: Plantas macho (XY) duplicadas produzem supermacho (YY). Quando 
cruzados com plantas femininas (XX) produzem linhagens masculinas (XY) de 
alto rendimento e uniformidade;
• Selecionar genótipos superiores diplóides a partir de alotetraplóides e então 
re-sintetizar alopoliplóides;
• Populações sintéticas podem ser cruzadas em níveis de diploidia e 
tetraploidia em ciclos alternados.
– Obs.: Poliploidia aumenta tamanho das plantas e produtividade
Problemas e limitações
• Formação de plantas com elevados níveis de ploidia;
• Proliferação de tecidos somáticos das anteras;
• Albinismo: plantas sem clorofila:
Principal obstáculo da androgênese como método de obtenção 
de haplóides em gramíneas.
Genótipo, meio e condições de cultura influenciam o 
aparecimento de plantas albinas.
Plantas albinas obtidas por 
androgênese: parecem ter como 
causa uma deficiência na síntese 
proteica e de RNAr ao nível de 
cloroplastos, provavelmente resultado 
de uma alteração do DNA 
cloroplastidial, embora possa ter 
também o envolvimento de DNA 
nuclear.
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=uoa-lj_3f-tFDM&tbnid=QzXjGYOy4j7AoM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.tudosobreorquideas.com.br/forum/viewtopic.php?f=56&t=210&ei=C_sSUpHZIoLa8wTLjYBo&psig=AFQjCNFQ0bOZegFJFfXpLFAaOOzl7IR9jA&ust=1377062001033076
	Slide 1: Cultura de haplóides e duplo-haplóides
	Slide 2: Plantas haplóides
	Slide 3: Processos que levam à produção de plantas haplóides
	Slide 4: Hibridação interespecífica e eliminação cromossômica
	Slide 5
	Slide 6
	Slide 7
	Slide 8
	Slide 9: Como ocorre a eliminação somática (de cromossomos)
	Slide 10
	Slide 11: Etapas para a produção de plantas haplóides e duplo-haplóides e eliminação somática
	Slide 12: Etapas para a produção de plantas haplóides e duplo-haplóides e eliminação somática ...
	Slide 13
	Slide 14: Ginogênese
	Slide 15: Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via ginogênese in vitro
	Slide 16
	Slide 17: Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via androgênese in vitro
	Slide 18: Obtenção de haplóides e duplo-haplóides via androgênese in vitro...
	Slide 19
	Slide 20
	Slide 21: Duplicação cromossômica via colchicina
	Slide 22: Duplicação cromossômica via colchicina ...
	Slide 23: LATADO, R.R.; CRISTOFANI-YALY, M.; CARVALHO, C.R.; MACHADO, M.A. Plantas autotetraplóides de citros sob tratamento in vitro com colchicina. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2007, vol.42, n.10, pp. 1429-1435. 
	Slide 24: Determinação do número de ploidia
	Slide 25: Contagem cromossômica
	Slide 26: Citometria de fluxo
	Slide 27: Marcadores Moleculares
	Slide 28: APLICAÇÕES DOS HAPLÓIDES E DUPLO-HAPLÓIDES
	Slide 29: APLICAÇÕES DOS HAPLÓIDES E DUPLO-HAPLÓIDES...
	Slide 30: Problemas e limitações