Prévia do material em texto
PARASITOLOGIA CLÍNICA PARASITOLOGIA CLÍNICA Parasitologia ClínicaPatrícia Marzola Patrícia Marzola GRUPO SER EDUCACIONAL gente criando o futuro Este material foi elaborado com a intenção de subsidiá-lo em sua caminhada acadê- mica. Nesse sentido, munido de conhecimentos especí� cos em Parasitologia Clínica, esperamos que você possa re� etir sobre diferentes parasitoses, compreendendo também como questões socioambientais e acadêmicas estão diretamente relaciona- das com nossa área de estudos. Consequentemente, a partir de nossos estudos, você ampliará seus conhecimentos especí� cos na área de Parasitologia, permitindo-se atuar de forma competente, como convém a um pro� ssional. SER_FARMA_PARACLI_CAPA.indd 1,3 16/12/2020 12:25:32 © Ser Educacional 2020 Rua Treze de Maio, nº 254, Santo Amaro Recife-PE – CEP 50100-160 *Todos os gráficos, tabelas e esquemas são creditados à autoria, salvo quando indicada a referência. Informamos que é de inteira responsabilidade da autoria a emissão de conceitos. Nenhuma parte desta publicação poderá ser reproduzida por qualquer meio ou forma sem autorização. A violação dos direitos autorais é crime estabelecido pela Lei n.º 9.610/98 e punido pelo artigo 184 do Código Penal. Imagens de ícones/capa: © Shutterstock Presidente do Conselho de Administração Diretor-presidente Diretoria Executiva de Ensino Diretoria Executiva de Serviços Corporativos Diretoria de Ensino a Distância Autoria Projeto Gráfico e Capa Janguiê Diniz Jânyo Diniz Adriano Azevedo Joaldo Diniz Enzo Moreira Patrícia Marzola DP Content DADOS DO FORNECEDOR Análise de Qualidade, Edição de Texto, Design Instrucional, Edição de Arte, Diagramação, Design Gráfico e Revisão. SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 2 16/12/2020 12:42:12 Boxes ASSISTA Indicação de filmes, vídeos ou similares que trazem informações comple- mentares ou aprofundadas sobre o conteúdo estudado. CITANDO Dados essenciais e pertinentes sobre a vida de uma determinada pessoa relevante para o estudo do conteúdo abordado. CONTEXTUALIZANDO Dados que retratam onde e quando aconteceu determinado fato; demonstra-se a situação histórica do assunto. CURIOSIDADE Informação que revela algo desconhecido e interessante sobre o assunto tratado. DICA Um detalhe específico da informação, um breve conselho, um alerta, uma informação privilegiada sobre o conteúdo trabalhado. EXEMPLIFICANDO Informação que retrata de forma objetiva determinado assunto. EXPLICANDO Explicação, elucidação sobre uma palavra ou expressão específica da área de conhecimento trabalhada. SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 3 16/12/2020 12:42:12 Unidade 1 - Cryptosporidium spp. Objetivos da unidade ........................................................................................................... 12 O parasito: cryptosporidium spp. ...................................................................................... 13 Histórico ............................................................................................................................ 13 Biologia ............................................................................................................................. 14 Ciclo de vida ..................................................................................................................... 18 Formas de transmissão e prevenção ........................................................................... 21 A doença: criptosporidiose ................................................................................................ 24 Criptosporidiose ............................................................................................................... 24 Tratamento ........................................................................................................................ 27 Epidemiologia ................................................................................................................... 28 Métodos de diagnóstico ..................................................................................................... 29 Diagnóstico clínico .......................................................................................................... 29 Diagnóstico histológico .................................................................................................. 30 Diagnóstico laboratorial ................................................................................................. 30 Sintetizando ........................................................................................................................... 37 Referências bibliográficas ................................................................................................. 39 Sumário SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 4 16/12/2020 12:42:12 Sumário Unidade 2 - Exame de fezes e resíduos alimentares Objetivos da unidade ......................................................................................................... 444 Coleta e processamento das fezes ................................................................................... 45 Coleta da amostra fecal ................................................................................................. 48 Armazenamento e transporte da amostra fecal ........................................................ 50 Conservantes ................................................................................................................... 51 Exame das fezes ................................................................................................................... 53 Estudo coprológico ......................................................................................................... 53 Análise de resíduos alimentares .................................................................................. 60 Sangue oculto nas fezes ................................................................................................ 61 Coprocultura ..................................................................................................................... 62 Métodos laboratoriais aplicados à parasitologia ......................................................... 63 Exame direto ..................................................................................................................... 63 Tamisação ......................................................................................................................... 65 Técnicas de concentração ............................................................................................ 66 Sintetizando ........................................................................................................................... 70 Referências bibliográficas ................................................................................................. 72 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 5 16/12/2020 12:42:12 Sumário Unidade 3 - Métodos laboratoriais aplicados à parasitologia para identificação de helmintos Objetivos da unidade ........................................................................................................... 76 Introdução .............................................................................................................................. 77 Parasitos intestinais ........................................................................................................ 77 Diagnóstico das parasitoses intestinais ...................................................................... 80 Método de Willis, Faust e colaboradores ....................................................................... 82 Fundamentos e indicações ........................................................................................... 82 Rotina laboratorial e procedimentos .................................................................................. 84 Método de Baermann-Moraes e de Rugai e colaboradores ........................................90 Fundamentos e indicações ........................................................................................... 90 Rotina laboratorial e procedimentos .................................................................................. 91 Método de Harada e Mori .................................................................................................. 94 Fundamento e indicações .............................................................................................. 94 Rotina laboratorial e procedimentos ............................................................................ 95 Sintetizando ........................................................................................................................... 99 Referências bibliográficas ............................................................................................... 100 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 6 16/12/2020 12:42:12 Sumário Unidade 4 - Métodos laboratoriais aplicados à Parasitologia Objetivos da unidade ......................................................................................................... 103 Introdução ............................................................................................................................ 104 Parasitos intestinais ...................................................................................................... 104 Prevalência das parasitoses intestinais .................................................................... 108 Diagnóstico das parasitoses intestinais .................................................................... 112 Método de Formol-Éter (Ritchie) ..................................................................................... 113 Rotina laboratorial ........................................................................................................ 115 Método de Blagg ou MIF-C .......................................................................................... 118 Método de Kato-Katz.......................................................................................................... 118 Rotina laboratorial ......................................................................................................... 120 Método de Graham ............................................................................................................. 122 Rotina laboratorial ......................................................................................................... 123 Sintetizando ......................................................................................................................... 125 Referências bibliográficas ............................................................................................... 127 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 7 16/12/2020 12:42:12 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 8 16/12/2020 12:42:12 Prezado estudante: Este material foi elaborado com a intenção de subsidiá-lo em sua caminha- da acadêmica. Nesse sentido, munido de conhecimentos específi cos em Parasi- tologia Clínica, esperamos que você possa refl etir sobre diferentes parasitoses, compreendendo também como questões socioambientais e acadêmicas estão diretamente relacionadas com nossa área de estudos. Consequentemente, a partir de nossos estudos, você ampliará seus conhe- cimentos específi cos na área de Parasitologia, permitindo-se atuar de forma competente, como convém a um profi ssional. Bons estudos! PARASITOLOGIA CLÍNICA 9 Apresentação SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 9 16/12/2020 12:42:12 Ao Rodrigo, que sempre me incentiva a buscar meus sonhos. Ao Luca e à Izabela, que são a razão de tudo. E à professora doutora Aline Schlindwein, minha grande mestra inspiradora. A professora Patrícia Marzola é espe- cialista em Epidemiologia e Vigilâncias em Saúde pela Faculdade Unyleya e Especialista em Licenciamento Am- biental pela Universidade Gama Filho. Graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Paraná. Tra- balha como editora e professora con- teudista, especialmente para os cursos de Biologia, Educação Física, Farmácia, Fisioterapia e Medicina. Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/9581211988294395 PARASITOLOGIA CLÍNICA 10 A autora SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 10 16/12/2020 12:42:13 CRYPTOSPORIDIUM SPP. 1 UNIDADE SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 11 16/12/2020 12:42:23 Objetivos da unidade Tópicos de estudo Reconhecer o Cryptosporidium spp; Correlacionar o parasito com a doença, incluindo seu histórico, ciclo biológico, epidemiologia, métodos diagnósticos, profilaxia e tratamento; Desenvolver os seus conhecimentos de modo que possam relacionar o quadro clínico com os sintomas. O parasito: cryptosporidium spp. Histórico Biologia Ciclo de vida Formas de transmissão e pre- venção A doença: criptosporidiose Criptosporidiose Tratamento Epidemiologia Métodos de diagnóstico Diagnóstico clínico Diagnóstico histológico Diagnóstico laboratorial PARASITOLOGIA CLÍNICA 12 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 12 16/12/2020 12:42:23 O parasito: Cryptosporidium spp. Este material foi elaborado com a intenção de auxiliar na compreensão das parasitoses oportunistas. Nesta unidade, você estudará sobre o Cryp- tosporidium spp., um complexo de espécies de parasitas intracelulares. Esse microrganismo tem um papel importante como agente etiológico de doen- ças diarreicas em crianças e em adultos imunodefi cientes (BENAMROUZ e colaboradores, 2012). A criptosporidiose foi incluída no relatório da Organização Mundial da Saúde como uma doença negligenciada, sendo a sexta doença parasitária de origem alimentar mais importante. As doenças negligenciadas normalmente ocorrem em países em desenvolvimento, sendo infl uenciadas pelo clima, po- breza e a falta de acesso a serviços básicos (FAO; WHO, 2014). Histórico O Cryptosporidium spp. (“esporocisto oculto”) foi descrito pela primeira vez no estômago de ratos autopsiados pelo médico e patologista Ernest Edward Tyzzer, em 1907, e foi posteriormente denominado como Cryptosporidium mu- ris. Em 1911, Léger descreveu a família Cryptosporidiidae após a identifi cação de outra espécie do mesmo gênero, o C. parvum, parasita de células intestinais de camundongos (DILLINGHAN e colaboradores, 2002). Por muitos anos, a infecção pelo Cryptosporidium spp. foi considerada in- frequente e insignifi cante (DILLINGHAM e colaboradores, 2002). No campo da veterinária, na década de 1950, relatou-se a associação entre a espécie C. me- leagridis com a morbidade e mortalidade em perus. Na década de 1970, iden- tifi cou-se a presença do C. parvum em bovinos e ovinos, tendo importância econômica pela diarreia neonatal (CHALMERS e colaboradores, 2019). Em humanos, o Cryptosporidium foi reconhecido pela primeira vez no ano de 1976, em oito pessoas imunocomprometidas. Mas seu destaque foi a partir da década de 1980 e 1990, como causa de diarreia grave em pessoas com a Síndrome da Imunodefi ciência Adquirida (AIDS). A doença foi nomeada como criptosporidiose ou criptosporidíase (DILLINGHAM e colaboradores, 2002; TZI- PORI; WIDMER, 2008). PARASITOLOGIA CLÍNICA 13 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 13 16/12/2020 12:42:23 DICA No Sistema de Nomenclatura Internacional, utiliza-se “sp.” para citar uma espécie em particular e “spp.” para várias espécies (“spp.” signifi ca “espécies no plural”). Apenas o gênero e a espécie devem ser escritos em itálico; as abreviaturas “sp.” e “spp.” não. Assim, nesta unidade, quando mencionarmos “Cryptosporidium spp.”, estaremos nos referindo ao grupo de espécies e genótipos (algumas espécies não foram descritas, mas têm o sequenciamento genético) pertencentes ao gênero Cryptosporidium. Biologia O Cryptosporidium spp. é um organismo unicelular, eucarionte, perten- cente ao domínio Eukarya, à fi lo Apicomplexa, à classe Sporozoasida (Gregari- nomorphea), à ordem Eucoccidiorida (Cryptogregarida), e àfamília Cryptospo- ridiidae. Você pode visualizar a hierarquia dessa classifi cação no Diagrama 1 (CHALMERS e colaboradores, 2019; CUNHA e colaboradores, 2019). DIAGRAMA 1. TAXONOMIA ABREVIADA (CRYPTOSPORIDIIDAE) EUKARYA Apicomplexa Sporozoasida Eucoccidiorida Gregarinasina Cryptosporidiidae Cryptosporidium PARASITOLOGIA CLÍNICA 14 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 14 16/12/2020 12:42:23 Possivelmente, você já reparou que existem classificações diferentes do Cryptosporidium ou mesmo de outros seres vivos. Até a década de 1980, com a classificação proposta por Levy, a taxonomia dos seres vivos se baseava fundamentalmente em questões fenotípicas. Mas a análise fenotípica não conseguia responder muitas das questões relacionadas à taxonomia (ADL e colaboradores, 2005). Você consegue imaginar o porquê disso? Reflita um pouco sobre essa questão. É importante salientar que os avanços no campo da biologia molecular têm grande impacto na compreensão da biologia do Cryptosporidium spp., po- dendo alterar inclusive a forma de lidar, diagnosticar e tratar essa parasitose. A partir da década de 1980, houve um aumento gradual no uso de técnicas de análise molecular para classificação, com um boom na década de 2000. A partir disso, os pesquisadores vêm construído um novo sistema de classifica- ção em um modelo que associa a morfologia e a análise molecular, agrupan- do os seres vivos de acordo com sua semelhança filogenética. Enfatiza-se que esse sistema ainda está em construção, por isso, você possivelmente notará diferenças na classificação dos seres vivos (ADL e colaboradores, 2005; BAR- TA e colaboradores, 2006). Ainda nesse sentido, em 2005, a Sociedade Internacional de Protozoologia passou a não recomendar mais o uso do termo “protozoário” em taxonomia. Isso porque, justamente pelas análises moleculares, identificou-se que o grupo que antigamente era chamado de “Protista”, apesar de apresentar caracterís- ticas fenotípicas semelhantes (unicelulares, eucariontes), não possuía origem evolutiva comum. Os vários membros desse antigo grupo têm sido hoje realo- cados em novos grupos, embora alguns ainda estejam sob investigação. Vale mencionar que muitos autores ainda utilizam a nomenclatura genérica “proto- zoários” para se referirem aos seres unicelulares eucariontes. Mas é importan- te lembrar que esse termo não tem valor taxonômico (ADL e colaboradores, 2005; BARTA e colaboradores, 2006). O grupo Apicomplexa representa hoje os importantes parasitas obriga- tórios unicelulares, incluindo os gêneros Plasmodium, Toxoplasma, Isospora, Sarcocystis, Cyclospora e Babesia. Contudo, esse é um grupo polifilético (vários membros sem origem evolutiva em comum por classificação inadequada) que possivelmente também sofrerá modificações nos próximos anos. Quanto ao PARASITOLOGIA CLÍNICA 15 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 15 16/12/2020 12:42:23 Cryptosporidium spp., especificamente, existem várias evidências de que ele seja distinto de outros membros do grupo, apesar de ainda ser classificado dessa mesma forma (ADL e colaboradores, 2005; CHALMERS e colaborado- res, 2019; LEITCH; HE, 2012). Os parasitas pertencentes ao grupo Apicomplexa, incluindo o Cryptospori- dium spp., apresentam uma organela chamada de complexo apical, constituído de anéis polares, roptrias, micronemas, microtúbulos e conóides. Essa estru- tura normalmente está envolvida nas interações parasita-hospedeiro, pois é a responsável pela fixação do parasita na célula hospedeira (BOUZID e colabora- dores, 2013; REY, 2018). Até pouco tempo atrás, esse patógeno era considerado um Coccídeo, mas algumas características genéticas têm aproximado esse gênero à subclasse Gregarinasina. Além de estudos de análise filogenética, com base na sequên- cia do gene que codifica a subunidade pequena do ácido ribonucleico ribossô- mico ou SSU rRNA, existem características únicas que diferenciam o gênero dos demais Coccidianos, como a resistência aos fármacos, a capacidade de au- toinfecção e a localização particular no interior da membrana da célula hospe- deira (CHALMERS e colaboradores, 2019). O gênero Cryptosporidium consiste em um conjunto de, pelo menos, 40 es- pécies de parasitas gastrointestinais intracelulares, capazes de infectar aves, répteis, peixes e mamíferos (TZIPORI; WIDMER, 2008). Originalmente, a atri- buição de espécies dentro do gênero Cryptosporidium baseava-se em carac- terísticas fenotípicas, como a especificidade do hospedeiro e a morfologia do oocisto. Contudo, sabe-se hoje que a maioria das espécies de Cryptosporidium apresenta semelhança morfológica. Em função disso, para classificação taxo- nômica, ou diagnóstico a nível de espécie, são necessários métodos molecu- lares em conjunto com estudos morfológicos e biológicos (CHALMERS e cola- boradores, 2019; LEITCH; HE, 2012; RAMIREZ e colaboradores, 2004; RYAN e colaboradores, 2014). Aproximadamente 20 espécies de Cryptosporidium têm potencial de infec- ção em humanos, mas cerca de 90% dos casos de criptosporidiose humana são provocadas pelo C. hominis e C. parvum. Observe no Quadro 1 as principais espécies de Cryptosporidium, encontradas em infecções em humanos (LEITCH; HE, 2012; RYAN e colaboradores, 2014). PARASITOLOGIA CLÍNICA 16 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 16 16/12/2020 12:42:23 QUADRO 1. ESPÉCIES DE CRYPTOSPORIDIUM ENCONTRADAS EM INFECÇÕES HUMANAS Espécie Hospedeiro principal Sítio de infecção C. hominis Humanos Intestino delgado C. parvum Ruminantes Intestino delgado C. meleagridis Peru, aves, humanos Intestino delgado C. felis Gatos Intestino delgado C. canis Cães Intestino delgado C. ubiquitum Bovinos, ruminantes, roedores, primatas Intestino C. muris Rato doméstico, roedores Estômago C. viatorum Humanos Intestino delgado C. cuniculus Coelhos europeus Intestino C. andersoni Bovinos Abomaso C. suis Porcos Intestino grosso e delgado C. bovis Bovinos Intestino delgado C. erinacei Ouriço europeu, cavalos - C. scrofarum Porco Intestino C. tyzzeri Ratos e roedores Intestino delgado C. xiaoi Ovelhas e cabras - C. fayeri Canguru e marsupiais Intestino delgado O Cryptosporidium spp. apresenta duas formas principais, dependo do es- tágio de vida que se encontra: os oocistos, que são as formas de resistência; e os trofozoítos, que são as formas vegetativas capazes de infectar as células do hospedeiro. O oocisto tem cerca de 4-6 µm, dependendo da espécie, o que representa um terço do tamanho de um cisto da Giardia sp. Em função disso, os oocistos de Cryptosporidium spp. são uma grande ameaça para a indústria de tratamento de água, que utiliza o tamanho do cisto de Giardia sp. como pa- râmetro. Isso exige critérios cada vez mais rígidos e onerosos para os padrões de turbidez (DILLINGHAM e colaboradores, 2002). Observe na Figura 1 algumas imagens de microscopia do oocisto, com diferentes colorações. Fonte: CUNHA e colaboradores, 2019. (Adaptado). PARASITOLOGIA CLÍNICA 17 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 17 16/12/2020 12:42:23 1 4 2 5 3 6 10 μm Figura 1. Oocisto de Cryptosporidium spp. Fonte: CDC, 2019a. Acesso em: 08/09/2020. (Adaptado). Observe que: (1) na seta amarela, o oocisto; na seta vermelha, cistos de Giardia duodenalis. Ambos marcados com anticorpos imunofl uorescentes; (2) Oocisto (setas rosa) em montagem úmida. Na seta marrom, levedura; (3) Oo- cistos de Cryptosporidium parvum corados com ácido-resistente modifi cado. Contra um fundo azul esverdeado, os oocistos se destacam em uma mancha vermelha brilhante; (4) Oocistos corados com ácido-resistente modifi cado; (5) Oocistos corados com coloração tricrômica. Com a técnica, os oocistos podem ser detectados, mas não devem ser confi rmados, uma vez que esse método é inadequado para um diagnóstico defi nitivo (oocistos sem coloração). Aqui, os oocistos de Cryptosporidium são representados por setas vermelhas; a seta azul representa a levedura; (6) Oocistosde Cryptosporidium parvum corados com a coloração fl uorescente auramina-rodamina. Ciclo de vida O patógeno apresenta um ciclo monoxênico, ou seja, tanto o ciclo sexuado quanto o assexuado se sucedem no trato gastrointestinal de um único hospe- deiro. Antes de continuar a leitura deste tópico, relembre no Diagrama 2 alguns dos principais conceitos necessários para compreender o ciclo de vida do Cryp- tosporidium spp. (REY, 2018). PARASITOLOGIA CLÍNICA 18 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 18 16/12/2020 12:42:32 O ciclo assexuado ocorre quando o hospedeiro susceptível ingere o oo- cisto do Cryptosporidium spp. No trato intestinal, por ação enzimática pro- teolítica, de sais biliares e por condições relacionadas à redução dióxido de carbono e alteração na temperatura, ocorre a liberação de quatro es- porozoítos infectantes. Os esporozoítos liberados deslizam sobre as célu- las intestinais, liberando material do complexo apical. Isso permite que os esporozoítos migrem pela superfície das células hospedeiras e as invadam ativamente (BOUZID e colaboradores, 2013; TAYLOR, 2017). Dentro da célula hospedeira, cada esporozoíto se desenvolve em um tro- fozoíto esférico, que sofre merogonia e forma um meronte tipo I, contendo oito merozoítos que são liberados e se fixam novamente à superfície de uma célula epitelial, onde sofrem novamente a merogonia e formam um meronte do tipo I ou um meronte do tipo II. O meronte do tipo II contém quatro merozoítos (BOUZID e colaboradores, 2013; TAYLOR, 2018). Esses merozoítos (meronte do tipo II), quando liberados, ligam-se nova- mente à célula epitelial, mas em vez de se desenvolverem em outros meron- tes, iniciam o processo de gametogonia, produzindo microgamontes ou ma- crogamontes. Cada microgamonte sofre divisão nuclear e se diferencia para formar até 16 microgametas, que, quando liberados do vacúolo parasitóforo, fertilizam um macrogametócito unicelular que se desenvolveu a partir de um macrogamonte (fertilização) (BOUZID e colaboradores, 2013). O produto da fertilização, o zigoto, passa por dois ciclos assexuados de esporogonia e produz um oocisto conten- do quatro esporozoítos. A parede dos oocistos formados pode ser de dois tipos: espessa ou fina. Os oocistos de pa- redes espessas são liberados no lúmen do intestino e são excretados nas fezes do hospedeiro. Eles são imediatamente infectantes, permitindo a dis- seminação da infecção para outros hos- pedeiros, dando continuidade ao ciclo. Já os oocistos com paredes finas são res- ponsáveis pela manutenção da infecção nas paredes internas, a chamada autoin- fecção (BOUZID e colaboradores, 2013). PARASITOLOGIA CLÍNICA 19 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 19 16/12/2020 12:42:32 Ciclo assexuado ou esquizogônico Ciclo sexuado ou esporogônico Forma infectante, alongada, móvel, complexo apical Esporozóita abandona esporocisto no hospedeiro Multiplicação assexuada dentro da célula hospedeira Merozóita ou esquizonte: organismo filho resultante União do micro e macrogameta Zigoto sofre meiose (redução dos cromossomos na metade), ou seja, torna-se haploide Forma esporozóitas Formação do zigoto Estrutura com envoltório resistente que contém esporocistos Esporozóita invade células hospedeiro e vira parasita endocelular Muda de forma, perde complexo apical, nutre-se e cresce Merozóita se diferencia Formação de gametócitos: • Microgameta: delgado e flagelado • Macrogameta: maior e imóvel Zigoto é diploide (2N) Zigoto forma parede cística e é chamado de oocisto Liberação do esporozoíto infectado Esporocisto Esporozóita Parasita endocelular Merogonia ou esquizogonia Gametogonia Fertilização Esporocisto Formação da parede cística Liberação esporozoíto DIAGRAMA 2. ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO DO CRYPTOSPORIDIUM SPP. PARASITOLOGIA CLÍNICA 20 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 20 16/12/2020 12:42:32 ASSISTA No vídeo Cryptosporidium Infected Organoids você po- derá visualizar uma animação em que o Cryptosporidium parvum infecta células epiteliais derivadas do intestino delgado e do pulmão humanos. O parasita se propaga dentro das organelas celulares e completa seu ciclo de vida (assexuado e sexual). Formas de transmissão e prevenção O Cryptosporidium spp. vive no intestino animais infectados (inclu- sive nos humanos). Cada hospedeiro pode lançar, pelas fezes, milhões de parasitas no ambiente. Essa libera- ção pode ocorrer logo que os sinto- mas da criptosporidiose iniciam, po- dendo durar semanas após o fi m da sintomatologia (CDC, 2019b). Ao relembrar o ciclo biológico desse microrganismo, você deve conseguir compreender a forma de transmissão da doença: pela inges- tão dos oocistos do Cryptosporidium spp. Mas de que forma isso pode acontecer? Em geral, a transmissão ocorre pela via fecal-oral pelos se- guintes tipos de transmissões: • Antroponótico: de humano para animal e humano para humano; • Zoonótico: de animal para humano; • Entre animais; • Entre humanos (BOUZID e colaboradores, 2013). A transmissão envolve o contato com material contaminado por fezes de parasito, incluindo na água (tratada ou não tratada, sendo maior o risco na água não tratada), nos alimentos (especialmente frutas e leite não pasteu- PARASITOLOGIA CLÍNICA 21 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 21 16/12/2020 12:42:37 rizado) e nos objetos (roupas, calçados, fraldas, superfícies contaminadas). Também ocorre por meio da contaminação ambiental, como presença de fezes contaminadas em esgoto, piscinas, água residual, lama e transborda- mento após chuvas fortes. Existem relatos na literatura de transmissão por “vetores mecânicos”, que podem ocorrer por baratas, moscas, besouros e escaravelhos (BOUZID e colaboradores 2013). Outro modo de transmissão é pela inalação de oocistos. Essa forma foi re- latada em indivíduos adultos e crianças imunocomprometidas, sendo possi- velmente relacionada com a aspiração de vômito contendo o oocisto. Os sin- tomas, nesses casos, estão associados à via respiratória (laringotraqueíte) e podem ser acompanhados de diarreia leve (BOUZID e colaboradores, 2013). De acordo com o Center for Disease, Control and Prevention (CDC, 2019b), nos Estados Unidos, os surtos de diarreia por criptosporidiose estão relacionados principalmente com os seguintes fatores: • 35% - Uso de piscinas coletivas; • 15% - Contato com gado; • 13% - Cuidado de crianças pequenas infectadas. A prevenção da criptosporidiose é muito difícil, pois o Cryptosporidium spp. é um parasita extremamente resistente, sendo capaz de sobreviver por longos períodos em diferentes ambientes. Isso dificulta a vigilância e pre- venção da doença. A higiene das mãos com água e sabão consiste na forma mais eficaz de prevenção, apesar de muitas vezes ser insuficiente pelos inúmeros meios de transmissão indiretos do parasito. É importante mencionar que o Cryptospo- ridium spp. é resistente ao cloro, álcool e a muitos desinfetantes comerciais à base de aldeído e amônia (CDC, 2019b; CHEN e colaboradores, 2002). A maioria dos métodos convencionais de tratamento de água não remo- vem nem eliminam efetivamente todos os oocistos. Por isso, são recomenda- dos teste de rotina para avaliar a presença do parasito na água em todas as estações de tratamento (CHEN e colaboradores, 2002). No Quadro 2, você pode conferir outras importantes for- mas de profilaxia da doença, que foram divididas em pre- venção de contaminação por via hídrica; por via alimentar; e outras formas de prevenção. PARASITOLOGIA CLÍNICA 22 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 22 16/12/2020 12:42:37 Fonte: CDC, 2020b; RAMIREZ e colaboradores, 2004 (Adaptado). Sempre beba água potável. Caso seja imunocomprometido, evite contato com animais, especialmente em fazendas. Cuidado ao manter relação sexual, especialmente ao tocar a região anal do parceiro. Após a relação, higienize as mãos com água e sabão. Ao trocar afraldas de crianças, sintomáticas ou não, mantenha higiene adequada. Tenha cuidado extra quando viajar, especialmente no momento de escolher onde comer e o tipo de água que irá beber. Mantenha higiene das mãos com água e sabão. Álcool não é eficaz para eliminar o crysptosporidium spp. Pessoas imunocomprometidas devem evitar limpar fezes de animais domésticos. Desinfecte com água e sabão superfícies que têm grande potencial de dispersão de oocistos. Crianças com diarreia não devem ir à escola. Prefira consumir alimentos cozidos a crus. Evite beber água de bicas ou fontes naturais. Apesar do aspecto “natural” são fontes de inúmeros parasitos. Consuma apenas leite pasteurizado. Ao tomar banho em águas, rios, piscinas, evite ingerir a água, e mantenha higiene do corpo assim que possível. O cloro não elimina o parasito. Lavem bem frutas e verduras antes de consumi-las, com água potável. A melhor forma de descontaminar a água com oocistos de Crystosporidium spp é fervendo-a por um minuto. Sempre que possível, cozinhe seu próprio alimento. É mais saudável e você pode garantir a qualidade e a higiene. Gestores públicos: disponibilizar saneamento ambiental para toda a população. Lave bem as mãos com água e sabão antes de manusear alimentos. Via alimentar Profilaxia da criptosporidiose Outras formas Via hídrica QUADRO 2. PROFILAXIA DA CRIPTOSPORIDIOSE PARASITOLOGIA CLÍNICA 23 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 23 16/12/2020 12:42:37 A doença: criptosporidiose O Cryptosporidium spp. é um parasita oportunista, de importância médica e veterinária, que causa gastroenterite em diversos hospedeiros vertebrados. É considerado tanto como uma doença alimentar quanto por veiculação hídrica. Pode apresentar diferentes graus de patogenicidade e virulência entre suas espécies, assim como a variação na suscetibilidade do hospedeiro à infecção. A imunidade e o nível nutricional dos infectados estão associados com a se- veridade e evolução da doença. Enquanto nos imunocompetentes a infecção costuma ser branda ou assintomática, nos imunodeprimidos, muitas vezes, há a necessidade de intervenção terapêutica. Nesta seção, será aboradada a patogênese, o tratamento e a epidemiologia da criptosporidiose. Contudo, apesar da magnitude e gravidade da criptospo- ridiose, sua patogênese ainda é mal compreendida, não existindo uma terapia medicamentosa que seja totalmente efi caz (CHEN e colaboradores, 2002). Criptoporidiose Como mencionado, a infecção pelo Cryptosporidium spp. ocorre com a in- gestão das formas denominadas oocistos. Após essa ingestão, há um período de incubação que depende de fatores relacionados ao patógeno e ao hospe- deiro, variando de 3 a 12 dias. Uma pequena quantidade (1 a 10) de oocistos já é capaz de causar a infecção (CHALMERS e colaboradores, 2019). Na criptosporidiose, a resposta imunológica está relacionada tanto com a imunidade humoral quanto à inata. A resposta inata, também chamada de celular, ocorre principalmente por resposta infl amatória. As citocinas e qui- miocinas aumentam a expressão de ciclo-oxigenase do tipo 2 (COX-2) e, con- sequentemente, de prostaglandinas. O aumento das prostaglandinas aumenta a produção de mucina, fato que prejudica a invasão celular pelos esporozoítos (SIQUEIRA-BATISTA, 2020; CHECHKLEY e colaboradores, 2015). No que se refere à imunidade humoral, as células T CD4+ são importantes para o controle da infecção pelo Cryptosporidium spp. Em indivíduos com ní- veis de CD4+ maiores que 180 células/ml, a doença tende a ser autolimitada. Quando esses níveis são menores, ela tende a ser crônica e, em alguns casos, PARASITOLOGIA CLÍNICA 24 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 24 16/12/2020 12:42:37 fulminante. Isso ocorre principalmente em pessoas com HIV ou imunodepri- midas/imunossuprimidas. As células T CD8 têm menor relevância na infecção por Cryptosporidium spp., apesar de serem importantes para a produção de interferon gama (IFN-γ) (CHECHKLEY e colaboradores, 2015). Normalmente, o parasito não causa uma infecção sistêmica, nem penetra no tecido profundo. A invasão da célula hospedeira restringe-se ao lúmen dos enterócitos, localizados na porção terminal do íleo e proximal do cólon. A in- feção induz a morte das células epiteliais, com consequente atrofia das vilo- sidades. Esse dano pode ser resultado da lesão direta às células epiteliais do hospedeiro, ou pode ser indireto por meio do efeito de células inflamatórias e citocinas recrutadas para o local da infecção. Como consequência, ocorre o deslocamento das microvilosidades e a perda da superfície epitelial, causando anormalidades significativas nas funções de absorção e secreção do intestino. A diarreia induzida por Cryptosporidium spp. está associada diretamente com essa absorção intestinal prejudicada e com o aumento da secreção (BOUZID e colaboradores., 2013; CHALMERS e colabora- dores, 2019; CHEN e colaboradores, 2019). Em pessoas imunodeficientes ou imunossuprimidas, o patógeno pode ser encontrado ao longo de todo o intestino e em regiões extraintestinais, como na região biliar e brônquica (CHECHKLEY e colaboradores, 2015). Observe no Quadro 3 as principais formas de manifestação da criptosporidiose. QUADRO 3. TIPOS DE MANIFESTAÇÕES DA CRIPTOSPORIDIOSE Forma da doença Em quem normalmente ocorre Manifestações Doença autolimitada Indivíduos com contagem de lin- fócitos T CD4+ ≥ 180 células/mm³ • Diarreia profusa aguda; • Dor abdominal; • Vômito; • Náusea; • Fadiga; • Anorexia; • Dores; • Duração até dois meses, com média de 9-11 dias. Doença crônica – geral Indivíduos com contagem de lin- fócitos T CD4+ < 140 células/mm³ • Diarreia aquosa profusa, com duração ≥ dois meses; • Perda acentuada de peso; • Má absorção. PARASITOLOGIA CLÍNICA 25 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 25 16/12/2020 12:42:37 Doença crônica – crianças Crianças imun- ocompetentes desnutridas • Diarreia; • Vômito; • Febre; • Perda de peso; • Diminuição do crescimento; • Função cognitiva prejudicada. Doença fulminante Indivíduos com contagem de lin- fócitos T CD4+ < 50 células/mm3 • Perda de líquidos nas fezes ≥ dois litros diários; • Alterações no equilíbrio hidroeletrolítico; • Desidratação grave; • Caquexia. • “Cólera-like”; • Náusea; • Vômito; • Dores abdominais; • Perda de peso; • Anorexia; • Em alguns casos, a morte. Possibilidade de formas extraintestinais: • Envolvimento biliar (23%-29%); • Colangite esclerosante (26%); • Pancreatite (3%-33%); • Envolvimento respiratório; • Tosse (8%-44%). Fonte: FLANIGAN e colaboradores, 1992. (Adaptado). Até o momento, não foram identificados claramente os fatores de virulên- cia específicos do Cryptosporidium spp. Isso ocorre principalmente porque, ao contrário de outros organismos do Filo Apicomplexa, é muito difícil empregar técnicas de cultivo in vitro e genética reversa com esse parasita (CHECHKLEY e colaboradores, 2015). A infecção pode ser persistente por vários meses. Estudos mostram que os níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) presentes nas fezes de crianças mantêm-se elevados por seis meses subsequentes à infecção. Possivelmente, é em decorrência disso que pode ocorrer a desnutrição e nanismo em crianças com criptosporidiose (SIQUEIRA-BATISTA e colaboradores, 2020). É importante lembrar que a severidade dos sintomas está diretamente re- lacionada com a imunidade e o grau de desnutrição do indivíduo. Algumas ma- nifestações atípicas podem ser identificadas em pessoas imunocompetentes e imunodeficientes, como a pancreatite aguda e crônica e a criptosporidiose pulmonar. Em humanos, a criptosporidiose pulmonar pode resultar em insufi- ciência respiratória e morte (LEITCH; HE, 2012). PARASITOLOGIA CLÍNICA 26 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 26 16/12/2020 12:42:37 Tratamento Em indivíduos imunocompetentes, os sinais e os sintomas da criptospori- diose são autolimitados e geralmente diminuem em menos de duassemanas. A reidratação oral ou intravenosa é a forma de tratamento mais importante para diminuir os sinais clínicos da criptosporidiose (LEITCH; HE, 2012). Em casos muito graves de diarreia aquosa, recomenda-se o tratamento sin- tomático, como reposição de líquidos e eletrólitos e agentes como a octreotida parenteral para reduzir a diarreia. O suporte nutricional pode ser necessário em casos de má absorção grave (LEITCH; HE, 2012). Nos indivíduos com HIV/AIDS, frequentemente ocorre a melhora da infec- ção após a adequação da terapia antirretroviral. Contudo, podem ocorrer reci- divas, caso a contagem do CD4+ diminua. Dessa forma, sabe-se que a recons- tituição imunológica é essencial para a resolução completa da infecção em tais pessoas (LEITCH; HE, 2012). Inúmeros medicamentos têm sido utilizados nas últimas décadas para tra- tamento da criptosporidiose, como sinefungina, azitromicina, paromomicina e roxitromicina. Entretanto, apesar do avanço das pesquisas in vitro, nem todos esses esquemas tiveram comprovação de efi cácia por meio de ensaios clínicos randomizados. Uma das razões para resistência e inefi cácia dos medicamentos é que esse parasita é intracelular, mas se localiza no sítio extracitoplasmático. A hipótese é que as drogas entram no citoplasma da célula hospedeira, mas não conseguem atravessar a membrana do Cryptosporidium spp. (HEWWIT e colaboradores, 2000; LEITCH; HE, 2012). A nitazoxanida é um medicamento que reduz a duração da diar- reia e excreção de oocistos em relação ao placebo. O Food and Drug Administration (FDA) aprovou o uso desse medicamento para o tratamento de diarreia pediátrica causada por C. parvum e Giardia lamblia em crianças de um a 11 anos de idade. No entanto, a segurança e efi cácia ainda não foi de- terminada para pacientes adultos ou imunodepri- midos, mesmo quando usada em altas doses e por períodos prolongados (CUNHA e colaboradores, 2018; RAMIREZ e colaboradores, 2004). PARASITOLOGIA CLÍNICA 27 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 27 16/12/2020 12:42:37 Epidemiologia A criptosporidiose é altamente prevalente e tem ampla distribuição glo- bal. A distribuição varia conforme a área geográfi ca e as condições socioeco- nômicas. A prevalência em países em desenvolvimento varia entre 4 a 32%; já nos países desenvolvidos, varia entre 0,6 a 20%. Também existe diferença na prevalência nas zonas urbana e rural, considerando ainda a época do ano (períodos com maior quantidade de chuva). No Brasil, a doença não é de no- tifi cação compulsória, como ocorre no Reino Unido ou na Alemanha. Assim sendo, existem poucos dados sobre sua incidência e prevalência (REY, 2018; RYAN e colaboradores, 2014). Em pessoas com HIV (vírus da imunodefi ciência humana), a prevalência da coinfecção com o Cryptosporidium spp. é de 11,2%, o que indica que exis- tem aproximadamente quatro milhões infectados no mundo. Na África e no Haiti, 50% dos indivíduos com HIV têm criptosporidiose (AHMADPOUR e colaboradores, 2020; REY, 2018). Globalmente, estima-se que a criptosporidiose seja responsável por 30 a 50% das mortes em crianças menores de cinco anos e é considerada a segunda maior causa de diarreia e morte em crianças após o rotavírus (RYAN; HIJAWI, 2015). Um estudo epidemiológico, que avaliou mais de 22.000 bebês e crianças na África e na Ásia, descobriu que Cryptosporidium foi um dos quatro pató- genos responsáveis pelas diarreias severas em crianças. Nesse estudo, o risco de morte (Hazard Ratio) das crianças de 12 a 23 meses foi dois a três vezes maior do que as sem a infecção (KOTLOFF e colaboradores, 2013). Em países desenvolvidos, grande parte dos casos da infecção está relacionado com poluição hídrica. O Cryptosporidium spp. é encontra- do em aproximadamente 80 a 97% das águas superficiais. Nas águas tratadas, o percentual varia de 26 a 54%, o que é preocupante para os sistemas de saúde. O maior surto registrado e relatado da doença ocorreu em Milwaukee, nos Estados Unidos, envolvendo 403.000 pessoas, em abril de 1993. Esse surto teve relação com contaminação em uma estação de tratamento de água (PEREIRA e colaboradores, 2009). PARASITOLOGIA CLÍNICA 28 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 28 16/12/2020 12:42:37 CURIOSIDADE Apesar da criptosporidiose ser muitas vezes negligenciada, ela tem um importante papel mundial como doença epidêmica. O Cryptosporidium spp. é responsável por até 6% de todas as doenças diarreicas em pessoas imu- nocompetentes. Nas pessoas com AIDS, o parasito é responsável por 24% dos casos de diarreia. Nos Estados Unidos, a taxa de hospitalização pelo Cryptosporidium é de 25% e a de mortalidade, de 0,3%. (FAO/WHO, 2014). Com base no que estudamos nesse tópico, refl ita sobre as seguintes questões: apesar da criptosporidiose ter uma am- pla distribuição global, qual a razão de os países em desen- volvimento apresentarem maior morbimortalidade? Por que é difícil controlar um surto dessa doença? Métodos de diagnóstico A criptosporidiose é uma doença entérica autolimitada em indivíduos imu- nocompetentes. Seus sintomas não são patognomônicos, portanto é preciso realizar análise laboratorial para confi rmar o diagnóstico. Nesta seção iremos abordar os métodos de diagnóstico clínicos, histológicos e laboratoriais da crip- tosporidiose (RAMIREZ e colaboradores, 2004). Diagnóstico clínico O diagnóstico clínico é difícil, visto que os sinais e sintomas da criptospori- diose não são patognomônicos, facultando inúmeros diagnósticos diferenciais. Na suspeita de criptosporidiose, deve-se também analisar a possibilidade de infecção pelos seguintes agentes: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Salmo- nella, Shigella, Campylobacter jejuni, Yersinia spp., Cyclospora cayetanensis e mi- crosporídeos (BRASIL, 2010). A doença geralmente é caracterizada pela presença de diarreia aquosa e uma va- riedade de sintomas, como dor abdominal, perda de peso, náuseas, vômitos, febre e mal-estar. Alguns indivíduos não apresentam qualquer sintoma (BRASIL, 2010). O Cryptosporidum spp. é um parasito oportunista, aproveitando-se da situação imunológica das pessoas para se proliferar. Dessa forma, é preciso atentar-se ao diagnóstico de criptosporidiose principalmente em indivíduos PARASITOLOGIA CLÍNICA 29 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 29 16/12/2020 12:42:37 imunocomprometidos/imunossuprimidos, que podem desenvolver formas mais graves. Esse grupo consiste em pessoas com (CDC, 2019b): • HIV/AIDS; • Doenças hereditárias que afetam o sistema imunológico, como a agama- globulinemia congênita, defi ciência de IgA congênita; • Câncer, com uso de medicamentos imunossupressores; • Transplantados, com uso de medicamentos imunossupressores; • Desnutrição, especialmente crianças menores de cinco anos. Diagnóstico histológico Inicialmente, o diagnóstico da criptosporidiose era realizado por meio da observação histológica das formas de desenvolvimento intracelular, em mate- rial de autópsia ou em biópsias de tecido intestinal (O’DONOGHUE, 1995). Em cortes de tecido, o diagnóstico é feito pela demonstração de Cryptospo- ridium spp. na borda em escova da mucosa intestinal. Os parasitas aparecem como estruturas pequenas, basofílicas e esféricas, medindo de 3 a 5 μm (KHU- RANA; CHAUDHARY, 2018). Não são necessárias colorações especiais de análise histológica, mas essas podem facilitar a triagem. As técnicas de PCR e imuno-histoquímica também podem ser realizadas em seções de tecido embebidas em parafi na (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Atualmente, o diagnóstico histológico não é usado com frequência em fun- ção de inúmeras desvantagens. O procedimento de coleta do material é muito invasivo, exige um processamento cuidadoso da amostra e está sujeito à alta probabilidade de erro amostral, pois apenas algumas regiões do intestino são infectadas. Além disso, a técnica é cara e demorada, inadequada para o diag- nóstico rotineiro (CHEN e colaboradores,2002; KHURANA; CHAUDHARY, 2018; O’DONOGHUE, 1995). Diagnóstico laboratorial Existem inúmeros métodos diagnósticos para Cryptosporidium spp. A sele- ção de teste depende de vários atributos e dos recursos disponíveis, incluindo PARASITOLOGIA CLÍNICA 30 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 30 16/12/2020 12:42:37 conhecimento técnico, tempo de resposta, desempenho em modo de lote, tem- po prático, custo de insumos por teste ou lote e equipamento especializado. Antes da análise do material, geralmente é necessário realizar a preparação da amostra. No infográfico visualizado no Quadro 4, você pode observar algu- mas medidas que devem ser realizadas no processamento da amostra com suspeita de Cryptosporidium spp. (BOUZID e colaboradores, 2013). Preservação Maximizar amostra Centrifugação Atenção: Falso-negativo Preparação Preparação Formalina tamponada a 10% Suspensas em meio de armazenamento composto de dicromato de potássio aquoso (2,5% p/v, concentração final). *Fixadores à base de formalina não são recomendados se o teste molecular for realizado Para maximizar a recuperação de oocistos, as amostras devem ser concentradas antes do exame microscópico A sedimentação com formalina- acetato de etila é o método recomendado de concentração nas fezes O aumento da velocidade ou do tempo de centrifugação (500 x g, 10 minutos) pode ser justificado ao tentar recuperar oocistos A formalina é usada rotineiramente em ambientes clínicos como fixador de vários tipos de espécimes. No entanto, devido aos efeitos desfavoráveis da formalina nos ácidos nucleicos, certos fixadores/conservantes não são para detecção molecular, incluindo formalina, acetato de sódio- ácido acético-formalina e álcool polivinílico de baixa viscosidade É comum a presença de “fantasmas” de oocistos não ácidos-resistentes, que não flutuam ou sedimentam como esperado, levando a resultados falso-negativos Devido ao seu pequeno tamanho e massa, os oocistos podem ficar presos no tampão de éter ou acetato de etila e não sedimentar adequadamente Como o número de oocistos pode variar, mesmo em amostras líquidas, deve-se testar várias amostras de fezes antes de relatar uma interpretação diagnóstica negativa Processamento de amostras de fezes para Cryptosporidium spp QUADRO 4. INFOGRÁFICO DO PROCESSAMENTO DAS FEZES DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. PARASITOLOGIA CLÍNICA 31 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 31 16/12/2020 12:42:40 Microscopia óptica O diagnóstico do Cryptosporidium spp. no exame parasitológico de fezes analisa a morfologia do oocisto. Contudo, essa não é definitiva para a identi- ficação da espécie, pois os oocistos são muito pequenos e podem apresentar variações morfológicas imperceptíveis. Os oocistos também podem ser morfo- logicamente idênticos entre as diferentes espécies. A especificidade da microscopia depende prioritariamente da habilidade do mi- croscopista em diferenciar oocistos de outros corpos em esfregaços corados com tintorial inespecíficos ou reagentes fluorescentes (BOUZID e colaboradores, 2013). Exame de montagem úmida O Cryptosporidium spp. pode ser identificado tanto nas amostras de fezes preservadas quanto nas não preservadas. Embora os oocistos possam ser de- tectados por microscopia de luz ou microscopia de contraste de fase, na maioria das vezes eles são perdidos sem coloração. Na microscopia de luz, eles são vistos como corpos lisos, incolores e esféricos ou ligeiramente ovoides, com tamanho que varia de 3 a 8μm, dependendo da espécie (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Para aumentar a sensibilidade da microscopia, deve-se reduzir os detritos pela concentração de oocistos nas fezes. Para isso, são recomendados os méto- dos de centrifugação, flotação de sacarose de Sheather, flotação de sal saturado e o método de formol-éter de Allen e Ridley (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Métodos de coloração Existem muitos procedimentos de coloração descritos para facilitar a de- tecção dos oocistos. Os corantes de Romanowsky, como o de Giemsa e Jen- ner, foram os primeiros a ser usados para a identificação dos oocistos. Com essa coloração, visualiza-se o oocisto semitranslúcido, com um halo estreito e claro ao seu redor. Às vezes, as formas “fantasmas” podem ser encontradas com uma aparência de vidro fosco sem grânulos. Essa técnica é fácil e não invasiva, contudo, apresenta baixa sensibilidade e especificidade (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). A coloração acid-fast modificada (AF) é amplamente utilizada pelo seu baixo custo e por se tratar de uma metodologia simples. Sua sensibilidade é relati- vamente baixa em fezes, sendo possível melhorá-la entre 10 a 100 vezes se as lâminas forem preparadas sob luz ultravioleta com filtro de rodamina (BOUZID e colaboradores, 2013; RAMIREZ e colaboradores, 2004). PARASITOLOGIA CLÍNICA 32 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 32 16/12/2020 12:42:40 A coloração ácido-resistente de Ziehl-Neelsen (mZN), também é usa- da para identificar o oocisto que aparece como esférulas vermelhas contra o fundo verde pálido do slide. O grau de coloração obtido pelo oo- cisto individual varia e pode ser con- fundido com várias estruturas, como detritos fecais, células de levedura e esporos bacterianos. Nessa técnica, apenas as estruturas internas dele, como esporozoítos e corpo residual, são vermelhas, enquanto os vazios permanecem sem coloração, redu- zindo sua sensibilidade (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). A coloração auramina-fenol é uma alternativa à coloração mZN. Trata-se de um procedimento rápido e mais sensível que o método mZN, e pode ser usado como uma técnica de triagem simples e rápida (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Microscopia eletrônica A microscopia eletrônica normalmente não é usada em função do custo do equipamento, do custo de instalação, do processamento complexo e da impos- sibilidade de analisar grande número de amostras. Contudo, em alguns casos pode ser valiosa, como na identificação a nível populacional do parasito em meio a surtos (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Técnicas imunológicas Os testes imunológicos têm sido utilizados em substituição à análise mi- croscópica em fezes para pesquisa de oocistos ou de antígenos solúveis. Esses testes apresentam melhor sensibilidade e especificidade, têm tempo reduzido de análise, mas possuem custo mais elevado quando comparados às técnicas tradicionais de coloração (BOUZID e colaboradores, 2013). Os métodos imunológicos podem ser baseados na detecção de antígeno ou de anticorpos e têm boa sensibilidade e especificidade na faixa de 93% a 100%. Os testes de detecção de antígenos são úteis para o diagnóstico de infecção PARASITOLOGIA CLÍNICA 33 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 33 16/12/2020 12:42:58 aguda. Já os testes de detecção de anticorpos são melhores em inquéritos so- roepidemiológicos (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). A maioria dos anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente são pro- duzidos contra C. parvum. Portanto, as amostras negativas devem sempre ser confirmadas por métodos convencionais ou métodos de reação em cadeia da polimerase (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Os kits para detecção de antígenos baseados nos anticorpos marcados com enzima estão disponíveis comercialmente para os formatos de imunoensaio enzimático e de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou imunocromatográfico (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Os kits de imunoabsorção enzimática (ELISA) apresentam sensibilidade va- riada, porém com boa especificidade, oscilando de 98% a 100%. Ainda, é possí- vel processar um grande número de amostras em um curto período de tempo. A sensibilidade e especificidade dos ensaios imunocromatográficos são muito semelhantes aos da ELISA (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Dessa forma, para facilitar o diagnóstico diferencial, são disponibilizados co- mercialmente kits de imunoensaio enzimáticos e imunocromatográficos que iden- tificam, além do Cryptosporidium spp., a Giardia sp. e a Entamoeba histolytica. Essestestes são podem ser realizados em amostras frescas, congeladas ou conservadas em formalina. Eles oferecem a vantagem de curto tempo de teste e resultados múltiplos em um dispositivo de reação (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). É importante lembrar, especialmente quando utilizar os testes rápidos, que as reações positivas devem ser confirmadas usando um teste confirmatório ade- quado. Também é preciso estar ciente dos potenciais problemas com falsos po- sitivos e interpretar os resultados com cautela (BOUZID e colaboradores, 2013). Métodos moleculares Os métodos moleculares são os únicos capazes de diferenciar espécies e genótipos de Cryptosporidium. Normalmente, são usados em investigações epi- demiológicas e tipagem genética. A vantagem dessas tecnologias é que ofere- cem a sensibilidade e especificidade altas, sem a necessidade de profissionais altamente treinados. Além disso, as infecções podem ser detectadas mesmo na ausência de suspeita clínica (BOUZID e colaboradores, 2013; CDC, 2019b). A PCR é uma técnica que revolucionou os diagnósticos dessa enteropatia: é sensível, com a faixa de detecção de um a 106 oocistos, é relativamente PARASITOLOGIA CLÍNICA 34 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 34 16/12/2020 12:42:58 rápida e permite a especiação, que é muito importante do ponto de vista epidemiológico. Como alternativa, é possível realizar a PCR em tempo real, o que proporciona resultados ainda mais rápidos, tendo menor chance de contaminação com amplicons pelo formato de sistema fechado de ensaio, dispensando a análise dos fragmentos amplificados por eletroforese em gel de agarose, permitindo a visualização dos resultados preliminares antes do término da reação. Ademais, permite a estimação do grau de contaminação do ambiente (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). O painel de patógenos gastroin- testinais é um kit capaz de rastrear simultaneamente patógenos causado- res de diarreia, compreendendo nove bactérias, quatro vírus e três parasitas (incluindo o Cryptosporidium spp.), di- retamente de amostras fecais (KHU- RANA; CHAUDHARY, 2018). Em casos de surtos decorrentes de contaminação da água, é possível rea- lizar a detecção do patógeno em uma amostragem de grande volume (10 a 1.000 litros), com concentração por filtração e uso de esferas magnéticas revestidas com quitina ou anticorpos específicos. A detecção é feita geralmen- te por microscopia fluorescente indireta ou por técnicas moleculares como PCR (KHURANA; CHAUDHARY, 2018). Segurança de laboratório O oocisto do Cryptosporidium spp. é resistente e infeccio- so quando produzido. Assim, há um risco de infecção para os profissionais que trabalham no laboratório por ingestão acidental ou aerossolização. Observe no infográfico disponível no Quadro 5 algumas pre- cauções recomendadas pelos profissionais que trabalham com amostras possivelmente conta- minadas com esse parasito. PARASITOLOGIA CLÍNICA 35 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 35 16/12/2020 12:43:00 Fonte: CDC, 2019b (Adaptado). Acesso em: 05/10/2020. QUADRO 5. PRECAUÇÕES AO TRABALHAR COMO CRYPTOSPORIDIUM SPP Precauções ao trabalhar com amostra de Crytosporidum spp Equipamento de segurança Recursos reutilizáveis Resíduos descartáveis Itens contaminados Deve-se utilizar contenção primária e/ou equipamento de proteção individual ao trabalhar com amostras que podem conter Cryptosporidium spp Os itens de laboratório reutilizáveis podem ser lavados e desinfetados em uma máquina de lavar louça de laboratório, usando um detergente contendo cloro e o ciclo “higienizar” Protocolo do Center for Disease Control and Prevention (CDC) para desinfecção de superfícies contaminadas com oocistos de Crystosporidium spp.: • Remover material orgânico da superfície contaminada com detergente/limpador de laboratório convencional • Absorver a maior parte do derramamento com toalhas de papel descartáveis • Inundar e cobrir completamente a superfície com peróxido de hidrogênio 3% não diluído. Dispensar peróxido de hidrogênio repetidamente, conforme necessário, para manter as superfícies afetadas cobertas e molhadas/úmidas por aproximadamente 30 minutos • Absorver o peróxido de hidrogênio residual com toalhas de papel descartáveis e deixar as superfícies secarem aproximadamente (10-30 minutos) antes de usar Todos os resíduos de papel toalha e outros materiais descartáveis devem ser auto- clavados ou desinfetados de forma semelhante antes do descarte Itens contaminados podem ser imersos por aproximadamente uma hora de banho-maria pré-aquecido a 50 °C e depois lavados em solução detergente/ desinfetante PARASITOLOGIA CLÍNICA 36 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 36 16/12/2020 12:43:02 Sintetizando O Cryptosporidium spp. é um parasita oportunista, unicelular e eucarionte. Sua classificação está em processo de mudança e isso tem grande significado não ape- nas para sua taxonomia, mas também para avanços no diagnóstico, compreensão da patogenia, tratamento e prevenção. As classificações antigas, baseadas apenas em características fenotípicas, eram insuficientes, pois muitas vezes não estarem relacionadas com uma origem evolutiva comum, o que pode influenciar na res- posta a um fármaco por um microrganismo, por exemplo, a sua forma de fixação, à presença de proteínas de membrana etc. Por isso, o estudo da biologia de um patógeno depende muito do avanço no campo da biologia molecular. A doença relacionada com o gênero Cryptosporidium spp., a criptosporidiose, é endêmica em muitos países e tem grande potencial de ocasionar surtos epidê- micos. Países em desenvolvimento normalmente apresentam piores índices da doença. A manifestação clínica mais comum é a diarreia, mas pode incluir desde febre a sintomas respiratórios. Normalmente, a doença é autolimitada em indivíduos imunocompetentes. Pessoas imunossuprimidas/imunodeprimidas podem desenvolver formas crôni- cas e em alguns casos fulminantes, podendo inclusive ir a óbito. Essa enteropatia é uma doença comum em crianças, especialmente as menores de cinco anos e desnutridas. Os sintomas estão relacionados ao trato gastrointestinal, como diarreia, vômitos e desidratação. Em alguns casos, é possível a ocorrência de infecção grave pulmonar ou hepática. Na maioria das vezes, não é necessário tratamento medicamentoso. Em crianças menores de cinco anos ou pessoas imunossuprimidas/imunodeprimi- das, podem ocorrer manifestações graves. Nesses grupos, muitas vezes é preci- so realizar alguma intervenção, como a hidratação oral ou venosa. Alguns medi- camentos têm sido usados nos últimos anos para tratamento da parasitose, mas a maioria não apresenta resultados de eficácia comprovados. Para crianças, o medicamento que se apresentou eficaz até o momento é a nitazoxanida. A principal forma de prevenção dessa parasitose é a higiene adequada das mãos com água e sabão. No entanto, pelas inúmeras formas indiretas de contaminação, é difícil manter métodos adequados de profilaxia. Além disso, o oocisto do Cryptospo- ridium spp. é resistente a cloro, álcool e a inúmeros desinfetantes comerciais. PARASITOLOGIA CLÍNICA 37 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 37 16/12/2020 12:43:02 O diagnóstico da doença pode ser realizado por diversas técnicas, incluindo histologia, microscopia óptica e técnicas imunológicas e moleculares. A escolha do melhor método depende de inúmeros fatores, como disponibilidade de ma- terial, custo e treinamento profissional. PARASITOLOGIA CLÍNICA 38 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 38 16/12/2020 12:43:02 Referências bibliográficas ADL, S.; ALASTAIR, J. B.; SIMPSON, A; ROBERT, A. A.; ROGER, O. R. A.; BARTA, R. e colaboradores. The New Higher Level Classification of Eukaryotes with Em- phasis on the Taxonomy of Protists. Journal of Eukaryotic Microbiology, [s.l.]. v. 52, n. 05, p. 399-451, 19 out. 2005. Disponível em: <https://doi.org/10.1111 /j.1550-7408.2005.00053.x>. Acesso em: 09 set. 2020. AHMADPOUR,E.; SAFARPOUR, H.; XIAO, L.; ZAREAN, M.; HATAM-NAHAVANDI, K.; BARAC, A e colaboradores. Cryptosporidiosis in HIV-positive patients and related risk factors: a systematic review and meta-analysis. Parasite, [s.l.]. v. 27, n. 27, p. 1-19, 29 abr. 2020. Disponível em: <https://doi.org/10.1051/parasite/2020025>. Acesso em: 10 set. 2020. BARTA, J. R.; THOMPSON, R. C.; What is Cryptosporidium? Reappraising its biolo- gy and phylogenetic affinities. Trends in Parasitology, [s.l.]. v. 22, n. 10, p. 463- 468, 01 out. 2006. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.pt.2006.08.001>. Acesso em: 09 set. 2020. BENAMROUZ, S.; CONSEIL, V.; CREUSY, C.; CALDERON, E.; DEI-CAS, E.; CERTAD, G. Parasites and malignancies, a review, with emphasis on digestive cancer indu- ced by Cryptosporidium parvum (Alveolata: Apicomplexa). Parasite, [s.l.]. v. 19, n. 12, p. 101-115, 15 maio. 2012. Disponível em: <https://doi.org/10.1051/parasi- te/2012192101>. Acesso em: 09 set. 2020. BHADAURIA, D.; GOEL, A.; KAUL, A.; SHARMA; R. K.; GUPTA, A.; RUHELA, V.; VAR- DHAN, H. Cryptosporidium infection after renal transplantation in an endemic area. Transplant infectious disease: an official journal of the Transplantation Society, [s.l.]. v. 17, sup. 1, p. 48-55, 12 jan. 2015. Disponível em: <https://doi. org/10.1111/tid.12336>. Acesso em: 09 set. 2020. BOUZID, M.; HUNTES, P. R.; CHALMERS, R. M.; TYLER, K. M. Cryptosporidium pa- thogenicity and virulence. Clinical Microbiology Review, [s.l.]. v. 26, n. 01, p. 115- 134, 07 jan. 2013. Disponível em: <http://www.doi.org/10.1128/CMR.00076-12>. Acesso em: 09 set. 2020. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Doenças infecciosas e parasitárias: guia de bol- so. 8. ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2010. CDC - DPDx - Cryptosporidiosis. Disponível em: <https://www.cdc.gov/dpdx/ PARASITOLOGIA CLÍNICA 39 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 39 16/12/2020 12:43:02 cryptosporidiosis/index.html>. Acesso em: 05 Oct. 2020. Parasites - Cryptosporidium (also known as “Crypto”). Disponível em: <ht- tps://www.cdc.gov/parasites/crypto/>. Acesso em: 22 aug. 2020. CHALMERS, R. M.; DAVIES, A. P.; TYLER, K. Cryptosporidium. Microbiology So- ciety Journal, [s.l]. v. 165, n. 05, p. 500-502, 03 maio. 2019. Disponível em: <ht- tps://doi.org/10.1099/mic.0.000764>. Acesso em: 22 ago. 2020. CHECHKLEY, W.; WHITE, A. C.; JANAGATH, D.; ARROWOOD, M. J.; CHALMERS, R.; CHEN, X. e colaboradores. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases, [s.l.]. v. 15, n. 01, p. 85-94, 29 set. 2015. Disponível em: <https://doi. org/10.1016/s1473-3099(14)70772-8>. Acesso em: 09 set. 2020. CHEN, X. M.; KEITHLY, J. S.; PAYA, C. V.; LARUSSO, N. F. Cryptosporidiosis. The New England Journal of Medicine, [s.l.]. v. 346, n. 22, p. 1723-1731, 30 maio. 2002. Dis- ponível em: <https://doi.org/10.1056/NEJMra013170>. Acesso em: 09 set. 2020. CUNHA, G. V.; PAZ, L. B.; AZENHA, R. S.; JUNIOR, R. S.; ALBERNAZ, D. A. S. Prin- cipais protozoários entéricos oportunistas associados à AIDS: Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Cyclospora cayetanensis e microsporidia. Revista Aten- ção à Saúde, São Caetano do Sul. v. 16, n. 55, p. 99-107, jan./mar, 2018. Disponível em: <https://doi.org/10.13037/ras.vol16n55.4723>. Acesso em: 09 set. 2020. CUNHA, F. S.; PERALTA, R. H. S.; PERALTA, J. M. New insights into the detection and molecular characterization of Cryptosporidium with emphasis in Brazilian studies: a review. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo. v. 61, p. 1-12, 24 abr. 2019. Disponível em: <https://www.scielo.br/pdf/rimtsp/ v61/1678-9946-rimtsp-61-S1678-9946201961028.pdf>. Acesso em: 09 set. 2020. CRYPTOSPORIDIUM Infected Organoids. Postado por Demcon Nymus3D. (2min. 24s.). son. color. port. ou leg. Disponível em: <https://youtu.be/ee159M- 3wxA8>. Acesso em: 09/09/2020. DILLINGHAM, R. A.; LIMA, A. A.; GUERRANT, R. L. Cryptosporidiosis: epidemiology and impact. Microbes Infection, [s.l.]. v. 89, n. 9, p. 1059-1066, 2002. Disponível em: < https://doi.org/10.1016/S1286-4579(02)01630-1>. Acesso em: 05 out. 2020. FLANIGAN, T.; WHALEN, C.; TURNER, J.; SOAVE, R.; TOERNER, J.; HAVLIR, D.; KOTLER, D. Cryptosporidium infection and CD4 counts. Annals of Internal Medicine, [s.l.]. v. 116, p. 840-842, 15 maio. 1992. Disponível em: <https://doi. org/10.7326/0003-4819-116-10-840>. Acesso em: 09 set. 2020. PARASITOLOGIA CLÍNICA 40 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 40 16/12/2020 12:43:02 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Food and Agriculture Organization of the Uni- ted Nations [FAO/WHO]. Multicriteria-based ranking for risk management of food-borne parasites: microbiolological risk assessment series no. 23. FAO/ WHO, Roma, 2014. Disponível em: <http://www.fao.org/3/a-i3649e.pdf>. Acesso em: 09 set. 2020. HEWWIT, R. G; YIANNOUTSOS, C. T.; HIGGS, E. S.; CAREY, J. T.; GEISELER, P. J.; SOA- VE, R e colaboradores. Paromomycin: no more effective than placebo for treat- ment of cryptosporidiosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. Clinical Infectious Diseases, [s.l.]. v. 31, n. 04, p. 1084-1092, 25 out. 2000. Disponível em: <https://doi.org/10.1086/318155>. Acesso em: 03 set. 2020. KOTLOFF, K. L.; NATARO, J. P.; BLACKWELDER, W. C.; NASRIN, D.; FARAG, T. H., PANCHALINGAM, S e colaboradores. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multi- center Study, GEMS): a prospective, case-control study. Lancet, [s.l.]. v. 382, n. 9888, p. 209-222, 10 jul. 2013. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/S0140- 6736(13)60844-2>. Acesso em 09 set. 2020. KHURANA, S.; CHAUDHARY, P. Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. Tropi- cal parasitology, [s.l.]. v. 08, n. 01, p. 2-7, 28 maio. 2018. Disponível em: <https:// doi.org/10.4103/tp.TP_34_17>. Acesso em: 10 set. 2020. LEITCH, G. J.; HE, Q. Cryptosporidiosis-an overview. Journal of Biomedical Re- search, [s.l.]. v. 25, n. 01, p. 1-16, jan. 2012. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/ S1674-8301(11)60001-8>. Acesso em: 03 set. 2020. O’DONOGHUE, P. J. Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals. International Journal for Parasitology, [s.l.]. v. 25, n. 02, p. 139-195, fev. 1995. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/0020-7519(94)e0059-v>. Acesso em: 10 set. 2020. RAMIREZ, N. E.; WARD, L. A.; SREEVARSAN, S. A review of the biology and epide- miology of cryptosporidiosis in humans and animals. Microbes and Infection, [s.l.]. v. 06, n. 08, p. 773-785, jul. 2004. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j. micinf.2004.02.021>. Acesso em: 09 set. 2020. REY, L. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nos trópicos. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2018. RYAN, U.; FAYER, R.; XIAO, L. Cryptosporidium species in humans and ani- PARASITOLOGIA CLÍNICA 41 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 41 16/12/2020 12:43:02 mals: Current understanding and research needs. Parasitology, [s.l.]. v. 141, n. 13, p. 1667-1685, 11 ago. 2014. Disponível em: <https://doi.org/10.1017/ s0031182014001085>. Acesso em: 09 set. 2020. RYAN, U.; HIJAWI, N. New developments in Cryptosporidium research. Interna- tional Journal for Parasitology, [s.l.]. v. 45, n. 06, p. 367-373, maio. 2015. Dis- ponível em: <https://doi.org/doi:10.1016/j.ijpara.2015.01.009>. Acesso em: 09 set. 2020. SIQUEIRA-BATISTA, R. Parasitologia: fundamentos e prática clínica. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2020. TAYLOR, M. A. Parasitologia veterinária. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koo- gan, 2017. TZIPORI, S; WIDMER, G. A hundred-year retrospective on cryptosporidiosis. Trends in parasitology, [s.l.]. v. 24, n. 04, p. 184-189, 01 abr. 2008. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.pt.2008.01.002>. Acesso em: 10 set. 2020. PARASITOLOGIACLÍNICA 42 SER_FARMA_PARACLI_UNID1.indd 42 16/12/2020 12:43:02 EXAME DE FEZES E RESÍDUOS ALIMENTARES EXAME DE FEZES ALIMENTARES 2 UNIDADE SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 43 14/12/2020 13:36:04 Objetivos da unidade Tópicos de estudo Conhecer as funções e procedimentos do exame de fezes; Correlacionar os métodos diagnósticos recomendados para cada parasitose abordada; Reconhecer anormalidades ou patologias no exame de fezes com relação com o trato gastrointestinal; Entender a importância da coleta, preparação e análise adequadas dos materiais fecais para um diagnóstico preciso. Coleta e processamento das fezes Coleta da amostra fecal Armazenamento e transporte da amostra fecal Conservantes Exame das fezes Estudo coprológico Análise de resíduos alimentares Sangue oculto nas fezes Coprocultura Métodos laboratoriais aplica- dos à parasitologia Exame direto Tamisação Técnicas de concentração PARASITOLOGIA CLINICA 44 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 44 14/12/2020 13:36:04 Coleta e processamento das fezes Este material foi elaborado com a fi nalidade de auxiliá-lo(a) na compreen- são do exame de fezes, um procedimento rotineiro que permite a sondagem de inúmeras alterações no trato gastrointestinal. Por meio desse exame é pos- sível identifi car a presença de resíduos alimentares, sangue oculto, gordu- ra e também a detecção de parasitos intestinais. Algumas dessas alterações podem ser observadas a olho nu, e algumas exigem observação microscópica. A infecção por parasitos intestinais pode ocasionar inúmeras manifestações clí- nicas, como diarreia, dor abdominal, perda de sangue nas fezes e emagrecimento. A diarreia é uma importante causa de morbimortalidade no mundo, principalmen- te em países em desenvolvimento. Nos países desenvolvidos, raramente é fatal, mas ocasiona custos socioeconômicos (AZEVEDO et al., 2017; MOTTA; SILVA, 2002). Os principais organismos relacionados com as diarreias são protozoários, helmin- tos, vírus e bactérias, como pode ser observado no Quadro 1. O exame parasitológico de fezes é capaz de identifi car a presença de protozoários e helmintos; a coprocultura identifi ca a presença de bactérias patogênicas; e as viroses intestinais são identifi ca- das por meio de métodos imunológicos ou moleculares (MOTTA; SILVA, 2002). Bactérias • Vibrio cholerae e outros vibriões; • Shigella spp.; Salmonella spp. (não tifoide); • E. coli; • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis (enterotoxigênico). Vírus • Rotavírus; • Adenovírus entérico; • Calicivírus; • Astrovírus. • Vibrio cholerae • Vibrio cholerae • Shigella • Vibrio cholerae • Shigella • Vibrio cholerae • Shigella Salmonella • Vibrio cholerae spp.; Salmonella • E. coli; e outros vibriões; spp.; Salmonella • E. coli; • Campylobacter jejuni; e outros vibriões; spp. (não tifoide); • E. coli; • Campylobacter jejuni; e outros vibriões; spp. (não tifoide); • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; e outros vibriões; spp. (não tifoide); • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; e outros vibriões; spp. (não tifoide); • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; spp. (não tifoide); • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis • Campylobacter jejuni; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis • Rotavírus; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis • Rotavírus; • Adenovírus entérico; • Yersinia enterocolitica; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis • Rotavírus; • Adenovírus entérico; • Clostridium diffi cile; • Bacteroides fragilis • Rotavírus; • Adenovírus entérico; • Calicivírus; • Bacteroides fragilis (enterotoxigênico). • Adenovírus entérico; • Calicivírus; • Astrovírus. (enterotoxigênico). • Adenovírus entérico; • Calicivírus; • Astrovírus. (enterotoxigênico). • Adenovírus entérico; • Calicivírus; • Astrovírus. (enterotoxigênico). • Adenovírus entérico; • Astrovírus. (enterotoxigênico). (enterotoxigênico). QUADRO 1. AGENTES ETIOLÓGICOS MAIS RELACIONADOS ÀS DIARREIAS INFECCIOSAS PARASITOLOGIA CLINICA 45 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 45 14/12/2020 13:36:04 Fonte: SILVA, 2008, p. 58; MOTTA; SILVA, 2002, p. 118. (Adaptado). Considerando que o diagnóstico clínico das enteroparasitoses é impreciso – baseia-se em manifestações clínicas muito amplas –, o diagnóstico labora- torial é fundamental para o identifi car as parasitoses, conduzir a terapêutica adequada e determinar a cura (AZEVEDO et al., 2017). Em algumas situações, podem ser realizados testes para sondagem inicial dos parasitos, com alta sensibilidade e especifi cidade. Os testes de imunoen- saio, ou testes rápidos, podem utilizar anticorpos monoclonais para detectar antígenos parasitários nas amostras fecais. Os métodos mais comuns são o ensaio imunoenzimático, fl uorescência direta e técnicas de imunocromatogra- fi a. Os kits rápidos estão disponíveis para detecção de protozoários intestinais, como por exemplo, a Entamoeba histolytica, Giardia sp., Cryptosporidium spp. Contudo, em função do alto custo, esses testes normalmente não são utiliza- dos no Brasil (ZEIBIG, 2014). O exame mais tradicional para detecção de parasitos intestinais na prática laboratorial, em nosso país, é o exame de fezes. Mas, apesar da importância das doenças parasitárias em todo o mundo, muitas vezes o exame não é valorizado em função dos inú- meros erros diagnósticos e pelas difi culdades na coleta. Esses erros podem estar relacionados ao procedimento, interpretação ou coleta e arma- zenamento da amostra, conforme apresentado na Figura 1. Protozoários • Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Cryptosporidium spp.; • Cyclospora spp. Helmintos • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Hymenolepis diminuta. • Entamoeba histolytica;• Entamoeba histolytica;• Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Cryptosporidium • Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Cryptosporidium • Cyclospora • Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Cryptosporidium • Cyclospora • Entamoeba histolytica; • Giardia lamblia; • Cryptosporidium • Cyclospora • Trichuris trichiura; • Cryptosporidium • Cyclospora • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Cryptosporidium spp.; spp. • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; spp.; spp. • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Trichuris trichiura; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Hymenolepis diminuta. • Ancylostoma duodenale; • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Hymenolepis diminuta. • Strongyloides stercoralis; • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Hymenolepis diminuta. • Schistosoma mansoni; • Hymenolepis nana; • Hymenolepis diminuta.• Hymenolepis diminuta.• Hymenolepis diminuta.• Hymenolepis diminuta. PARASITOLOGIA CLINICA 46 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 46 14/12/2020 13:36:05 Figura 1. Fatores que aumentam a chance de erro no exame de fezes. Fonte: NEVES, 2010. (Adaptado). !!! 3 Fatores que aumentam a chance de erro no exame de fezes 1 Erro de procedimento 3 Erro na coleta e conservação 2 Erro de interpretação•Uso incorreto das técnicas de microscopia; •Deficiências na preparação das lâminas e esfregaços; •Observação muito rápida das preparações; •Problemas no uso dos aparelhos de medida; •Falha ao seguir os protocolos das inúmeras técnicas •Falta de experiência do examinador. Para garantir a qualidade da análise, é preciso que a coleta e armazenamento da amostra sejam bem-feitas, permitindo a observação adequada dos espécimes. É importante frisar que um material colhido inadequadamente, velho ou com preservação inadequada tem pequeno valor diagnóstico. •Falta de conhecimento das várias espécies; •Falta de conhecimento dos artefatos presentes nas fezes; •Incapacidade de observar os organismos de certas espécies; •Necessidade de amostra adicional do paciente, em função do ciclo dos parasitos. Ressalta-se que as parasitoses intestinais são doenças muito frequen- tes, com destaque para regiões pobres e com falta de estrutura sanitária adequada, e tendo em vista que o diagnóstico dessas parasitoses é difícil em função de questões técnicas e da própria biologia dos parasitos, muitos profissionais de saúde utilizam o tratamento de modo empírico, sem a com- provação laboratorial. Considerando todas essas dificuldades apresentadas, é fundamental que o profissional atuante na área esteja devidamente capacitado, que conheça as diferentes técnicas, assim como as vantagens e desvantagens de cada uma. PARASITOLOGIA CLINICA 47 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 47 14/12/2020 13:36:05 Coleta da amostra fecal O exame parasitológico inicia com a coleta do material. É muito importante que o paciente receba todas as instruções para coleta com antecedência e por escrito. A coleta e armazenamento adequados são fundamentais para garantir a qualidade e assegurar um diagnóstico preciso (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Deve-se atentar a inúmeros fatores, como o tipo de recipiente coletor, o volume de fezes coletados, o tempo entre a coleta e a análise, o uso de medica- mentos e a temperatura de armazenamento (CARLI, 2001). Recipiente As amostras de fezes devem ser coletadas em recipientes apropriados, lim- pos e preferencialmente estéreis. O recipiente coletor, como o modelo da Figura 2, deve ter boca larga e a capacidade aproximada de 250 mL. Deve ter vedação her- mética para manter a umidade do material coletado (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Figura 2. Modelo de recipiente coletor de amostras fecais. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 25/09/2020. Sempre que possível, as fezes devem ser colhidas diretamente no frasco es- pecífi co para coleta. Caso necessário, pode-se utilizar um jornal ou papel limpo e, em seguida, utilizar uma pá estéril ou um palito de madeira descartável para realizar a transferência para o recipiente coletor. O recipiente de armazenamento deve ser próprio para esse fi m e pode apresentar conservantes de acordo com a orientação do laboratório (ADLER, 1986; CARLI, 2001; NEVES, 2010; PROCOP, 2018). PARASITOLOGIA CLINICA 48 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 48 14/12/2020 13:36:05 Contaminações Durante a coleta, deve-se evitar contaminação com urina e água, pois po- dem fazer as formas vegetativas dos parasitos perderem a mobilidade ou so- frerem lise. Não é possível analisar espécimes coletados do solo, pois podem existir larvas de vida livre ou outros contaminantes que confundem o diagnós- tico. As fezes obtidas do vaso sanitário também não podem ser aproveitadas em função do risco de contaminação e pela presença de água e urina, que des- troem os trofozoítos (CARLI, 2001). Número de coletas Para melhor diagnóstico de alterações, deve-se coletar três amostras de fezes em dias distintos. A justificativa para as múltiplas coletas se baseia nos seguintes fatores: • Intermitência na liberação do parasito nas fezes do hospedeiro, que va- riam de acordo com a espécie; • Distribuição não uniforme dos ovos dos helmintos na amostra; • Diversos estágios de vida dos protozoários, com liberação irregular; • Limitações das técnicas diagnósticas. A sensibilidade dos exames aumenta se as coletas múltiplas mantiverem um intervalo de 48 horas entre cada uma. Para detecção da Giardia sp., por exemplo, em uma única amostra, a chance da positividade é de 50 a 70%. Com três amostras, a chance é de 90% (FERNANDES et al., 2012; KARSIGA, 2019). Medicamentos Alguns medicamentos devem ser evitados antes de realizar o exame para- sitológico de fezes, visto que podem interferir na análise do exame pelo escu- recimento dos parasitos ou alteração de suas formas. Caso o paciente faça uso de algum desses medicamentos, recomenda-se que seja aguardado o período mínimo de uma semana, idealmente de duas a três semanas, para realização do exame de fezes (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Segundo Neves (2010), pode-se citar os seguintes medicamentos que de- vem ser evitados antes do exame parasitológico de fezes: • Antiácidos; • Antibióticos; • Antidiarreicos; • Antimaláricos; PARASITOLOGIA CLINICA 49 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 49 14/12/2020 13:36:05 • Bário ou bismuto; • Ferro; • Laxativos; • Óleo mineral; • Sulfato de bário; • Vaselina. Em algumas situações específi cas, é preciso que o paciente faça uso de la- xantes para obter intencionalmente fezes líquidas. Isso pode ser necessário para confi rmar o diagnóstico de algumas parasitoses, como a amebíase, giar- díase e estrongiloidíase. Nesses casos, é possível a indução com laxantes, de acordo com a recomendação do profi ssional de saúde. Deve-se preferir o uso de laxantes salinos, como os com fosfato de sódio e sulfato de sódio tampo- nado. Esses fármacos causam menos danos morfológicos aos parasitos, facili- tando sua visualização. As fezes induzidas por laxantes devem ser coletadas e levadas imediatamente ao laboratório (CARLI, 2001). Diarreia A fase líquida da diarreia deve ser aproveitada, tendo em vista que nela é que são identifi cados mais trofozoítos. Nesses casos, recomenda-se informar o laboratório sobre a presença da diarreia, para preparação de diferentes técnicas de coloração ou concentração de acordo com hipótese diagnóstica (FERNANDES et al., 2012). Coleta de crianças pequenas Deve-se ter cuidado ao coletar material de crianças pequenas. Não se re- comenda a retirada de fezes de fraldas, por cotonete retal ou do vaso sanitá- rio. Em crianças que usam fraldas, a coleta pode ser realizada em saco coletor de urina. O material pode inclusive ser enviado para análise no saco coletor (ADLER, 1986; NEVES, 2010; PROCOP, 2018). Armazenamento e transporte da amostra fecal Após a coleta das fezes, o material deve ser levado imediatamente para o laboratório. Caso isso não seja possível, deve-se mantê-lo lacrado (para manter a umidade e evitar o ressecamento) e armazenado em geladeira por no máximo 12 horas, com temperatura média de 3 °C a 5 ºC. Apesar disso, é importante lembrar que a refrigeração em baixa temperatura pode prejudicar o diagnóstico PARASITOLOGIA CLINICA 50 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 50 14/12/2020 13:36:05 de algumas bactérias patogênicas, como a Shigella sp. e a Salmonella sp. e de lar- vas de nematódeos, como Strongyloides stercoralis e de ancilostomídeos (ADLER, 1986; CARLI, 2001; NEVES, 2010; PROCOP, 2018). O transporte da amostra depende do clima e do tipo de organismo procura- do. Em ambientes muito quentes, o resultado geralmente é insatisfatório. Isso porque ocorre competição entre bactérias patogênicas e não patogênicas, de modo que o isolamento dos patógenos é difi cultado. Caso o tempo da coleta e da análise seja prolongado, o laboratório pode fornecer um frasco de coleta, como o Cary Blair ou salina glicerinada tamponada (ADLER, 1986). Conservantes Para armazenamento no laboratório, as amostras fecais nunca devem ser congeladas ou colocadas em estufas, pois ocorre a deterioração dos parasitos. A temperatura ideal para armazenamento é de 3 °C a 5º C. Para conservação adequada em locais com climatropical, o ideal é o congelamento rápido com nitrogênio (ADLER, 1986; FERNANDES et al., 2012; NEVES, 2010). Para preservação permanente, recomenda-se o uso de conservantes, que podem ser adicionados às fezes para permitir maior intervalo entre a coleta e a análise da amostra. Recomenda-se manter a proporção de uma parte de fezes para três de conservantes. Antes de armazenar, deve-se homogeneizar o espéci- me (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Para melhor compreensão, vale a pena abordar- mos alguns dos principais fi xadores utilizados para análise do exame de fezes. Formaldeídos e preparações Para preservação dos estágios de vida dos protozoários e helmintos, nor- malmente são utilizadas preparações de formaldeído em diversas diluições ou preparações: • Formalina 5%: é ideal para preservação de cistos, mas não recomendada para fi xação de trofozoítos; • Formalina 10%: não preserva trofozoítos, mas é efi caz para preservar oo- cistos, esporos, ovos e larvas. Entretanto os ovos, larvas e cistos podem fi car levemente distorcidos, especialmente os de H. nana, H. diminuta e S. stercoralis; • Formaldeído a quente (60ºC): ideal para espécimes que contenham ovos. A fi xação a frio não impede o desenvolvimento embrionário de muitos ovos, o PARASITOLOGIA CLINICA 51 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 51 14/12/2020 13:36:05 que os torna infectantes e viáveis por longos períodos, tornando-se um risco em potencial para o examinador; • Formaldeído neutro: a formulação neutra é eficaz para fixação de cistos, garantindo a manutenção das suas características morfológicas. Recomenda-se o uso da solução de formaldeído tamponada com fosfato de sódio (CARLI, 2001). As principais vantagens no uso de fixadores à base de formaldeído é que eles mantêm a morfologia dos parasitos por longos períodos e têm longa vali- dade. Todavia, não é possível preparar esfregaços permanentes corados pre- servados com formaldeídos. Ademais, podem interferir nas análises da reação em cadeia da polimerase (PCR) (CARLI, 2001). Solução fixadora álcool polivínico A solução fixadora de álcool polivínico (APV) consiste em uma resina so- lúvel em água. A solução atua como uma fita adesiva para o material fecal, preparando a lâmina para coloração. Normalmente, é incorporada ao fixador de Schaudinn para conservar e transportar amostras fecais líquidas. A APV é excelente para preservar trofozoítos e cistos por anos, contudo a solução deve ser evitada na preservação de oocistos. A APV é incompatível com os métodos de coloração derivados de Ziehl-Neelsen e com as técnicas de concentração, que são muito frequentes na análise parasitológica (CARLI, 2001). Fixador de Schaudinn É um fixador frequentemente usado para preservar protozoários em fezes líquidas. É preciso tomar cuidado ao manusear esse fixador, pois ele contém cloreto de mercúrio II, sendo tóxico aos humanos e ao ambiente (CARLI, 2001). Essa solução deve ser preparada imediatamente antes do uso. As principais vantagens da preparação é que ela preserva trofozoítos e cistos de protozoá- rios para a coloração de esfregaços permanente e tem longa validade. A fixação dos organismos na lâmina é rápida, em aproximadamente uma a duas horas. As principais desvantagens são a toxicidade, difícil preparação e distorção da morfologia de ovos e larvas (CARLI, 2001). Fixador mertiolato-iodo-formaldeído O fixador mertiolato-iodo-formaldeído (MIF) é uma mistura que envolve corantes e fixadores com mertiolato ou mercurocromo, iodo e formaldeído. É eficaz para corar a maioria dos estágios de protozoários e helmintos. Na prepa- ração do exame direto a fresco, é capaz de preservar e corar simultaneamente PARASITOLOGIA CLINICA 52 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 52 14/12/2020 13:36:06 os organismos. Tem fácil preparação e longa validade. Quando utilizada em conjunto com técnicas de concentração, pode apresentar resultados insatisfa- tórios (CARLI, 2001). Fixador acetato de sódio ácido acético formaldeído O fi xador acetato de sódio ácido acético formaldeído (SAF) consiste em uma mistura de formaldeído, acetato de sódio e ácido acético glacial. É uma solução estável e atóxica, sendo uma boa opção para fi xação de parasitos. É útil para o diagnóstico de trofozoítos, cistos, oocistos e ovos por esfregaços permanentes e preparações concentradas a fresco (CARLI, 2001). Exame de fezes Segundo Carli (2001), o exame de fezes consiste nas seguintes avaliações: • Identifi cação de parasitos intestinais, macro e microscopicamente; • Análise de resíduos alimentares e gorduras nas fezes; • Verifi cação da presença de sangue oculto em fezes, especialmente em ca- sos que há suspeita de tumores no cólon e reto; • Coprocultura. A pesquisa nas fezes deve se iniciar com uma análise macroscópica e, em seguida, a microscópica. Para correta identifi cação dos parasitos intestinais, é preciso distingui-los de tecido morto, fragmentos alimentares, leucócitos ou outros artefatos. Ainda, o profi ssional deve reconhecer as diversas formas dos parasitos intestinais, como ovos, larvas, trofozoítos, cistos, oocistos ou esporos (CARLI, 2001; LIMA et al., 2019; NEVES, 2010). O exame de fezes também permite a identifi cação de alterações no trato gas- trointestinal, como a presença anormal de resíduos alimentares, em função da dieta ou de patologias, a presença patológica de sangue e a presença de bacté- rias patogênicas, que não fazem parte da fl ora intestinal normal (CARLI, 2001). Estudo coprológico O estudo coprológico, também conhecido como coprológico funcional, tem como objetivo avaliar as funções do trato gastrointestinal, incluindo a avalia- ção macro e microscópica. O exame macroscópico funciona como uma tria- PARASITOLOGIA CLINICA 53 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 53 14/12/2020 13:36:06 gem e análise geral das características do espécime fecal, portanto, sempre deve anteceder o exame microscópico. Antes de iniciar a análise do material, é importante lembrar que todo material fecal é considerado como infectante, por isso é necessário o uso de luvas para proteção e descarte adequado (CAR- LI, 2001; REY, 2017). Para a preparação, deve-se transferir a amostra para recipientes de boca larga, como placas de Petri ou latas limpas. As porções superficiais da amostra fecal e das bordas devem ser rejeitadas, pois geralmente são mais secas. De- ve-se examinar a superfície do espécime e, em seguida, com auxílio de um pa- lito, buscar a presença de helmintos adultos ou proglotes de vermes. O exame macroscópico pode ser realizado pela observação simples ou pela tamisação (CARLI, 2001; REY, 2017). O Diagrama 1 apresenta os principais aspectos que devem ser analisados no exame macroscópico das fezes. DIAGRAMA 1. SONDAGEM INICIAL DO EXAME DE FEZES Analise macroscópica Presença de sangue Forma Consistência Cor Odor Presença de vermes adultos Tipografia Presença de proglotes Presença de muco PARASITOLOGIA CLINICA 54 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 54 14/12/2020 13:36:06 Também é importante avaliar a idade do paciente, pois, em bebês, as fezes têm cor e consistência diferenciadas. Essas informações auxiliam na detecção geral de alterações gastrointestinais e também na elaboração de hipóteses diagnósticas, que são essenciais para determinar o método adequado para prosseguir com a análise (KARSIGA, 2019). Destacam-se algumas expressões que são formas ou estágios evolutivos dos parasitas intestinais estudados: • Trofozoítos: são formas vegetativas de protozoários, móveis. São encon- trados em fezes líquidas, pastosas, muco-sanguíneas. Se degeneram mais rapi- damente, portanto deve-se realizar o exame o mais rápido possível; • Cistos ou oocistos: formas latentes de um organismo, com parede espes- sa, resistentes à dessecação, podendo ser de bactérias ou protozoários. São observados em fezes formadas ou semiformadas; • Os ovos e as larvas: formas de helmintos. Podem estar presentesem todos os tipos de amostras fecais, mas difi cilmente são encontrados em amostras líquidas; • Proglotes ou proglótides: divisão ou segmento das tênias, vermes para- sitas intestinais. No laboratório, deve-se priorizar a análise e preparação do material fecal de acor- do com a sua consistência. Inicialmente, deve-se analisar as fezes líquidas ou pasto- sas, em seguida, as semiformadas e as formadas. Além disso, deve-se registrar as características gerais, como a consistência, presença de sangue e muco, e o uso de medicamentos ou alimentos que possam alterar o resultado da análise (CARLI, 2001). Consistência das fezes O material fecal varia quanto à consistência em função da quantidade de água presente. Em geral, as fezes normais apresentam cerca de 75% de líquidos. Em doenças, como a cólera, o teor de água pode se aproximar de 100%. O Quadro 2 apresenta as classifi cações tradicionais sobre a consistência das fezes (NEVES, 2010). Consistência das fezes Quantidade de líquido Fezes formadas 75% Fezes semiformadas 80% Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) ≥ 90%Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes formadas Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes formadas Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes formadas Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes formadas Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) Fezes semiformadas Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas)Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas)Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas)Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas)Fezes pastosas ou líquidas (diarreicas) 75%75% 80% ≥ 90%≥ 90% QUADRO 2. CONSISTÊNCIA DO MATERIAL FECAL Fonte: NEVES, 2010, p. 125. (Adaptado). PARASITOLOGIA CLINICA 55 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 55 14/12/2020 13:36:06 Formato das fezes O formato das fezes varia de acordo com sua consistência. Também é mol- dado pelo esfíncter anal. Na escala de Bristol, criada pelo médico inglês Ken Heaton, é possível observar as possíveis formas das fezes humanas. Em casos onde há estreitamento ou espasmos retais, o calibre das fezes é reduzido. Nos casos de diarreia, a massa é amorfa (tipo 7). Em casos de constipação, as fezes podem se apresentar como cíbalos (tipo 1). O formato de fezes em fita (seg- mento fino e longo) pode indicar a presença de colite espasmódica (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010). Figura 3. Escala de Bristol. Fonte: SPILLER; THOMPSON, 2012, p. 44. (Adaptado). Tipo 1 Grumos duros separados, como nozes, difíceis de eliminar. Tipo 3 Similar à salsicha, com rachaduras na superfície. Tipo 5 Manchas macias com bordas definidas. Tipo 4 Similar à salsicha ou cobra, lisa e macia. Tipo 6 Peças disformes com bordas indefinidas, fezes pastosas. Tipo 7 Aquosa, sem material sólido, totalmente líquida. Tipo 2 Formato de salsicha, porém grumosa. PARASITOLOGIA CLINICA 56 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 56 14/12/2020 13:36:06 Coloração das fezes Em geral, a cor normal das fezes é marrom (castanha) em função da bilirrubina e bile, contudo sua cor varia muito em função da dieta. Fezes ri- cas em vegetais apresentam coloração esverdeada. Quando há um grande consumo de alimentos lácteos, as fezes são amareladas (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010). Em algumas situações, a coloração alterada das fezes pode ser indicativa de patologia ou uso de medicamentos/suplementos. Desse modo, é muito im- portante questionar sobre o uso de algum medicamento. A cor de argila ou massa de vidraceiro é observada em casos de obstruções biliares. Fezes pretas podem indicar sangue perdido no trato gastrointestinal superior (> 100 mL de sangue). Fezes avermelhadas são observadas no caso de sangramento do trato gastrointestinal inferior. A cor preta também pode ser em decorrência do tra- tamento com ferro ou bismuto. O uso de sais de ferro torna as fezes preto-es- verdeadas (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010). Quantidade de fezes A quantidade de fezes diárias eliminada varia de acordo com a qualidade e quantidade de alimentos ingeridos. Uma pessoa saudável, com dieta balancea- da, elimina em média 100 a 150 g por dia. Em casos de diarreia ou enterite, essa quantidade pode atingir 800 g ou mais. Em casos de síndrome de má absorção ou de insuficiência pancreática, o volume de fezes produzido é maior. Em pes- soas com constipação, a quantidade do bolo fecal é reduzida (NEVES, 2010). Presença de muco É normal a evidenciação de um pouco de muco nas fezes, entretanto a pre- sença de muco abundante e com sangue é anormal e pode ser indicativo de irritação ou inflamação. Em casos de colite, o muco está presente na forma de pequenas estrias, isoladas. Já nos casos de colite muco-membranosa, observa- -se a presença de filamentos maiores, como coágulos ou placas, que podem ser facilmente removidos com auxílio de uma pinça (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010). Particularidades em bebês Em recém-nascidos e bebês, as fezes apresentam consistência pastosa ou aquosa. Para identificação da cor de fezes em bebês, recomenda-se a avaliação usando o cartão de cores. Essa escala auxilia na detecção de possível atresia das vias biliares (KARSIGA, 2019). PARASITOLOGIA CLINICA 57 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 57 14/12/2020 13:36:06 Figura 4. Tabela de cores de fezes de bebês. Fonte: Ministério da Saúde, 2013, p. 29. (Adaptado). Fezes normais Fezes suspeitas Odor das fezes O odor característico das fezes é decorrente da presença de gás sulfídrico, metano e ácidos resultantes do metabolismo intestinal. Contudo, o odor pode ser influenciado pelo tipo de alimento ingerido, assim como medicamentos e pela alteração da flora intestinal. Em casos de pessoas com carcinomas, pode ocorrer odor pútrido. O odor também é alterado em pessoas com grande in- gestão láctea ou com fezes alcoólicas (NEVES, 2010). Potencial hidrogeniônico das fezes O potencial hidrogeniônico (pH) das fezes é determinado pela diluição no papel tornassol ou similar, empregando-se papel azul e vermelho. Normalmen- te, a reação é ligeiramente alcalina ou neutra, no entanto o regime alimentar pode alterar esse equilíbrio. Na presença de reação ácida, o papel azul se torna vermelho, e o vermelho permanece igual; se for neutra, os papéis não se alte- ram; em reações alcalinas, o papel vermelho se torna azul e o azul permanece igual. Também existem papéis indicadores, que mudam de cor em conformida- de com os íons de H+ presentes nas fezes (NEVES, 2010). Segundo Neves (2010), o pH das fezes está relacionado com diferentes fatores, tais como: • Alterações alimentares (quantidade excessiva de açúcares ou hidratos de carbono e o teor de gordura); • A presença de fermentação bacteriana; • Má absorção de hidratos de carbono ou de gorduras; • Diarreia secretória; • Colite; • Adenoma viloso; • Uso de antibióticos. PARASITOLOGIA CLINICA 58 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 58 14/12/2020 13:36:06 Algumas dessas alterações são fisiológicas e transitórias, mas, em alguns casos, pode evidenciar a presença de patologia. O Diagrama 2 resume o poten- cial hidrogeniônico das fezes e suas possíveis alterações. DIAGRAMA 2. POTENCIAL HIDROGENIÔNICO DAS FEZES E SUAS POSSÍVEIS ALTERAÇÕES Fonte: NEVES, 2010, p. 11. (Adaptado). pH ácido pH alcalino Valores de referência: Lactentes sob aleitamento materno: 5,0 a 6,0 Lactentes sob aleitamento com leite de vaca: 7,2 a 9,0 Crianças de 1 a 4 anos: 5,6 a 7,5 Não lactentes e adultos: 6,5 a 7,5 pH das fezes • Intolerância e má absorção de hidratos de carbono e gorduras; • Fermentação. • Putrefação; • Decomposição de proteínas; • Diarreia secretória; • Adenoma viloso; • Colite; • Uso de antibióticos. Após a triagem macroscópica inicial, deve-se selecionar amostras de dife- rentes partes da massa fecal para análise microscópica. O exame microscó- pico é uma ferramenta capaz de diagnosticar ospatógenos intestinais. Além disso, deve-se buscar a presença de fibras musculares parcialmente diferidas, presença de gorduras e cristais de ácidos graxos, presença de amido, celulose não digestível e leucócitos (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010). DICA O relatório da análise macro e microscópica sempre deve conter: • O nome científico de todo parasito encontrado no relatório, com gênero e, se possível, espécie; • A forma observada: ovo, larva, cisto, oocisto, trofozoíto ou verme adulto; • Método(s) utilizado(s); • Medicamentos utilizados pelo paciente; • Consistência das fezes. Para garantia da qualidade das amostras, é importante que o paciente receba todas as orientações instrutivas por escrito. PARASITOLOGIA CLINICA 59 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 59 14/12/2020 13:36:06 A menor quantidade de fezes necessária para o exame é de 2g a 5 g. Po- de-se examinar as fezes imediatamente para identifi car organismos em movi- mento. Caso não seja possível a análise imediata, deve-se manter a amostra no conservante mais adequado para os organismos analisados (KARSIGA, 2019). Para seleção da amostra fecal, deve-se buscar diferentes partes da massa fecal, principalmente de porções com maior suspeita. As fezes devem ser diluí- das em uma parte de fezes para dez partes de água. Para tanto, se deve triturar uma pequena porção de fezes e acrescentar progressivamente água para ob- tenção da diluição fi nal. Essa mistura deve ser colocada em uma placa de Petri para análise de detritos, com auxílio de um bastão de vidro e fundo escuro para sobreposição da placa microscópica (NEVES, 2010). Análise de resíduos alimentares Tanto na análise macro como microscópica, é possível observar resíduos alimentares. A presença de restos de carne, gordura ou detritos vegetais po- dem indicar anormalidades, como alteração do trânsito intestinal ou síndrome de má absorção. Apresentamos, conforme Neves (2010), os principais resíduos alimentares observados em exames de fezes: • Fibras musculares: têm cor amarela ou alaranjada, em função da bile. Normalmente, apresentam-se nas formas: • Cilíndricas alongadas, com estrias longitudinais ou transversais (fi bras mal digeridas); • Retangulares com poucas estrias (fi bras digeridas); • Ovais, amarelas, sem estrias, sendo conhecidas como corpos de Nothna- gel, que são as fi bras em estado avançado de digestão. A presença de fi bras mal digeridas é um indicativo de possível insufi ciência pancreática; • Tecido conjuntivo: na observação microscópica das fezes, o tecido con- juntivo se apresenta em forma de feixes alongados ou fi bras isoladas refrin- gentes. São transparentes quando tratadas pelo ácido acético e se coram em vermelho com o reativo de Hecht; • Gorduras: são muito refringentes e apresentam-se na forma de glóbulos ou gotículas e são levemente coradas pela bile. Quando há grandes quantida- PARASITOLOGIA CLINICA 60 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 60 14/12/2020 13:36:06 des de gordura, formam pequenos lagos. São coradas em vermelho pelo Sudan III e reativo de Hecht. Os ácidos graxos se apresentam na forma de agulhas fi nas e longas e seu excesso denota insufi ciência biliar. Em humanos saudáveis, a excreção diária de gordura nas fezes é inferior a 6 g. A excreção excessiva pode ocorrer em casos de ausência ou má absorção de gordura, especialmente em pacientes com diarreia. Em estudos com pessoas com diarreia, foram relatados até 14 g diários em voluntários com diarreia induzida por laxantes e em pacientes com peso fecal superior a 1.000 g por dia (KARSIGA, 2019); • Amido: tem melhor observação em preparações com lugol. Pode ser ob- servado intracelularmente, em pequenas porções, separadas por septos de ce- lulose ou amorfas, em tom róseo se tingido com lugol. O amido cru é colorido em tom escuro; • Celulose: dividem-se em digestíveis e não digestíveis. As digestíveis são arredondadas, ovais ou elípticas, com contornos nítidos. Está presente em quantidades insignifi cantes. Maiores quantidades indicam aceleração do trân- sito intestinal. A celulose não digestível, derivada da cutícula de cerais e vege- tais, não tem valor semiológico; • Cristais: normalmente são de ácidos graxos, fosfato amoníaco-magnesia- no, oxalato de cálcio. O ácido clorídrico normalmente dissolve esses cristais, logo, o excesso pode sugerir insufi ciência gástrica; • Flora iodófi la: constitui-se na fl ora intestinal natural, formada por levedos ou bactérias. Apesar de não ser um resíduo, sua presença excessiva normalmente está relacionada com alterações alimentares, decorrentes da fermentação intestinal exa- gerada ou trânsito acelerado. Contém amido e se coram em violeta pelo iodo. Sangue oculto nas fezes O exame de fezes é útil para avaliar a presença de sangue nas fezes. Para isso, não é necessário manter uma dieta restritiva. As preparações de ferro por via oral não alteram o resultado. A ingestão de grandes quantidades de vi- tamina C deve ser limitada, não podendo ser superior a 250 mg por dia, por três dias antes da coleta. A aspirina e os anti-infl amatórios não esteroides podem causar falsa positividade, pois provocam pequenos sangramentos na mucosa do trato gastrointestinal (KARSIGA, 2019). PARASITOLOGIA CLINICA 61 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 61 14/12/2020 13:36:06 Em testes baseados em peroxidase, a atividade semelhante à peroxidase da hematina e/ou hemoglobina transforma o catalisador em azul. Antes do exa- me, não se recomenda que as amostras de fezes sejam diluídas novamente. Apesar de a diluição aumentar a sensibilidade do teste, causa um aumento nos resultados falso positivos (KARSIGA, 2019). Uma perda de cerca de 2 a 5 mL de sangue por dia é normal nos intestinos. Caso seja observado volume maior do que esse, deve-se confi rmar pela reali- zação do teste de sangue imuno-histoquímico, que possui alta sensibilidade e especifi cidade (KARSIGA, 2019). CITANDO Sã o proibidas carnes e derivados, bem como alimentos coloridos e que contenham alta atividade de peroxidase: em especial beterraba, espinafre, rabanete, nabo, bró colis, maç ã , banana, couve-fl or e melã o. Nã o utilizar medicamentos que possam irritar a mucosa gá strica, em especial anti- -infl amató rios hormonais, aspirina, ferro e vitamina C. Evitar sangramento gengival durante a higiene oral e evitar a coleta na presença de epistaxe (sangramento nasal) ou sangramento devido a hemorroidas. Não colher amostras até 3 dias apó s a menstruaç ã o (NEVES, 2010, p. 41). Coprocultura A coprocultura visa identifi car agentes infecciosos causadores de doenças ou alterações gastrointestinais. Em geral, é recomendada para diagnosticar in- fecções bacterianas, como as provocadas pela Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli ou Shigella spp. (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016). Normalmente, o exame parasitológico de fezes e a coprocultura ou cultura de fezes são solicitadas simultaneamente. Caso o paciente esteja com diarreia com suspeita infecciosa, deve-se realizar duas culturas de fezes: para busca de patógenos entéricos, com realização de cultura e antibiograma e a segunda, para cultura de C. diffi cile e pesquisa de toxinas (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016). A preparação deve ser montada utilizando sempre as porções mais suspei- tas, como com a presença de muco ou sangue, preferencialmente com fezes frescas. O exame deve ser realizado antes da introdução do antibioticoterapia (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016; MAROJA; LOWERY, 1956). PARASITOLOGIA CLINICA 62 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 62 14/12/2020 13:36:06 Primeiramente, deve-se utilizar um caldo de enriquecimento seletivo, visan- do diminuir a quantidade de bactérias da microbiota normal, que não é patogê- nica. Em seguida, é utilizado um meio de cultura, de acordo com o organismo desejado, com posterior visualização microscópica (SILVA, 2008). Métodos laboratoriais aplicados à parasitologia De acordo com o painel do Our Worldin Data, de 2017, a diarreia se cons- tituiu como a sétima principal causa de morte no mundo, com 1,6 milhão de óbitos. Os principais patógenos relacionados a essa diarreia são protozoários e vermes que possuem ampla distribuição em locais com falta de saneamento, higiene e alimentação adequada. O diagnóstico dessas parasitoses auxilia na redução da morbimortalidade (Our world in data, 2017). Considerando que as parasitoses intestinais são doenças preveníveis, é im- portante refl etir porque ainda há, na atualidade, tantos óbitos por diarreia, mes- mo com todo avanço tecnológico que temos. O exame de fezes aplicado à parasitologia consiste em métodos qualitati- vos ou quantitativos que podem ser examinados de forma fresca ou preser- vada. Os métodos quantitativos avaliam a intensidade do parasitismo pela contagem das formas parasitárias. O método mais conhecido é o de Stoll e o mais utilizado rotineiramente é o de Kato-Katz. Esses métodos, entretanto, são pouco usados para fundamentar a conduta clínica, sendo mais usados para avaliações epidemiológicas (NEVES, 2010). Os métodos qualitativos são os mais utilizados para evidenciar a presença de parasitos. Como, em geral, o número de parasitos ou de suas formas é muito peque- no, é preciso associar a métodos de enriquecimento e colorações para concentração e melhor visualização dos parasitos. Não existe um método que consiga avaliar iso- ladamente todos os possíveis parasitos intestinais. Desse modo, frequentemente é preciso realizar uma combinação de métodos (NEVES, 2010; NEVES, 2016). Exame direto O exame direto a fresco, também conhecido como esfregaço de fezes, é preparado diretamente do material fecal coletado. Trata-se de um procedimento PARASITOLOGIA CLINICA 63 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 63 14/12/2020 13:36:06 Figura 5. Preparação de fezes para análise microscópica. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 25/09/2020. simples e efi ciente para o estudo das fezes, que permite a observação de trofo- zoítos vivos dos protozoários, contudo exige um microscopista experiente para identifi car as formas parasitárias (CARLI, 2001; FERREIRA, MORAES, 2017). Os esfregaços com fezes frescas e não fi xadas são preparados com solução salina a 0,85% e de iodo. Os esfregaços devem ser examinados sistematica- mente pela avaliação microscópica de pequeno aumento e com pequena inten- sidade de luz. A confi rmação dos parasitos deve ser realizada com a objetiva de grande aumento (CARLI, 2001). Quando forem usadas fezes preservadas, a formalina atua como diluente, não sendo necessário adicionar a solução salina a 0,85% às preparações de esfregaços sem coloração (CARLI, 2001). O exame direto é recomendado para busca de trofozoítos em fezes frescas, preferencialmente com menos de 30 minutos entre a coleta e a análise, visto que os trofozoítos têm vida curta no meio externo. É ideal para o diagnóstico de infecções por E. histolytica. Para a identifi cação de cistos e larvas, é preciso preparar com lugol e a coloração que daí resulta, reforça e tinge os cistos (NE- VES, 2010; FERREIRA, MORAES, 2017). Outras colorações temporárias ou permanentes podem ser utilizadas com as preparações a fresco para auxiliar na localização e identifi cação de protozoários, sendo desnecessários esses corantes para a pesquisa de ovos e larvas de hel- mintos (CARLI, 2001). O corante de hematoxilina férrica pode ser usado para co- rar o núcleo dos parasitos; o azul de metileno é útil para evidenciar as estruturas citoplasmáticas e nucleares das formas vegetativas (FERREIRA; MORAES, 2017). PARASITOLOGIA CLINICA 64 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 64 14/12/2020 13:36:07 Procedimentos da técnica do exame direto: • Colocar duas ou três gotas de salina a 0,85% em uma lâmina de vidro; • Transferir para a lâmina pequenas porções de fezes, com o auxílio de um palito de madeira; • Adicionar uma gota de solução de lugol forte (iodo: 2 g; iodeto de potássio: 4 g; água destilada: 100 mL); • O uso da lamínula é opcional; • Observar inicialmente em menor aumento e, posteriormente, com au- mento de 100 a 200 vezes (NEVES, 2010). Tamisação É uma técnica de emulsão das fezes em água. Em seguida, a emulsão é coa- da com auxílio de uma peneira metálica em água corrente. Com essa técnica, é possível observar a presença de vermes adultos de Ascaris lumbricoides e Ente- robius vermicularis, assim como as proglotes de tênias (NEVES, 2010). Para identifi car as proglotes de tênias, podem ser utilizadas as seguintes técnicas: • Método do ácido acético glacial: em uma placa de Petri contendo a so- lução do ácido acético durante 15 a 20 minutos. Após o período, comprimir a proglote em uma lâmina e examinar sob luz intensa; • Método dos campos: dissolver três comprimidos de metoquina em 5 mL de água destilada deionizada. A proglote deve ser imersa nessa solução por 15 minutos e, posteriormente, deve ser colocada em uma lâmina e ser examinada sob luz intensa (NEVES, 2010). Figura 6. Proglótide de tênia visualizada em microscopia de campo claro. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 25/09/2020. PARASITOLOGIA CLINICA 65 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 65 14/12/2020 13:36:07 Técnicas de concentração As técnicas de concentração ou enriquecimento são procedimentos de ro- tina, parte de um exame completo das fezes, para a pesquisa de parasitos e o diagnóstico de um pequeno número de organismos que foram omitidos quan- do foi usado somente o exame direto a fresco. Segundo Carli (2001), os princi- pais objetivos dessas técnicas são: • Aumentar o número de cistos, ovos ou larvas da preparação; • Eliminar a maioria dos detritos fecais; • Apresentar os organismos inalterados, facilitando a identifi cação. Essas técnicas são indicadas para separar os cistos, oocistos de protozoários e ovos de helmintos do excesso de detritos fecais considerando as diferenças específi cas de densidade. Os principais métodos de enriquecimento utiliza- dos na rotina laboratorial são a sedimentação espontânea, sedimentação por centrifugação, fl utuação espontânea, centrífugo-fl utuação, fi ta gomada e con- centração de larvas de helmintos por migração ativa (CARLI, 2001). O Quadro 3 apresenta os principais métodos de enriquecimento das amostras de fezes. QUADRO 3. PRINCIPAIS MÉTODOS DE ENRIQUECIMENTO DAS AMOSTRAS DE FEZES Métodos de enriquecimento Nome do método Forma observada Centrí fugo-fl utuaç ã o Método de Faust • Cistos; • Oocistos; • Ovos leves. Flutuação espontânea Método de Willis • Ovos leves (ancilostomídeos). Sedimentação espontânea Método de Hoff man, Pons e Janer (Lutz) • Ovos; • Larvas; • Cistos. Sedimentação por centrifugação Métodos de Blagg e de Faust • Ovos; • Larvas; • Cistos; • Oocisto. Fita gomada Graham • Cestódeos. • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares). Centrí fugo-fl utuaç ã oCentrí fugo-fl utuaç ã oCentrí fugo-fl utuaç ã oCentrí fugo-fl utuaç ã o Flutuação espontânea Centrí fugo-fl utuaç ã o Flutuação espontânea Centrí fugo-fl utuaç ã o Flutuação espontânea Sedimentação espontânea Centrí fugo-fl utuaç ã o Flutuação espontânea Sedimentação espontânea Flutuação espontânea Sedimentação espontânea Flutuação espontânea Sedimentação espontânea Flutuação espontânea Sedimentação espontânea Sedimentação por Método de Faust Sedimentação espontânea Sedimentação por centrifugação Método de Faust Sedimentação espontânea Sedimentação por centrifugação Método de Faust Método de Willis Sedimentação espontânea Sedimentação por centrifugação Método de Faust Método de Willis Sedimentação por centrifugação Fita gomada Método de Faust Método de Willis Método de Hoff man, Pons e Sedimentação por Fita gomada Método de Willis Método de Hoff man, Pons e Janer (Lutz) Fita gomada Método de Willis Método de Hoff man, Pons e Janer (Lutz) Fita gomada Método de Hoff man, Pons e Janer (Lutz) Fita gomada • Cistos; Método de Hoff man, Pons e Janer(Lutz) • Cistos; • Oocistos; Método de Hoff man, Pons e Métodos de Blagg e de Faust • Cistos; • Oocistos; • Ovos leves. Método de Hoff man, Pons e Métodos de Blagg e de Faust • Oocistos; • Ovos leves. Método de Hoff man, Pons e Métodos de Blagg e de Faust • Oocistos; • Ovos leves. • Ovos leves (ancilostomídeos). Método de Hoff man, Pons e Métodos de Blagg e de Faust • Ovos leves. • Ovos leves (ancilostomídeos). • Ovos; Métodos de Blagg e de Faust Graham • Ovos leves. • Ovos leves (ancilostomídeos). • Ovos; • Larvas; Métodos de Blagg e de Faust Graham • Ovos leves (ancilostomídeos). • Larvas; • Cistos. Métodos de Blagg e de Faust Graham • Ovos leves (ancilostomídeos). • Larvas; • Cistos. Métodos de Blagg e de Faust • Ovos leves (ancilostomídeos). • Cistos. Métodos de Blagg e de Faust • Ovos; • Ovos leves (ancilostomídeos). • Ovos; • Larvas; • Ovos leves (ancilostomídeos). • Larvas; • Cistos; • Ovos leves (ancilostomídeos). • Larvas; • Cistos; • Oocisto. • Cistos; • Oocisto. • Cestódeos. • Oocisto. • Cestódeos.• Cestódeos. • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Cestódeos. • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente Enterobios vermiculares • Nematódeos (especialmente ). • Nematódeos (especialmente PARASITOLOGIA CLINICA 66 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 66 14/12/2020 13:36:08 Fonte: NEVES, 2010, p. 13. (Adaptado). Método de Lutz ou Hoff man, Pons e Janer ou sedimentação espontânea Essa técnica foi criada inicialmente por Adolpho Lutz, em 1919, e tem como princípio a sedimentação espontânea. É uma técnica qualitativa, com baixa sensibilidade, tendo sido descrita inicialmente para diagnóstico de ovos de Schistosoma mansoni. Atualmente a técnica é utilizada para identifi car a presen- ça de ovos de helmintos. Com coloração de lugol, é possível observar cistos de protozoários e larvas de helmintos (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Método para concentração de larva de helminto Baermann-Moraes, Rugai e Kato Helmintos (especialmente Strongyloides stercoralis). Figura 7. Método de Lutz ou Hoff man, Pons e Janer para concentração de parasitos. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 25/09/2020. Método para concentração de Método para concentração de larva de helminto Método para concentração de larva de helminto Método para concentração de larva de helminto Método para concentração de larva de helminto Método para concentração de larva de helminto Método para concentração de Método para concentração de Método para concentração de Baermann-Moraes, Rugai e Kato Baermann-Moraes, Rugai e Kato Baermann-Moraes, Rugai e Baermann-Moraes, Rugai e Baermann-Moraes, Rugai e Baermann-Moraes, Rugai e Baermann-Moraes, Rugai e Baermann-Moraes, Rugai e Helmintos (especialmente Helmintos (especialmente Strongyloides stercoralis Helmintos (especialmente Strongyloides stercoralis (especialmente Strongyloides stercoralis (especialmente Strongyloides stercoralisStrongyloides stercoralisStrongyloides stercoralisStrongyloides stercoralis). Lutz (1919) descreve o método da sedimentação espontânea do seguinte modo: O exame torna-se mais fácil pela lavagem repetida das fezes, seguida de sedimentação simples ou centrifugação. Com estas, combina-se o uso do tecido de arame e de gaze de moleiro para reter todos os corpos mais grossos. Assim obtém-se um sedi- mento que contém quase exclusivamente corpúsculos amilá- ceos e ovos de parasito, sendo fácil examinar (LUTZ, 2019, n.p.). Em 1934, a técnica foi padronizada por Hoff man, Pons e Janer. O método tem como objetivo diagnosticar parasitos intestinais pela concentração das formas pa- rasitárias. Apesar de ter mais de cem anos, o método continua sendo a principal forma de diagnóstico de parasitos intestinais. Isso porque apresenta um amplo es- PARASITOLOGIA CLINICA 67 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 67 14/12/2020 13:36:09 pectro e possibilita melhor visualização dos parasitos ou suas formas. Além disso, apresenta baixo custo e é de fácil execução (AZEVEDO et al., 2017; LIMA et al., 2019). Nesse método de Lutz ou Hoffman, Pons e Janer, as fezes suspensas em água são homogeneizadas e filtradas para retenção dos resíduos fecais maiores. Em seguida, a amostra é deixada para sedimentar espontaneamente por aproxima- damente duas horas. A Figura 8 resume os principais procedimentos técnicos para realização do método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (AZEVEDO et al., 2017; LIMA et al., 2019; RABELLO et al., 2008). Figura 8. Procedimento técnico do método de Lutz ou Hoffman, Pons, Janer. Fonte: LIMA, 2019; NEVES, 2010. (Adaptado). Método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz Dissolver bem com auxílio de um palito de sorvete descartável. 2 Acrescentar mais 20 mL de água. 3 Coar a suspensão com gaze em um coa- dor de plástico pequeno, em cálice cônico de 200 mL de capacidade. A gaze deve ser umedecida e dobrada em quatro. 4 Lavar os detritos retidos na gaze com mais 20 mL de água. 5 Completar o volume do cálice com água. 6 Deixar essa suspensão em repouso durante duas a 24 horas para formação de coluna de sedimentação. 7 Desprezar o líquido sobrenadante cuida- dosamente, homogeneizar o sedimento. 8 Coletar uma porção do sedimento e colocá-la em uma lâmina. Corar com lugol. O uso de lamínulas é facultativo. 9 Deve-se examinar, no mínimo, duas lâminas decada amostra. Após a análise, descartar o material com solução de hipoclorito de sódio a 1%. 10 Colocar 2 g de fezes em um frasco de vidro ou em um copo plástico descartável, com cerca de 5 mL de água. 1 PARASITOLOGIA CLINICA 68 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 68 14/12/2020 13:36:14 É importante destacar que existem inúmeros métodos de diagnóstico para parasitoses intestinais e que o método deve ser escolhido com base nas hipóte- ses diagnósticas. Para tanto, é relevante conhecer as diversas técnicas e buscar variações que possam facilitar a prática diária garantindo o melhor diagnósti- co. Na prática, observa-se a utilização de uma combinação de técnicas visando aumentar a acurácia diagnóstica. ASSISTA O método de sedimentação espontânea é um dos princi- pais métodos utilizados para diagnóstico de parasitoses intestinais. Para saber mais, assista ao vídeo Método de Hoffman - Parasitologia, que apresenta como esse méto- do é realizado na prática. PARASITOLOGIA CLINICA 69 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 69 14/12/2020 13:36:14 Sintetizando Nessa unidade, vimos que exame de fezes é um método rotineiro para identificação de parasitos intestinais. Geralmente, o exame parasitológico é solicitado em conjunto com a coprocultura para cultivo de microrganis- mos patogênicos. Além disso, permite avaliar as funções do sistema gas- trointestinal pela identificação de resíduos alimentares, gordura ou san- gue oculto. As parasitoses intestinais são importantes problemas de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento, que têm condições sanitárias inadequadas. O diagnóstico dessas parasitoses consiste na análise macro e mi- croscópica de amostras fecais, no intuito de identificar suas formas evolutivas: ovos, larvas, cistos, oocistos ou trofozoítos. Pudemos entender também que as amostras devem ser avaliadas ideal- mente logo após a evacuação. Como isso não é possível, em muitos casos exis- tem técnicas de conservação do espécime fecal. A escolha da técnica mais ade- quada é condicionada pela hipótese diagnóstica indicada pelo profissional de saúde que solicitou o exame e pela avaliação macroscópica. Como os parasitos intestinais e suas formas evolutivas são encontra- dos em pequenas quantidades, frequentemente são utilizados métodos de concentração dos parasitos. O método de sedimentação espontâneade Lutz é um dos principais métodos diagnósticos das parasitoses intestinais. Desde sua descrição, existem inúmeras modificações, como a proposta por Hoffman, Pons e Janer. O método é de fácil execução, baixo custo e boa sensibilidade a partir de fezes frescas ou preservadas. O diagnóstico das parasitoses intestinais geralmente é simples, mas exige precisão, conhecimento técnico e experiência do profissional que analisa as amostras. Ademais, é preciso que o paciente seja instruído de modo correto para que a coleta seja realizada adequadamente. A coleta inadequada pode inviabilizar toda a análise, fornecendo um diagnóstico incorreto. Por fim, vimos que, em muitos casos, observa-se o uso de tratamento empírico e profilático das parasitoses intestinais. Todavia, a medida não é recomendada, pois o uso generalizado dos medicamentos antiparasitários pode conduzir ao desenvolvimento de resistência, o que ocasiona a redu- PARASITOLOGIA CLINICA 70 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 70 14/12/2020 13:36:15 ção da eficácia. Por isso, é muito importante que ocorram investimentos em melhores técnicas laboratoriais de diagnóstico das parasitoses com melhor acurácia, assim como a correta instrução dos pacientes e dos pro- fissionais que atuam na análise. PARASITOLOGIA CLINICA 71 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 71 14/12/2020 13:36:15 Referências bibliográficas ADLER, P. M. Stool examination: culture versus Gram stain. Ann Emerg Med., v. 15, n. 3, pp. 337-341, mar. 1986. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/ s0196-0644(86)80580-7>. Acesso em: 16 set. 2020. AZEVEDO, E. P. et al. Diagnóstico parasitológico em amostras fecais no labo- ratório de análises clínicas: comparação de técnicas e custo de implantação. RBAC, out. 2017. Disponível em: <http://www.rbac.org.br/artigos/diagnostico- -parasitologico-em-amostras-fecais-no-laboratorio-de-analises-clinicas-com- paracao-de-tecnicas-e-custo-de-implantacao/>. Acesso em: 27 set. 2020. BRASIL. Ministério da Saúde. Caderneta de saúde da criança. 8. ed. Brasília, DF: Ministério da Saúde, 2013. Disponível em: <https://bvsms.saude.gov.br/bvs/ publicacoes/caderneta_saude_crianca_menino.pdf.>. Acesso em: 15 out. 2020. CARLI, G. A. Parasitologia clínica. São Paulo: Atheneu, 2001. CENTER FOR DISEASE CONTROL – CDC. Amebiasis. 2019. Disponível em: <ht- tps://www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html>. Acesso em: 24 set. 2020. FERNANDES, S. et al. Protocolo de parasitoses intestinais. Acta Pediátrica Por- tuguesa, v. 43, n. 1, pp. 35-41, 2012. Disponível em: <https://www.spp.pt/User- files/File/App/Artigos/32/20120530172157_Consensos_Fernandes%20S_43(1). pdf>. Acesso em: 22 nov. 2020. FERREIRA, A. W.; MORAES, S. L. Diagnóstico laboratorial das principais doen- ças infecciosas e autoimunes: correlações clínico-laboratoriais. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017. FISCHBACK, F. T.; FISCHBACK, M. A. Exames laboratoriais e diagnósticos em enfermagem: guia prático. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. KARSIGA, E. The importance of stool tests in diagnosis and follow-up of gastroin- testinal disorders in children. Turk Pediatri Ars, v. 54, n. 3, pp. 141-148, 2019. Disponível em: <https://www.doi.org/10.14744/TurkPediatriArs.2018.00483>. Acesso em: 23 set. 2020. LIMA, F. L. O. et al. Um século do exame parasitológico de Lutz e sua rele- vância atual. RBAC, 2019. Disponível em: <https://doi.org/10.21877/2448- 3877.201900908>. Acesso em: 23 set. 2020. LUTZ, A. O. Schistosomum mansoni e a Schistosomatose segundo observações, feitas no Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 11, n. 1, pp. 121-155, PARASITOLOGIA CLINICA 72 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 72 14/12/2020 13:36:15 1919. Disponível em: <https://doi.org/10.1590/S0074-02761919000100006>. Acesso em: 16 set. 2020. MAROJA, R. C.; LOWERY, W. D. Estudos sobre diarreias agudas: I. Eficácia rela- tiva da coprocultura comparada ao swab-retal no isolamento de Shigellas. Re- vista do Serviço Especial de Saúde Pública, v. 8, n. 2, pp. 577-583, dez. 1956. Disponível em: <encurtador.com.br/fwTX6>. Acesso em: 25 set. 2020. MÉTODO de Hoffman - Parasitologia. Postado por Tira o Jaleco. (2min. 30s.). son. color. port. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=1fkpa- 5kEkzk>. Acesso em: 31 out. 2020. MILLER, J. M. et al. A guide to utilization of the microbiology laboratory for diag- nosis of infectious diseases: 2018 update by the Infectious Diseases Society of America and the American Society for Microbiology. Clin Infect Dis., v. 67, n. 6, p. e1-e94, set. 2018. Disponível em: <https://doi.org/10.1093/cid/ciy381>. Aces- so em: 16 set. 2020. MOTTA, M. E. F. A.; SILVA, G. A. P. Diarréia por parasitas. Rev. Bras. Saúde Ma- ter. Infant., v. 2, n. 2. pp. 117-127, mai./ago. 2002. Disponível em: <https://doi. org/10.1590/S1519-38292002000200004>. Acesso em: 26 set. 2020. NEVES, D. P. Parasitologia humana. 11. ed. São Paulo: Atheneu, 2016. NEVES, P. A. Manual Roca de técnicas de laboratório: fezes. São Paulo: Roca, 2010. OUR WORLD IN DATA. Numbers of death by cause: world, 2017. 2017. Dispo- nível em: <https://ourworldindata.org/grapher/annual-number-of-deaths-by- -cause>. Acesso em: 27 set. 2020. PROCOP, G. W. Diagnóstico microbiológico. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2018. RABELLO, A. et al. Diagnóstico parasitológico, imunológico e molecular da Es- quistossomose mansoni. In: CARVALHO, O. S., COELHO, P. M. Z., LENZI, H. L. (Orgs.). Schitosoma mansoni e esquistossomose: uma visão multidisciplinar. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2008. REY, L. Bases da parasitologia médica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koo- gan, 2017. SILVA, C.H. P. M. Protocolos de microbiologia clínica: coprocultura. NewsLab, v. 86, p. 58-70, 2008. Disponível em: <https://www.newslab.com.br/wp-con- tent/uploads/yumpu_files/Especial%20microbiologia%20Pt.%201.pdf>. Aces- so em: 26 set. 2020. PARASITOLOGIA CLINICA 73 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 73 14/12/2020 13:36:15 SOCIEDADE BRASILEIRA DE PEDIATRIA – SBP. Departamento Científico de Pedia- tria Ambulatorial. Parasitoses intestinais (2019-2021), v. 4, 2020. Disponível em: <https://www.sbp.com.br/documentoscientificos/>. Acesso em: 25 set. 2020. SPILLER, R. C.; THOMPSON, W. G. Arq. Gastroenterol, v. 49, n. 1, pp. 39-50, 2012. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pi- d=S0004-28032012000500008&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 21 set. 2020. ZEIBIG, E. Parasitologia clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Elselvier, 2014. PARASITOLOGIA CLINICA 74 SER_FARMA_PARACLI_UNID2.indd 74 14/12/2020 13:36:15 MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS À PARASITOLOGIA PARA IDENTIFICAÇÃO DE HELMINTOS LABORATORIAIS APLICADOS À PARASITOLOGIA PARA IDENTIFICAÇÃO 3 UNIDADE SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 75 14/12/2020 14:12:14 Objetivos da unidade Tópicos de estudo Conhecer as funções e procedimentos do exame de fezes; Correlacionar os métodos diagnósticos recomendados para cada parasitose abordada; Reconhecer as diferenças entre os métodos diagnósticos de larvas, identificando as vantagens e desvantagens no uso de cada um. Introdução Parasitos intestinais Diagnóstico das parasitoses intestinais Método de Willis, Faust e cola- boradores Fundamentos e indicações Rotina laboratorial e procedi- mentos Método de Baermann-Moraes e de Rugai e colaboradores Fundamentos e indicações Rotina laboratorial e procedi- mentos Método de Harada e Mori Fundamento e indicações Rotina laboratorial e procedi- mentos PARASITOLOGIA CLINICA 76 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 76 14/12/2020 14:12:14 Introdução Este material foi elaborado com a intenção de auxiliar na compreensão dos métodos laboratoriais que são utilizados na prática, para diagnóstico de para- sitoses intestinais. É importante lembrar que, quando tratamos de diagnóstico laboratorial, precisamos compreender o habitat do parasito paraescolher a melhor técnica a ser utilizada, no caso, o intestino humano. As parasitoses intestinais podem ser causadas por protozoários ou por hel- mintos. Apesar de os sintomas das parasitoses serem muito semelhantes, o diagnóstico costuma se diferenciar de acordo com a forma parasitária encon- trada. Estas formas consistem em cistos, oocistos, trofozoítos, esporos, ovos, larvas ou fragmentos de vermes adultos. Focaremos no diagnóstico de ovos e larvas de helmintos, popularmente conhecidos como vermes. Parasitos intestinais Vejamos os principais parasitos identifi cados nas técnicas que serão estu- dadas nesta unidade. S. stercoralis É o agente etiológico de uma verminose denominada estrongiloidíase. Os prin- cipais sintomas da doença são diarreia, dor abdominal e gases. Em casos mais graves, pode ocorrer a forma disseminada e pulmonar (REY, 2015). Este helminto habita o intestino delgado de humanos. A forma adulta para- sitária é a fêmea partenogenética, com aproximadamente dois a três milímetros de comprimento. A fêmea elimina ovos no intestino, onde eclodem, liberando nas fezes as larvas rabditoides. No meio externo, essas larvas originam machos e fê- meas, com vida livre, sendo denominadas larvas fi larioides infectantes (REY, 2015). A larva rabditoide mede de 180-380 µm por 14-20 µm. Apresenta vestíbulo bucal curto e primórdio genital ovoide, grande e bem nítido. O esôfago apresenta dilatação nas extremidades e constrição na porção mediana, característico das larvas rabditoides. A cauda é afi lada. A larva fi larioide mede de 500-600 µm por 16 µm. Apresenta cauda bifur- cada (com entalhe). O esôfago é cilíndrico e retilíneo, típico das larvas fi larioi- des (REY, 2015). PARASITOLOGIA CLINICA 77 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 77 14/12/2020 14:12:14 Figura 1. Larvas de Strongyloides stercoralis: à esquerda, visualiza-se a larva rabditoide; à direita, visualiza-se a extremi- dade da larva filarioide. Ambas com aumento de 40 vezes. Fonte: LIMA; SANTOS; FRANZ. Acesso em: 03/12/2020. Ancilostoma duodenale / Necator americanus As duas espécies são nematelmintos, causadores da doença chamada ancilosto- míase intestinal humana, popularmente conhecida como amarelão. A fêmea adulta mede cerca de 1 cm de comprimento, sendo visível a olho nu (REY, 2015). Os vermes adultos têm como habitat o intestino delgado humano. Ali, absor- vem materiais diretamente do sangue, inclusive o oxigênio. Podem viver por longos períodos, com média entre quatro a oito anos. O quadro clínico mais comumente associado à infecção é a anemia, sendo mais grave em pessoas desnutridas. Depois da fecundação, são liberados entre 9.000 a 30.000 ovos diários nas fe- zes do hospedeiro. Quando eclodem, formam as larvas rabditoides, de vida livre no solo. Depois de aproximadamente uma semana, transformam-se em uma larva que pode penetrar a pele de humano, denominada larva filarioide infestante (REY, 2015). As larvas dos ancilostomídeos apresentam algumas características, que podem inclusive ser usadas para execução dos métodos parasitológicos. Destacam-se o geotropismo negativo, hidrotropismo, tigmotropismo e termotropismo (REY, 2015). Figura 2. Ancilostomídeos: à esquerda, visualiza-se a larva rabditoide de ancilostomídeo em montagem úmida; à direi- ta, observa-se o ovo de ancilostomídeo em montagem úmida. Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2019a. PARASITOLOGIA CLINICA 78 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 78 14/12/2020 14:12:16 Trichostrongylus orientalis Este parasito é um nematoide, causador da tricostrongilose. É capaz de infec- tar diversos grupos de animais, inclusive humanos. A maioria das infecções é assin- tomática. Quando são mais intensas, podem causar problemas gastrointestinais, como dores abdominais, diarreia, anorexia, além de dor de cabeça, fadiga, anemia e eosinofilia (Center for Disease Control and Prevention, 2019b). Os ovos do Trichostrongylus orientalis são eliminados nas fezes do hospedeiro definitivo. Em condições favoráveis, as larvas eclodem em alguns dias. As larvas rabditiformes liberadas crescem livremente no solo ou na vegetação. Após cinco a dez dias, se tornam larvas filariformes infectivas. A infecção do hospedeiro humano ocorre após a ingestão dessas larvas filariformes que atingem o intestino delgado, onde residem e amadurecem, até se tornarem adultos (Center for Disease Control and Prevention, 2019b). 100.00 μm Figura 3. Ovos de Trichostrongylus sp.: à esquerda, visualiza-se o ovo do Trichostrongylus sp.; à direita, observa-se o desenvolvimento da larva rabditoide no interior do ovo. Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2019b. DICA Para realizar o diagnóstico microscópico, é importante conhecer as for- mas parasitárias descritas, mas vale lembrar que o uso de reagentes ou a própria técnica em si pode alterar a morfologia do parasito. Portanto, de forma a ampliar seus conhecimentos no reconhecimento dos parasitos, indicamos a leitura da obra Atlas de parasitologia humana, publicada pela Universidade Estadual Paulista. PARASITOLOGIA CLINICA 79 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 79 14/12/2020 14:12:17 Diagnóstico das parasitoses intestinais O diagnóstico das parasitoses intestinais é basicamente laboratorial. Con- tudo, existem inúmeras difi culdades em função da coleta, que, normalmente, exige no mínimo três amostras em dias consecutivos para um diagnóstico ade- quado: a coleta deve ser realizada em recipiente apropriado, sem contato com contaminantes, como a água, urina ou solo; a conservação deve ser refrigera- da entre 3 a 5 ºC, no caso de fezes formadas; as fezes diarreicas necessitam ser examinadas em, no máximo, 30 minutos após a evacuação, caso contrário há rompimento dos trofozoítos, que impossibilitam o diagnóstico; alguns mé- todos exigem o uso de fezes frescas; os parasitos não apresentam liberação regular, tendo variações de acordo com cada espécie, logo, eventualmente no dia da coleta podem não ter formas parasitárias em número adequado para visualização; os parasitos se distribuem de forma irregular nas fezes, o que muitas vezes não permite sua visualização; e há difi culdade técnica por parte do microscopista, considerando que as formas parasitárias podem estar dis- torcidas pela conservação ou fi xação (CARLI, 2001; NEVES, 2011). Tendo em vista essas questões, foram desenvolvidas diversas técnicas de enriquecimento, com o objetivo de aumentar a concentração de parasitos e minimizar a chance de um diagnóstico equivocado. Esses métodos podem ser classifi cados como: • Sedimentação: os parasitos são concentrados no sedimento por gravidade ou centrifugação. Pode ser subclassifi cada em espontânea ou por centrifugação. Os principais métodos de sedimentação espontânea são: Lutz ou Hoff man, Pons e Janer, e os de sedimentação por centrifugação: Richie, Blagg (MIFC) e o Coprotest; • Flutuação: os parasitos fl utuam ou são condensados em um sedimento por meio de uma solução cuja densidade é diferente da sua; posteriormente são coletadas no fundo de um funil, como a técnica de Willis e de Faust; • Migração: método em que as larvas vivas migram para fora do material fecal e, posteriormente, são coletadas no fundo de um funil, como a técnica de Rugai (NEVES, 2011); • Cultura de larvas: visa aumentar a concentração das larvas para facilitar a observação e diagnóstico, como a técnica desenvolvida por Harada-Mori (NEVES, 2011). PARASITOLOGIA CLINICA 80 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 80 14/12/2020 14:12:17 A escolha do método mais adequado depende da hipótese diagnóstica. Vale ressaltar que nenhum método é totalmente eficaz para diagnosticar todas as formas parasitárias. Alguns métodos são gerais e permitem diag- nóstico de diversos parasitos simultaneamente. Outros são específicos, indicados para algum parasito particular. Como a maioria dos pedidos de exame parasitológico de fezes não inclui a suspeita clínica,recomenda-se a realização de um exame geral. Quando é solicitada a pesquisa de um parasito específico, deve-se realizar o teste geral, como de Hoffman, Pons e Janer, e também o método específico. Isso se justifica pela semelhança dos sintomas das parasitoses intestinais (NEVES, 2016). Nesta unidade, abordaremos um dos exames parasitológicos de fe- zes específicos, desenvolvido por Willis e modificado por Faust e colaboradores, para o diagnóstico de ovos, larvas e cistos. Em seguida, indicaremos os métodos de Baermann e de Rugai e o método da Harada-Mori. Observe, no Quadro 1, o resumo dos métodos que serão estu- dados, com seus princípios e as principais formas parasitárias encontradas. Método Princípio Forma parasitária visualizada/ principais parasitos Willis e Faust Flutuação Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Baermann e Rugai Migração de larvas Ovos e larvas S. stercoralis Harada-Mori Cultivo de larvas Larvas Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Willis e FaustWillis e FaustWillis e FaustWillis e FaustWillis e Faust Baermann e RugaiBaermann e RugaiBaermann e RugaiBaermann e RugaiBaermann e RugaiBaermann e Rugai Harada-Mori Flutuação Harada-Mori Flutuação Harada-Mori Flutuação Harada-Mori Migração de larvasMigração de larvasMigração de larvasMigração de larvas Larvas, cistos e ovos leves Migração de larvas Cultivo de larvas Larvas, cistos e ovos leves Trichostrongylus orientalis Migração de larvas Cultivo de larvas Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Cultivo de larvas Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Cultivo de larvas Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Cultivo de larvas Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Larvas, cistos e ovos leves Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Ovos e larvas Larvas, cistos e ovos leves Trichostrongylus orientalis Ovos e larvas S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Ovos e larvas S. stercoralis Ovos e larvas S. stercoralis Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Larvas Necator americanus Ancylostoma duodenale Trichostrongylus orientalis Larvas Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Necator americanus Ancylostoma duodenale S. stercoralis Trichostrongylus orientalis Ancylostoma duodenale Trichostrongylus orientalisTrichostrongylus orientalisTrichostrongylus orientalis QUADRO 1. MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS À PARASITOLOGIA QUE SERÃO ESTUDADOS NESTA UNIDADE Fonte: CARLI, 2001; REY, 2015. (Adaptado). PARASITOLOGIA CLINICA 81 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 81 14/12/2020 14:12:17 Métodos de Willis, Faust e colaboradores O método de Willis, baseado no processo de fl utuação em solução salina, foi elaborado inicialmente por Bass, em 1906, para recuperar ovos de ancilos- tomídeos presentes nas fezes. Faust e colaboradores aprimoraram a técnica pela alteração da solução de alta gravidade específi ca. A técnica modifi cada por Faust foi mais efi caz no sentido de não modifi car os cistos e ovos em um período de uma hora ou mais (FAUST e colaboradores, 1939). Fundamentos e indicações Fundamentos As técnicas de flutuação fundamentam-se na diferença de densidade específica entre os ovos, cistos e oocistos e o material fecal. As formas parasitárias flutuam na superfície dos reagentes de acordo com a den- sidade específica, separando-se com maior facilidade os detritos fecais (NEVES, 2016). Para realizar os procedimentos de flutuação, são utilizados reagentes de alta densidade para concentração das formas parasitárias. A densida- de específica dos ovos e cistos normalmente variam entre 1,05 a 1,15 g/ ml. Ovos com maior densidade (1,2 g/ml), como por exemplo de Clonor- chis e Opisthorchis, não podem ser separados pela técnica de flutuação. A densidade específica das soluções usadas para preparação (cloreto de sódio, de sacarose, de sulfato de zinco e de sulfato de magnésio) variam entre 1,18 a 1,26 g/ml (FAUST e colaboradores, 1939; NEVES, 2016). As principais vantagens nas técnicas de fl utuação são a formação, na super- fície do tubo, de uma membrana clara com poucos detritos fecais. Ademais, ocorre a remoção seletiva de ovos e cistos, inclusive quando estão presentes em pequena quantidade. A desvantagem da técnica é a alta densidade dos rea- gentes. Isso faz com que a parede dos ovos e cistos frequentemente se colap- sem, o que faz com que a aparência fi que distorcida (NEVES, 2016). A variação da densidade permite a visualização de ovos pequenos como os de trematódeos, como o Clonorchis sp. e o Heterophyes sp. A técnica, contudo, não permite isolar trofozoítos, ovos operculados e ovos pesados como os de PARASITOLOGIA CLINICA 82 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 82 14/12/2020 14:12:17 Ascaris lumbricoides, Taenia sp., Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica e Fascio- lopsis buski (NEVES, 2011). O método de Willis, modificado por Faust e colaboradores, fundamenta-se justamente no princípio da flutuação, em que os helmintos flutuam na superfí- cie de uma solução com densidade elevada (os corpos menos densos flutuam sobre a solução salina ou de sulfato de zinco) e se concentram no vidro do tubo. Desta forma, quanto menos densos os ovos, melhor é a separação, fazendo com que os ovos flutuem até asuperfície, onde entram em contato com a face inferior de uma lamínula de vidro, em razão do tigmotropismo. O procedimen- to é simples e eficaz, pois concentra e purifica a solução, facilitando a observa- ção microscópica (NEVES, 2016; REY, 2015). EXPLICANDO Tigmotropismo consiste em exercer influência por meio de contato sobre a direção que os tecidos tomam ao crescer. Na prática da parasitologia, isso quer dizer que há uma tendência das larvas de parasitos para crescerem ao redor de superfícies sólidas. No caso do método de Faust, o crescimen- to é ao redor da lâmina. Já no termotropismo, a influência ocorre por meio do calor sobre o protoplasma dos elementos dos tecidos, em especial sobre a direção ou o sentido de seu crescimento. Indicações O método de Willis é indicado para pesquisar ovos com densidade especí- fica baixa, tal como os de ancilostomídeos e de Trichostrongylus orientalis. Não é recomendado para ovos pesados de trematódeos, ovos de E. vermicularis e ovos inférteis de A. lumbricoides. Em geral, os métodos não são recomenda- dos para busca de cistos, visto que eles se retraem e ficam irreconhecíveis, impossibilitando o diagnóstico (NEVES, 2016). O método geral pode ser adaptado para análise mais abrangente ou es- pecífica, deixando a solução mais ou menos densa, para observar qualquer estrutura pouco densa para que ele se torne mais específico ou abrangente. Deve-se atentar na escolha da solução para que não altere morfologicamente os ovos (CARLI, 2001; NEVES, 2016). O método de Faust e colaboradores permite a visualização de alguns cis- tos, ovos e larvas. Assim como o método de Willis, ovos grandes de tremató- PARASITOLOGIA CLINICA 83 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 83 14/12/2020 14:12:17 deos, de cestoides e inférteis de A. lumbricoides não são concentrados (CARLI, 2001). As duas técnicas são impróprias para análise de amostras fecais que contenham grande quantidade de gorduras. No Quadro 2, você pode obser- var o resumo das principais formas que são observadas ou não nos métodos de Willis e Faust e colaboradores. Método Recomendado Não recomendado Método de Willis Ovos com densidade específi ca baixa Ovos pesados de trematódeos Ancilostomídeos Ovos de E. vermicularis Trichostrongylus orientalis Ovos inférteisde A. lumbricoides Amostras com gordura Método de Faust e colaboradores Cistos Ovos grandes de trematódeos Ovos Ovos grandes de cestoides Larvas Amostras com gordura densidade específi ca baixadensidade específi ca baixa Ovos com densidade específi ca baixa Ovos com densidade específi ca baixa Ovos com densidade específi ca baixa Ancilostomídeos densidade específi ca baixa Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis densidade específi ca baixa Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis densidade específi ca baixa Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis densidade específi ca baixa Ancilostomídeos Trichostrongylus orientalis Ovos pesados de trematódeos Trichostrongylus orientalis Ovos pesados de trematódeos Trichostrongylus orientalis Cistos Ovos pesados de trematódeos Trichostrongylus orientalis Cistos Ovos pesados de trematódeos Trichostrongylus orientalis Ovos Ovos pesados de trematódeos Ovos de Ovos inférteis de Ovos Larvas Ovos pesados de trematódeos Ovos de Ovos inférteis de Larvas Ovos pesados de trematódeos Ovos de Ovos inférteis de Ovos pesados de trematódeos E. vermicularis Ovos inférteis de Amostras com gordura Ovos pesados de trematódeos E. vermicularis Ovos inférteis de Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos pesados de trematódeos E. vermicularis Ovos inférteis de A. lumbricoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos E. vermicularis A. lumbricoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides A. lumbricoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides A. lumbricoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides Amostras com gordura A. lumbricoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides Amostras com gordura Ovos grandes de trematódeos Ovos grandes de cestoides Amostras com gordura Ovos grandes de cestoides Amostras com gorduraAmostras com gordura QUADRO 2. FORMAS PARASITÁRIAS QUE PODEM OU NÃO SER VISUALIZADAS NOS MÉTODOS DE WILLIS, FAUST E COLABORADORES Fonte: CARLI, 2001; REY, 2015. (Adaptado). Rotina laboratorial e procedimentos Rotina laboratorial Vejamos, então, os procedimentos técnicos dos métodos de Willis e sua modificação, desenvolvida por Faust e colaborado- res. Não esqueça de, antes de iniciar o procedimen- to, preparar o Equipamento de Proteção (EPI) adequado. As fezes são consideradas materiais contaminantes. Além disso, nos métodos para diagnóstico de formas larvárias, há um risco acrescido, pois as larvas são móveis, aumentando o risco de contaminação. PARASITOLOGIA CLINICA 84 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 84 14/12/2020 14:12:18 Figura 4. Use sempre os Equipamentos de Proteção Individual (EPI). Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 30/11/2020. DICA Para garantir a segurança, durante a execução de todos os métodos que serão descritos nesta unidade, deve-se utilizar todos os Equipamentos de Proteção Individual recomendados, pois serão manuseados materiais biológicos possivelmente contaminados. Lembre-se que os métodos direto e a fresco conferem maior risco de contaminação. Você deve usar, no mínimo, luvas, óculos de proteção e jaleco. Para aprimorar seus conheci- mentos sobre segurança de laboratório, recomendamos a leitura do livro Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde, elaborado pela Fundação Oswaldo Cruz. Materiais Para elaboração dos procedimentos dos métodos de Willis, Faust e co- laboradores, selecione previamente o material necessário (CARLI, 2001; NEVES, 2016): • Alça de platina; • Bastão de vidro; • Centrífuga; • Cloreto de sódio ou sulfato de zinco em cristais – a depender da téc- nica utilizada; • Copo plástico ou de vidro; • Corante lugol; • Estante de tubos; • Gaze; • Lâmina; PARASITOLOGIA CLINICA 85 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 85 14/12/2020 14:12:26 • Lamínula; • Microscópio; • Peneira descartável ou metálica; • Proveta de 10 ml; • Tubo de centrífuga com fundo redondo. Amostra Além disso, para preparação do método de Willis, deve-se utilizar fezes não preservadas, ou seja, frescas. Para o método de Faust, prefere-se também o uso de fezes não preservadas. Contudo, há possibilidade de utilização de material pre- servado com APV, SAF e formalina (CARLI, 2001). Procedimentos Técnica de Willis A técnica de Willis é preparada a partir de material fecal não preservado, uti- lizando a solução de cloreto de sódio (NaCl) com densidade específica de 1,20 g/ ml (NEVES, 2016). Para preparação da solução saturada de cloreto de sódio (densi- dade específica de 1,20 g/ml), deve-se realizar as etapas descritas no Diagrama 1. DIAGRAMA 1. PASSOS PARA PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE CLORETO DE SÓDIO Fonte: NEVES, 2016. Adicionar NaCl em água destilada deionizada ou água corrente quente ou água em ebulição até que o excesso acrescentado não se dissolva mais na solução. A densidade específica deve ser controlada e ajustada com o auxílio de um densitômetro (1,20 g/mL). Filtrar a solução em papel-filtro. Preparação da solução de cloreto de sódio NaCl PARASITOLOGIA CLINICA 86 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 86 14/12/2020 14:12:26 Procedimentos técnicos do método de Willis A rotina laboratorial geralmente está relacionada com uma se- quência de procedimentos elaborados e validados previamen- te. É preciso estar familiarizado com os passos para aplicar corretamente e com segurança cada etapa. É essencial atentar para os requisitos de seguran- ça, lembrando que há risco de contaminação com o material fecal e com muitos dos reagentes tóxicos utilizados nos métodos parasitológicos. Para realizar o método de Willis, é preciso seguir os seguintes procedi- mentos (NEVES, 2016): • Usar luvas durante todas as etapas do procedimento técnico; • Selecionar porções de fezes frescas de várias partes do bolo fecal; • Selecionar aproximadamente 1 a 2 g de fezes; • Colocar o material em um recipiente de vidro de 3 cm de diâmetro e com capacidade média de 20 ml; • Preencher ¼ da capacidade do recipiente com a solução saturada de cloreto de sódio (NaCl); • Suspender o material fecal em solução saturada salina, até ocorrer total homogeneização; • Importante lembrar: caso a homogeneização do material não seja completa, os ovos não flutuam na superfície do reagente; • Completar o volume; • Colocar uma lâmina ou lamínula sobre a borda do recipiente; • A lamínula deve permanecer em contato com o menisco durante apro- ximadamente 30 a 45 minutos. A flutuação não deve ser menor do que 30 minutos, nem maior que 60 minutos, pois os ovos podem descer para o fundo do recipiente; • Não pode ocorrer formação de bolhas de ar entre a lamínula e a su- perfície do líquido; • Caso o material fecal esteja infectado, a gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula; • Remover a lamínula e inverter rapidamente sua posição sobre uma lâmina; • Realizar a análise microscópica com objetiva de menor aumento. PARASITOLOGIA CLINICA 87 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 87 14/12/2020 14:12:26 Técnica de Faust A técnica de Willis foi modificada por Faust e colaboradores com a substi- tuição da solução saturada de cloreto de sódio pelo sulfato de zinco (ZnSO4). A solução de sulfato de zinco é preparada na densidade de 1,18 g/ml para fezes frescas (CARLI, 2001; NEVES, 2016). Idealmente, a técnica deve ser realizada utilizando material fresco não pre- servado. É possível preparar o material com fezes preservadas em formaldeí- do, a 5% ou 10%, tamponado ou não tamponado, com SAF ou com fixador APV. Todavia, o uso dos fixadores pode aumentar a densidade específica, provocan- do distorção dos organismos avaliados (CARLI, 2001; NEVES, 2016). Preparaçãoda solução de sulfato de zinco (ZnSO4) A preparação da solução saturada de sulfato de zinco (densidade es- pecífica de 1,18 g/ml) deve ser realizada de acordo com as etapas descri- tas no Diagrama 2. DIAGRAMA 2. PASSOS PARA PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO Fonte: NEVES, 2016. Preparação da solução de sulfato de zinco (ZnSO4) Acrescentar em um recipiente 330 g de cristais de sulfato de zinco e 670 mL de água destilada deionizada. A densidade é crítica e deve ser ajustada com o auxílio de um densitômetro pela adição de sal ou água. Filtrar a solução em papel-filtro. PARASITOLOGIA CLINICA 88 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 88 14/12/2020 14:12:26 Procedimentos técnicos do método de Faust Para realizar o método de Faust, o profi ssional deve seguir os procedimen- tos (SIQUEIRA-BATISTA; GOMES; SANTANA, 2020): • Usar luvas durante todas as etapas do procedimento técnico; • Dissolver 5 g de fezes em cerca de 10 ml de água, com auxílio de um bastão de vidro; • Filtrar a suspensão com as fezes em uma gaze dobrada; • Centrifugar a amostra (1.500 rotações por minuto, por 2 minutos); • Desprezar o líquido sobrenadante e suspender o resíduo em 10 ml de água; • Repetir os passos anteriores até que o sobrenadante se torne claro; • Adicionar 10 ml de solução de sulfato de zinco (ZnSO4); • Homogeneizar a solução e centrifugar novamente; • Recolher a película superfi cial e depositar na lâmina; • Adicionar uma gota de lugol; • Observar ao microscópio com as objetivas de 100 e 400 vezes. Para assegurar um bom diagnóstico, é preciso manter um controle de qua- lidade das técnicas de fl utuação. Para isso, deve-se avaliar os tópicos descritos no Quadro 3. QUADRO 3. CHECKLIST DOS TÓPICOS QUE DEVEM SER AVALIADOS PARA GARANTIR A QUALIDADE DO MÉTODO Conferir os reagentes A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Calibração da centrífuga Preferencialmente a cada três meses. Calibração do microscópio O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. Densitômetro A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Registro Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Resultado do exame O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico Método: Faust Resultado: positivo para ovos de Trichostrongylus orientalis Valor de referência: ausência de parasitos ou negativo. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência clara, sem contaminação visível. Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser calibrados anualmente. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência Preferencialmente a cada três meses. O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico Método Resultado A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico Método Resultado Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico : Faust Resultado Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico : Faust Resultado Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada comdensitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico : positivo para ovos de Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência O micrômetro ocular e o microscópio devem ser A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: Exame microscópico : positivo para ovos de Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: : positivo para ovos de Valor de referência A solução salina e a solução de sulfato de zinco devem ter aparência A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: : positivo para ovos de Valor de referência: ausência de parasitos ou negativo. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia visualizada, como mostra o exemplo: : positivo para ovos de : ausência de parasitos ou negativo. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia : positivo para ovos de : ausência de parasitos ou negativo. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia : positivo para ovos de Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. A densidade da solução de sulfato de zinco é crítica, devendo ser ajustada com densitômetro, com adição de sal ou água. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. O resultado sempre deve indicar a espécie encontrada e a morfologia Trichostrongylus orientalis : ausência de parasitos ou negativo. Fonte: NEVES, 2016. (Adaptado). PARASITOLOGIA CLINICA 89 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 89 14/12/2020 14:12:27 Métodos de Baermann-Moraes, de Rugai e colaboradores Este método foi criado inicialmente por Baermann e Moraes, em 1917, para pesquisa de larvas em fezes frescas, sem conservantes. Foi modifi cada por Ru- gai, Mattos e Brisola, em 1954. É um dos métodos mais utilizados e descritos para pesquisa de larvas de helmintos (NEVES, 2016). Fundamento e indicações Fundamento O método de Baermann-Moraes, simplificado por Rugai e colabora- dores, também conhecido como método de extração de larvas da massa fecal, fundamenta-se no hidrotropismo e no termotropismo positivo das larvas de nematoides. É um método simples e de fácil execução. Sua eficá- cia é decorrente do uso de um volume grande de material fecal. O material é colocado sobre uma gaze, acima de um recipiente contendo água aque- cida. Pelas propriedades descritas, as larvas migram pela gaze, e assentam no fundo da taça. Isso faz com que o excesso de resíduos fecais seja removido facilmente. Em se- guida, deve-se analisar o sedimento no fundo do recipiente, com maior concentração de larvas, caso presentes. O diagnóstico diferencial é realizado pela coloração com lugol (CARLI, 2001; REY, 2017; SIQUEIRA-BATISTA; GOMES; SANTANA, 2020). Suas principais vantagens são a simplicidade e rapidez na execução. Como desvantagens, apresentam-se a necessidade de fezes frescas e a chance de contaminação do microscopista em função da motilidade das lar- vas (NEVES, 2016). Indicações Os métodos são eficazes para visualização de larvas, especialmente de Strongyloide stercoralis. Para identificar larvas rabditoides, recomen- da-se o uso de três a cinco amostras de fezes, colhidas em dias alterna- dos (CARLI, 2001). PARASITOLOGIA CLINICA 90 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 90 14/12/2020 14:12:27 Estudos apontam que, com uma única coleta, a chance do erro para diagnosticar a presença de larvas é de até 70%. Com três amostras, a sensibilidade melhora para 50%, chegando a quase 100% com sete amos- tras (NEVES, 2016). Em casos de alta carga parasitária, em fezes diarrei- cas, é possível visualizar, além das larvas, os ovos de Strongyloide stercoralis. As larvas de filarioi- des podem ser ocasionalmente identifica- das em fezes envelhecidas ou com ritmo in- testinal lento, e em fezes frescas, nos casos de hiperinfecção. Rotina laboratorial e procedimentos Rotina laboratorial Materiais Para realizar o método de Baermann-Moraes e Rugai, é preciso selecio- nar antecipadamente os seguintes materiais: • Aparelho de Baermann-Moraes; • Cálice de sedimentação; • Centrífuga; • Corante lugol; • Funil de vidro ou plástico, com aproximadamente 10 cm de diâmetro e suporte; • Gaze; • Lâmina; • Lamínula; • Microscópio; • Peneira descartável ou metálica; • Pinça de Hoff mann; • Tela metálica; • Tubo de centrífuga de fundo cônico (CARLI, 2001; HARADA; MORI, 1955; NEVES, 2016). PARASITOLOGIA CLINICA 91 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 91 14/12/2020 14:12:27 A B C Figura 5. Aparelho de Baermann-Moraes: (A) funil e tubo de borracha com pinça de Mohr; (B) funil com peneira de arame; (C) gaze contendo fezes. Fonte: CARLI, 2001, p. 116. Amostra Para realização do método de Baermann e Rugai, é necessário utilizar fezes não preservadas, ou seja, frescas. As fezes armazenadas e refrigera- das não podem ser utilizadas (CARLI, 2001). Procedimentos Os métodos de Baermann e Rugai apresentam muitas semelhanças. Inicialmente será apresentado o método de Baermann, e, em seguida, o de Rugai, com suas alterações. Para realização do método de Baermann- -Moraes, adaptado para extração de larvas, os procedimentos são (RUGAI; MATTOS; BRISOLA, 1954): • Usar luvas durante todas as etapas do procedimento técnico; • Ligar o funil à haste com a ponta de uma pipeta, por meio de um tubo de borracha que se mantém fechado aplicando uma pinça de Hoffman; • Colocar o funil em suporte adequado; • Sobre o funil, colocar uma tela metálica; • Depositar cerca de 8 a 10 g de fezes, protegidas por umretalho de gaze dobrado quatro vezes; • Encher o funil com água a 40 a 42 °C. A quantidade deve ser suficiente para que as fezes fiquem parcialmente submersas; • Deixar em repouso por uma hora; PARASITOLOGIA CLINICA 92 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 92 14/12/2020 14:12:28 • As larvas, estimuladas por termo e hidrotropismo positivo, acumulam-se no tubo de borracha; • Abrir a pinça e coletar o líquido; • Examinar ao microscópio com aumento inicial da objetiva de 10 vezes, e depois de 40 vezes. Para realizar o método de Rugai e colaboradores, que é uma simplificação do método de Baermann-Moraes, é preciso seguir os procedimentos abaixo: • Usar luvas durante todas as etapas do procedimento técnico; • Selecionar uma porção da amostra fecal contendo aproximadamente 8 a 10 g; • Colocar uma gaze dobrada em dois ou em quatro em uma peneira; • Colocar o material, com a abertura voltada para baixo, em um cálice de sedimentação contendo água a 45 ºC. A quantidade de água deve ser suficiente para tocar as fezes; • Deixar em repouso por uma a duas horas; • Coletar aproximadamente 5 a 7 ml da água com auxílio de uma pipeta; • Colocar o material em um tubo de centrífuga, abrindo-se a pinça; • Centrifugar o material com a rotação de 1.000 rpm por um minuto; • Coletar o sedimento de forma a não desprezar o líquido sobrenadante. Deve-se coletar as larvas no fundo do recipiente; • Examinar inicialmente ao microscópio com objetiva de 10 vezes; • Corar a preparação com uma gota de solução de iodo de lugol; • Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula no microscópio óptico, com a objetiva de 40 vezes, para identificação do parasito (NEVES, 2016; RUGAI; MATTOS; BRISOLA, 1954). Figura 6. Método de Rugai e colaboradores. Fonte: NEVES, 2016, p. 460. PARASITOLOGIA CLINICA 93 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 93 14/12/2020 14:12:28 Lembre-se que a observação da morfologia é mais difícil quando a larva se encontra em movimento. Para facilitar a observação, é preciso matar as larvas, aquecendo levemente a solução ou adicionando uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído (NEVES, 2016). Método de Harada e Mori O método de Harada-Mori, também conhecido como cultura no papel-fi ltro em tubo de ensaio ou coprocultura de larvas, baseia-se na identifi cação micros- cópica de larvas de nematoides que emergem de amostras fecais cultivadas no papel-fi ltro em tubo de ensaio. É um método que requer menor quantidade de fezes do que os outros, ideal para inquéritos parasitológicos em massa. É de fá- cil execução e leitura, sendo comumente utilizado para diagnóstico diferencial de Strongiloydes sp. e outras larvas (CARLI, 2001; REY, 2017). Fundamento e indicações Fundamento A técnica foi modifi cada por Sasa e Hsieh e seus respectivos colaboradores, com o objetivo de facilitar o exame de grande quantidade de amostras, como em inquéritos epidemiológicos. A técnica de cultivo visa a amplifi car o número de larvas rabditoides pela reprodução das formas de vida livre adultas, e, assim, aumentar a probabilida- de de identifi car as larvas causadoras da estrongiloidíase. Contudo, algumas cepas de S. stercoralis não conseguem se desenvolver in vitro, o que difi culta o diagnóstico por este método (SANTOS; PADILHA FILHO, 1996). Uma das grandes vantagens da técnica é que as larvas podem ser obtidas em um fl uido livre de resíduos fecais, e não requer grande espaço ou aparelhos complicados. Como desvantagem, cita-se a necessidade do uso de fezes fres- cas e o tempo para o diagnóstico (HARADA; MORI, 1955). Indicações O procedimento é especialmente útil no diagnóstico de infecções humanas pelo Necator americanus, Ancylostoma duodenale, S. stercoralis e Trichostrongylus orientalis (CARLI, 2001). PARASITOLOGIA CLINICA 94 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 94 14/12/2020 14:12:28 O método pode ser usado para S. stercoralis, contudo, apresenta baixa sen- sibilidade (aproximadamente 30% com uma coleta). Rotina laboratorial Rotina laboratorial Materiais Para preparação do método de Harada-Mori, é necessário preparar os se- guintes materiais: • Banho-maria; • Centrífuga; • Corante lugol; • Estufa; • Fita de papel-fi ltro (15 x 1 cm ou 15 x 2 cm); • Lâmina; • Lamínula; • Microscópio; • Pipeta longa; • Rolha de borracha ou papel de celofane ou de polietileno; • Tubo de centrifugação; • Tubo cônico de centrífuga; • Tubo de ensaio (CARLI, 2001; HARADA; MORI, 1955; NEVES, 2016). Amostra Para a realização do método de Harada-Mori, é preciso utilizar fezes não preservadas, ou seja, frescas (CARLI, 2001). Procedimentos Com o material preparado, deve-se seguir os procedimentos para realizar a técnica proposta por Harada-Mori: • Usar luvas durante todas as etapas do procedimento técnico; • Preparar uma fi ta de papel-fi ltro com uma dobradura no meio; • Espalhar 0,5 g de fezes frescas no papel-fi ltro, formando um esfregaço fecal fi no e uniforme em um dos lados da fi ta; • Deixar 2 cm do papel de cada extremidade sem material fecal; • Introduzir a fi ta de papel-fi ltro em tubo de ensaio ou em um tubo cônico de PARASITOLOGIA CLINICA 95 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 95 14/12/2020 14:12:28 centrífuga, de maneira que a água não entre em contato com as fezes; • Fechar o tubo com rolha de borracha; • Deixar descansar, em posição vertical, por 10 a 14 dias, em temperatura de 25 a 30 °C; • Para prevenir a dessecação, pode-se substituir a rolha de borracha por um papel de celofane ou de polietileno, fixado por meio de um anel de borracha; • A água é puxada por atração capilar sobre todo o papel de filtro; • No fim do período de incubação, colher a água do fundo do tubo com o auxílio de uma pipeta; • As pontas das tiras não devem ser cortadas abruptamente, pois podem se soltar e tornar a água turva; • Observar, em microscópio invertido, para identificar a presença de larvas; • Em caso positivo, retirar a rolha e, em seguida, o papel-filtro; • Colocar o tubo em banho de água a 50 °C durante 15 minutos para matar as larvas; • Transferir a água para um tubo de centrifugação e centrifugar - 500 x g por um minuto; • Decantar e colocar as larvas em uma lâmina; • Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento (CARLI, 2001; HARADA; MORI, 1955; NEVES, 2016). Fezes Água Papel-filtro Figura 7. Método de Harada e Mori para a cultura de larvas de nematoides nas fezes (em tubo de ensaio). Fonte: CARLI, 2001, p. 120. PARASITOLOGIA CLINICA 96 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 96 14/12/2020 14:12:28 Por fi m, vejamos algumas orientações gerais para os métodos diagnósti- cos de helmintos estudados. No infográfi co apresentado no Quadro 4, é pos- sível observar alguns lembretes importantes que garantem a segurança e a melhor visualização das larvas e ovos. DICA Para saber mais e treinar suas habilidades visando a uma capacitação profi ssional atualizada, acesse o website do Center for Disease Control and Prevention (CDC). Men- salmente são postadas fotos de parasitos, associados a um estudo de caso, para que o profi ssional teste a pró- pria capacidade de identifi car os parasitos e associá-los a um quadro clínico. QUADRO 4. LEMBRETES IMPORTANTES SOBRE O MÉTODO DIAGNÓSTICO DE HELMINTOS 1. Temperatura Os ovos do Necator americanus morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. 2. Inverno No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. 3. Volume de água Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. 4. Movimentos das larvasO movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. 5. Contaminação Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. 6. Risco de infecção Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. Os ovos do Os ovos do nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o Os ovos do nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. Os ovos do Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água Necator americanus nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas condições de umidade. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídricoconcentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o material em temperatura de 10 a 25 °C, com ótimas No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. morrem após 24 horas da eliminação nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução de iodo de lugol/formaldeído. Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. nas fezes, caso armazenadas em temperatura de zero grau. Manter o No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente defi ciência do oxigênio dissolvido e morte das larvas. Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para cima ou para baixo. No inverno, a média de isolamento de larvas é menor. A dessecação deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para deteriora a cultura. Se o esfregaço fi car imerso na água, as bactérias e leveduras proliferarão no substrato, havendo uma consequente Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. O movimento das larvas difi culta sua observação. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água favorece a contaminação, devido ao contato com as fezes. Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se hácontaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Quando pequenas quantidades de água são usadas, poucas larvas emergem em função da dessecação. Grande quantidade de água Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; larvas parasitas permanecem vivas por 24 horas. Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Para matá-las, aquecer levemente ou adicionar uma gota de solução Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; Cuidado ao transportar o líquido e a tira de papel-fi ltro. As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Se há contaminação: adicionar 0,3 ml de ácido clorídrico concentrado para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para para cada 10 ml de água contendo as larvas. Larva vida livre morrem; As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para As larvas infectantes podem migrar para a tira de papel-fi ltro, para Fonte: NEVES, 2011. Lembre-se que a escolha da técnica a ser implementada no laboratório envolve inúmeros fatores, como custo, equipamentos, habilidades do micros- copista, dentre outros. Antes de optar por uma técnica específi ca, analise as vantagens e desvantagens de cada uma delas. PARASITOLOGIA CLINICA 97 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 97 14/12/2020 14:12:29 Método Vantagens Desvantagens Faust Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas parasitárias. Rugai Simplicidade e rapidez na execução. Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Harada-Mori Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de material fecal. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. FaustFaust Flutuação dos parasitos em Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos Rugai Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e Rugai Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora Harada-Mori Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora Harada-Mori Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. Harada-Mori Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. Simplicidade e rapidez Harada-Mori Flutuação dos parasitos em uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. Simplicidade e rapidez uma membrana com poucos detritosRemoção de ovos e cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. Simplicidade e rapidez na execução. Não requer grandes equipa- cistos. Pode utilizar fezes preservadas, embora não seja o ideal. Simplicidade e rapidez na execução. Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido A alta densidade dos reagentes Simplicidade e rapidez na execução. Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido Requer menor quantidade de A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas Simplicidade e rapidez na execução. Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas Simplicidade e rapidez Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de material fecal. A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas parasitárias. Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de material fecal. A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas parasitárias. Necessidade do uso de fezes Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de material fecal. A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas parasitárias. Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Não requer grandes equipa- mentos e obtém um fl uido sem resíduos fecais. Requer menor quantidade de material fecal. A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas parasitárias. Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Requer menor quantidade de A alta densidade dos reagentes pode distorcer as formas Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Requer menor quantidade de Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade do uso de fezes frescas e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. contaminaçãodo microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. Necessidade de uso de fezes frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. frescas, tempo e alta chance de contaminação do microscopista. QUADRO 5. VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS DE FAUST, RUGAI E HARADA-MORI Fonte: CARLI, 2010; NEVES, 2011, 2016. (Adaptado). Além disso, vale lembrar que, para garantia de um melhor re- sultado, normalmente é recomendada a associação de téc- nicas, com fundamentos diferentes. Para melhorar suas habilidades e competências, busque mais informa- ções, aprofunde seu conhecimento e estude variações dos métodos. PARASITOLOGIA CLINICA 98 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 98 14/12/2020 14:12:29 Sintetizando Nesta unidade, abordamos alguns dos métodos diagnósticos de enteroparasi- tose causada por helmintos. Este diagnóstico pode ser realizado por métodos imu- nológicos, capazes de realizar uma triagem inicial dos parasitos. Contudo, devido ao elevado valor, dá-se preferência aos métodos tradicionais, com observação do parasito ou de suas formas, por técnicas de microscopia óptica. Os métodos parasitológicos apresentam como principais fundamentos a sedi- mentação, a flutuação e a migração de larvas. Normalmente, utiliza-se um método geral, como o de Lutz ou Hoffman, Pons e Janer e um teste mais específico, de acordo com a hipótese diagnóstica. O método de Willis, posteriormente modificado por Faust e colaboradores, baseia-se na flutuação, e a diferença entre a densidade específica das formas pa- rasitárias permite o diagnóstico. O método de Willis utiliza a solução de cloreto de sódio como reagente de alta densidade, e o método de Faust e colaboradores, o sulfato de zinco. O método de Willis é eficaz para detecção de ovos com densidade específica baixa (ancilostomídeos e de Trichostrongylus orientalis). Já no método de Faust e colaboradores visualizam-se cistos, ovos e larvas. Os métodos de Baermann e Rugai têm como objetivo a extração de larvas da massa fecal, fundamentando-se nos princípios do hidrotropismo e no termotro- pismo positivo das larvas de nematoides. São ideais para avaliação parasitológica em massa. São muito eficazes para detecção de larvas Strongyloide stercoralis. O método de Harada-Mori fundamenta-se na cultura de larvas de parasitos, especialmente de Strongyloide stercoralis. É um método muito prático, mas requer o uso de fezes frescas e demora muitos dias para obtenção do diagnóstico. PARASITOLOGIA CLINICA 99 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 99 14/12/2020 14:12:29 Referências bibliográficas CARLI, G. A. Parasitologia clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. São Paulo: Atheneu, 2001. CDC - CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. DPDx - Laboratory Iden- tification of Parasites of Public Health Concern. Hookworm (Intestinal). Atlanta, 2019a. Disponível em: <https://www.cdc.gov/dpdx/hookworm/index.html>. Acesso em: 06 out. 2020. CDC - CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). DPDx - Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern. Trichostrongylosis. Atlanta, 2019b. Disponível em: <https://www.cdc.gov/dpdx/trichostrongylosis/index.html>. Acesso em: 06 out. 2020. CDC - CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). DPDx - Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern. Monthly case studies. Atlanta, 2020. Disponível em: <https://www.cdc.gov/dpdx/monthlycasestudies/2020/index. html>. Acesso em: 06 out. 2020. FAUST, E. C.; SAWITZ, W.; TOBIE, J.; ODOM, V.; PERES, C; LINCICOME, D. R. Compa- rative efficiency of various technics for the diagnosis of protozoa and helminths in feces. The Journal of Parasitology, [s.l.], v. 25, n. 3, pp. 241-262, 1939. Disponível em: <https://doi.org/10.2307/3272508>. Acesso em: 05 out. 2020. HARADA, Y.; MORI, O. A new method for culturing hookworm. Yonago Acta Medici- ne, Yonago, v. 1, n. 3, pp. 177-179, 1955 Disponível em: <https://www.cabdirect.org/ cabdirect/abstract/19562900514>. Acesso em: 05 out. 2020. LIMA, L. M.; SANTOS, J. I.; FRANZ, H. C. F. Fotografias em microscópio - Larvas de Strongyloides stercoralis. Atlas de parasitologia clínica e doenças infecciosas as- sociadas ao sistema digestivo. Santa Catarina, [s.d.]. Disponível em: <https://pa- rasitologiaclinica.ufsc.br/index.php/info/conteudo/fotografias/larvas-sstercoralis/>. Acesso em: 05 out. 2020. MOLINARO, E. M; CAPUTO, L. F. G.; AMENDOEIRA, M. R. R. (Org.). Conceitos e méto- dos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 2009, vol. 1. Disponível em: <http://www.epsjv.fiocruz.br/ sites/default/files/l140.pdf>. Acesso em: 06 out. 2020. NEVES, D. P. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016. NEVES, P. A. Manual Roca de técnicas de laboratório: fezes. São Paulo: Roca, 2011. PARASITOLOGIA CLINICA 100 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 100 14/12/2020 14:12:29 REY, L. Bases da parasitologia médica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015. RUGAI, E.; MATTOS, T.; BRISOLA, A. P. Nova técnica para isolar larvas de nematoi- des das fezes – modificação do método de Baermann. Revista do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v. 14, n. 1, pp. 05-08, 1954. Disponível em: <http://www.ial.sp.gov.br/ resources/insituto-adolfo-lutz/publicacoes/rial/50/rial-141_1954/rial141_completa. pdf>. Acesso em: 01 out. 2020. SANTOS, J. I.; PADILHA FILHO, O. Baixa sensibilidade do método de cultura de larvas (harada-mori) no diagnóstico da estrongiloidíase. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Uberaba, v. 29, n. 1, pp. 51-52, 1996. Disponível em: <https:// doi.org/10.1590/S0037-86821996000100010>. Acesso em: 05 out. 2020. SILVA, R. J.; ANGULSKI, L. R. F. B.; TAVARES, D. F.; SERRA, L. M. M. Atlas de parasi- tologia humana. São Paulo: Unesp, 2009. Disponível em: <https://www.ibb.unesp. br/Home/ensino/departamentos/parasitologia/atlas_parasitologia_humana.pdf>. Acesso em: 06 out. 2020. SIQUEIRA-BATISTA, R.; GOMES, A. P.; SANTANA, L. A. Parasitologia: fundamentos e prática clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2020. PARASITOLOGIA CLINICA 101 SER_FARMA_PARACLI_UNID3.indd 101 14/12/2020 14:12:29 MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS À PARASITOLOGIA 4 UNIDADE SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 102 16/12/2020 13:13:56 Objetivos da unidade Tópicos de estudo Conhecer as funções e procedimentos do exame de fezes; Correlacionar os métodos diagnósticos recomendados para cada parasitose; Identificar as vantagens e desvantagens de cada método parasitológico. Introdução Parasitos intestinais Prevalência das parasitoses intestinais Diagnóstico das parasitoses intestinais Método de formol-éter (Ritchie) Rotina laboratorial Método de Blagg ou MIF-C Método de Kato-Katz Rotina laboratorial Método de Graham Rotina laboratorial PARASITOLOGIA CLÍNICA 103 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 103 16/12/2020 13:13:56 Introdução Este material foi elaborado no in- tuito de auxiliar na compreensão dos métodos laboratoriais aplicados à pa- rasitologia. Esses métodos permitem a visualização das formas parasitárias, que podem incluir ovos, larvas, oocis- tos, cistos ou trofozoítos, dos parasitos intestinais, conhecidos como helmin- tos e os protozoários. Existem outros agentes que podem causar infecções no trato gastrointestinal, como os ví- rus, bactérias e fungos. Contudo, es- ses grupos não são tratados como “parasitos”. Desta forma, nesta unidade são estudados os métodos diagnósticos para detecção de parasitos intestinais. O exame de fezes é um método simples e de baixo custo, que auxilia o diagnóstico de inúmeras parasitoses intestinais, relacionadas a sintomasgas- trointestinais leves, mas que, em alguns casos, podem levar a pessoa ao óbito. Segundo Rey, no livro Bases da parasitologia médica, de 2017, é fundamental que ocorra um diagnóstico correto, para que possa ser indicado o tratamento adequado, além das medidas profi láticas recomendadas. Parasitos intestinais Ainda de acordo com Rey, os parasitos intestinais podem ser classifi cados em dois grupos genéricos: os helmintos e os protozoários. Os protozoários são um grupo de organismos agrupados por semelhanças morfológicas, mas não evolutivas. São unicelulares, portanto, podem ser observados apenas por mi- croscópio. Podem apresentar vida livre ou ser parasitas. Apresentam em seus ciclos biológicos formas distintas, os cistos, oocistos, esporos ou trofozoítas. Como exemplo de protozoários que atuam como parasitas intestinais, o livro Parasitoses intestinais, publicado pela SBP em 2020, cita a Entamoeba histolytica, Giardia lamblia e o gregarino Cryptosporidium spp. PARASITOLOGIA CLÍNICA 104 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 104 16/12/2020 13:13:57 Figura 1. Cisto de Entamoeba sp. Na seta, o corpo cromatoide com extremidades arredondadas e cegas. Fonte: CDC. Acesso em: 03/12/2020. Os helmintos são animais, pluricelulares, visíveis a olho nu. Apresentam sis- tema nervoso e muscular rudimentares. Quanto à reprodução, segundo a SBP, há três tipos: • Reprodução por oviposição: os ovos são depositados no meio externo, se transformando em larvas, que são maturadas até atingir a forma adulta; • Reprodução sexuada: entre machos e fêmeas; • Reprodução por autofecundação: hermafroditas. De acordo com Rey, os helmintos podem ser classificados em dois grandes grupos: os nematelmintos e os platelmintos (Quadro 1). Os membros desses grupos não apresentam relação evolutiva, sendo agregados por semelhanças morfológicas ou do ciclo de vida. QUADRO 1. CLASSIFICAÇÃO DOS HELMINTOS Platelmintos Trematódeos: vermes chatos não segmentados: Schistosoma mansoni. Cestódeos: vermes chatos, segmentados, em forma de fita: Taenia solium. T. saginata. Hymenolepis nana. Nematelmintos Ancylostoma duodenale. Necator americanus. Enterobius vermicularis. Strongyloides stercoralis. Trichuris trichiura. Ascaris lumbricoides. Fonte: SBP, 2020a. (Adaptado). PARASITOLOGIA CLÍNICA 105 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 105 16/12/2020 13:13:58 Com base nas informações dadas por Rey e também por David Neves, em Parasitologia Humana, de 2016, os Platelmintos são animais achatados que têm sistema digestório incompleto, uma vez que a abertura ventral é o local pelo qual entram os alimentos e saem os restos após a digestão. Alguns deles não possuem sequer tubo digestório, em função do parasitismo, em que absorvem os nutrientes diretamente do hospedeiro. Como não apresentam sistema cir- culatório e respiratório, os nutrientes e as trocas gasosas ocorrem de célula em célula por todo o corpo pela epiderme. Os Platelmintos de importância médica podem ser classificados em dois grupos: Trematódeos e Cestódeos. Todos os membros do grupo Trematoda são parasitos. Como exemplos, estão o Schistosoma mansoni, agente etiológico da esquistossomose. Os Cesto- da também são constituídos apenas por representantes parasitas, tendo como característica a presença de um corpo delgado e longo, formado pelas proglo- tes ou proglótides, seções independentes. Um membro dessa classe é a Taenia sp., visualizada na Figura 2. Na imagem, há a presença do escólex, estrutura característica dos Cestoda, auxiliando na fixação do parasito no hospedeiro. Figura 2. Escólex de Taenia saginata com quatro ventosas. Fonte: CDC. Acesso em: 03/12/2020. Os Nematelmintos consistem em vermes cilíndricos, filiformes, com sime- tria bilateral e não segmentados, de vida livre ou parasitos. Existem mais de 50 espécies de nematelmintos identificadas que são parasitas de humanos. Seu tamanho varia de um milímetro a um metro de comprimento. Conforme o ex- posto por Rey, quanto à nutrição das espécies parasitas, eles são classificados em quatro grupos: • Nematelmintos que vivem no interior do sistema digestivo do aparelho, como o Ascaris sp. e Enterobius sp.; PARASITOLOGIA CLÍNICA 106 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 106 16/12/2020 13:13:59 • Nematelmintos que se nutrem da mucosa do tubo digestivo do hospedei- ro, como o Ancylostoma sp. e Necator sp.; • Nematelmintos que vivem na luz intestinal, sem cápsula bucal. Alimen- tam-se penetrando parcialmente na mucosa, como o Trichuris sp.; • Nematelmintos que vivem no tecido do hospedeiro, produzindo histólise ou migrando pelos tecidos do hospedeiro. Citam-se as larvas de Ancylostoma sp., de Ascaris sp., de Necator sp. e Strongyloides sp. No desenvolvimento, os nematelmintos possuem as formas de ovo, que so- fre a primeira muda, liberando a larva. Em seguida, a larva passa por mais três processos de ecdise, formando o verme adulto. Rey lembra em seu livro que as larvas penetram no hospedeiro por via cutânea ou oral, dependendo da espécie. Figura 3. Ascaris lumbricoides, cujo tamanho é de 15 a 30 cm. Fonte: CDC. Acesso em: 03/12/2020. EXPLICANDO As diversas formas parasitárias de protozoários e de helmintos, como os ovos, larvas, trofozoítos, cistos, oocistos e esporos, têm o mesmo nome em razão das características em comum. Contudo, é importante enfatizar que as formas parasitológicas não são iguais e as diferenças podem ser observadas a nível de gênero ou espécie. Conhecer cada uma dessas formas auxilia na identificação ao visualizar no microscópio. PARASITOLOGIA CLÍNICA 107 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 107 16/12/2020 13:14:00 Prevalência das parasitoses intestinais Como exposto por Rey e pela SBP, as doenças parasitárias intestinais, cujos agentes etiológicos são os gru- pos denominados de vermes e pro- tozoários, têm grande importância em saúde pública. As parasitoses in- testinais estão entre as doenças mais comuns, com ao menos um bilhão de pessoas no mundo infectadas por pelo menos um parasita intestinal e 49 milhões de crianças e adolescentes até os 15 anos estão em risco. Segundo a SBP, no Guia prático de atualização, Parasitoses intestinais: diag- nóstico e tratamento, editado em 2020, “as últimas estimativas mundiais indi- cam que mais de 1,5 bilhão de pessoas, ou 24% da população mundial, sendo cerca de 880 milhões de crianças precisam de tratamento e intervenções pre- ventivas para estes parasitas”. Cerca de um bilhão de pessoas são infectadas pelo helminto Ascaris lumbricoides e quase um bilhão de pessoas são infectadas pelo Trichurus trichuria e por ancilostomídeos. Em relação às infecções causadas por protozoários, cerca de 200 milhões de pessoas são infectados pela Giardia lamblia. Nos países em desenvolvimento, a infecção por este protozoário atinge 60% das crianças. Outro protozoário de importância médica é a Entamoeba hystolytica, que acomete aproximadamen- te 500 milhões de pessoas com sua forma invasiva, estando relacionada a 100 mil óbitos por ano. No Brasil, a prevalência das parasitoses varia de acordo com particularidades de cada região. As crianças pertencentes à faixa escolar apre- sentam uma prevalência que varia de 23,3% a 66,3%, dependendo da região. Em lactentes, essa prevalência é de cerca de 15%. A alta prevalência das parasitoses intestinais está relacionada a um elevado custo econômico e social. As regiões com maior concentração de parasitoses in- testinais possuem habitações precárias, falta de saneamento ambiental e alimen- tação inadequada, acentuando as questões de desigualdade social, como salienta- do por Carli, em Parasitologia clínica, de 2001, bem como David Neves e Rey. PARASITOLOGIA CLÍNICA 108 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 108 16/12/2020 13:14:01 DICA Para aumentar os conhecimentos sobre a amebíase, uma das principais parasitoses, que provoca pelo menos 100.000 óbitos por ano, o artigo científico intitulado Amebíase intestinal:diagnóstico clínico e laboratorial, publicado na Revista Científica do ITPAC de agosto de 2015, com autoria de Ana Carolina Bernardes Dulgheroff e outros colaboradores, traz mais informações sobre a doença. Manifestações clínicas das parasitoses intestinais As manifestações clínicas apresentam diferentes intensidades, que depen- dem de fatores individuais, sociais, parasitários e ambientais, como pode ser visto no Quadro 2. QUADRO 2. FATORES DAS PARASITOSES INTESTINAIS Fatores do hospedeiro Questões demográficas: idade, sexo, grupo étnico. Questões biológicas: estresse e estado nutricional, em especial, desnutrição. Comprometimento imunológico. Hábitos higiênicos inadequados. Sociais Prática de exercícios físicos. Ocupação. Hábitos alimentares. Acesso aos serviços de saúde. Parasitários Carga parasitária. Virulência do parasito. Ambientais Saneamento básico. Fonte: NEVES, 2016; SBP, 2020a, 2020b. (Adaptado). Segundo Rey e os escritos da SBP, os sintomas das parasitoses intestinais em geral são leves, como diarreias, vômitos e dores abdominais. Em certos casos, se associam a formas graves e crônicas. Em crianças, apresenta um efei- to nocivo sobre a nutrição, interferindo no crescimento e no desenvolvimento cognitivo. Isso pode ter impacto negativo na escolarização e no trabalho, au- mentando os níveis de pobreza. Portanto, as parasitoses intestinais não se constituem apenas como um problema de saúde, mas de desenvolvimento econômico e social dos países. No Quadro 3, é possível conferir as manifestações clínicas crônicas relaciona- das às parasitoses intestinais. PARASITOLOGIA CLÍNICA 109 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 109 16/12/2020 13:14:01 QUADRO 3. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ASSOCIADAS ÀS PARASITOSES Sintomas gastrointestinais Diarreia. Má absorção: ocorre especialmente em casos de giardíase e estrongiloidiase. Náuseas. Vômitos. Dor abdominal. Prurido anal. Alterações hematológicas Eosinofilia periférica: em infecções por helmintos. Anemia ferropriva: especialmente em crianças. Sintomas respiratórios Síndrome de Löeffler: nos casos dos parasitas com quadro pulmonar, como Strongyloides stercoralis, A. duodenale, Necator americanus e A. lumbricoides. Outras manifestações Perda de peso. Hepatoesplenomegalia. Febre. Dermatite perianal. Fonte: NEVES, 2016; SBP, 2020a. (Adaptado). Conforme o SBP, além das crianças, as parasitoses intestinais apresen- tam-se como grave problema de saúde em pessoas imunocomprometidas ou imunossuprimidas, como, por exemplo, as que apresentam o vírus da imuno- deficiência adquirida (HIV). Com o advento da AIDS, muitas parasitoses que anteriormente eram infrequentes tornaram-se de grande relevância. Como salientado por Sérgio e Benjamin Cimerman, junto a David Lewi, em artigo para a Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical em abril de 1999, grande parte da morbidez dos pacientes com AIDS é decorrente de infec- ções oportunistas relacionadas ao sistema gastrointestinal. Isso ocorre pelos quadros de desnutrição crônica e emagrecimento, que agravam mais a imu- nossupressão e aceleram o curso da doença. Outras situações clínicas cursam com imunossupressão, como pessoas com tumores sólidos e neoplasias hematológicas, transplantados e pes- soas em uso crônico de medicamentos imunossupressores, como nas doenças reumáticas. Nesses casos, há elevado risco de infecções oportunistas, provocadas por inúmeros patógenos, com potencial para rápida evolução do quadro infeccioso. Por isso, recomenda-se o uso de terapia empírica profilática, como relatado por Pierrotti e Santoro-Lo- pes, em artigo para o site Medscape em 2019. PARASITOLOGIA CLÍNICA 110 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 110 16/12/2020 13:14:01 Alguns comportamentos podem estar associados com o aumento da pre- valência das parasitoses intestinais. Em homens homossexuais, por exemplo, há maior risco de infecções por parasitos intestinais, como a Giardia lamblia e Entamoeba histolytica. Um estudo que avaliou 200 homens homossexuais e 100 heterossexuais, encontrou as frequências respectivas de 27% e 1% para Enta- moeba histolytica; para G. lamblia, as prevalências nos dois grupos foi de 13% e 3%, respectivamente. Em nenhum dos casos dessa pesquisa havia infecção pelo vírus HIV, como ressaltado pelos Cimerman e por Lewi no artigo publicado em 1999. Em relação aos parasitos intestinais, existem algumas particularidades, elencadas no Qua- dro 4, das manifestações clínicas que variam de acordo com a espécie. QUADRO 4. PARTICULARIDADES NA MORBIDADE DAS ENTEROPARASITOSE Ascaris lumbricoides Semioclusão ou oclusão intestinal. Ancylostoma duodenale/ Necator americanus Principal causa de anemia ferropriva na infância, por hematofagismo: A. duodenale: 0,05-0,3 ml/verme/dia. N. americanus: 0,01-0,04 ml/verme por dia. Enterobius vermicularis Migração dos parasitas para a genitália feminina e consequente vaginite, cervicite e/ou salpingite. Trichuris trichiura Anemia ferropriva secundária à perda de sangue oculto nas fezes; diarreia crônica com tenesmo; prolapso retal. Strongyloides stercoralis Hiperinfestação em imunodeficientes e pessoas HIV+; risco de infecções secundárias por enterobactérias e fungos. Schistosoma mansoni Comprometimento hepatointestinal, hepatoesplênico e varizes esofágicas. Taenia solium (neurocisticercose) Crises epilépticas, hipertensão intracraniana, meningite, distúrbios psíquicos. Giardia lamblia Esteatorreia, perda ponderal, prejuízo na absorção de nutrientes, déficit de vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K), vitamina B12, ferro e lactase. Entamoeba histolytica Disenteria amebiana, tenesmo, fezes muco-sanguinolentas, dor abdominal intensa, invasão da mucosa intestinal por trofozoítos atingindo sítios extraintestinais por via hematogênica. Fonte: SBP, 2020a, p. 3. PARASITOLOGIA CLÍNICA 111 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 111 16/12/2020 13:14:01 Diagnóstico das parasitoses intestinais O diagnóstico clínico das parasitoses intestinais é muito semelhante. A de- fi nição dessas parasitoses é possível através do diagnóstico laboratorial reali- zado pelo exame parasitológico de fezes, de baixo custo e alta especifi cidade, embora simples, como relatado no Manual de diagnóstico dos agentes oportu- nistas: parasitos intestinais e Pneumocystis jirovecii, publicado pelo Ministério da Saúde em 2012. Para coleta do material fecal, é preciso informar o (a) paciente em como realizá-la de forma correta. É preciso evitar contaminações com água, urina e com o solo. Uma coleta inadequada inviabiliza o diagnóstico. Recomenda-se a realização de pelo menos três coletas em dias alternados para aumentar a sensibilidade do exame. Caso não seja possível levar imediatamente o espé- cime fecal ao laboratório, é possível armazenar por 24 horas na geladeira, em recipiente lacrado, segundo Carli e David Neves, mas também por Paulo Neves, em Manual Roca de técnicas de laboratório, de 2010. Os autores apontam que, no laboratório, antes de realizar a análise espe- cífi ca, é preciso realizar a análise macroscópica das fezes, avaliando suas ca- racterísticas gerais: cor, odor, consistência, formato, valor do pH, presença de sangue, presença de gordura e presença de pedaços de parasitos ou vermes inteiros. Em seguida, vem a análise microscópica. Classifi cam-se as técnicas do exame de fezes como quantitativas ou qualitativas. Os exames quantitativos são usados em inquéritos parasitológicos. No co- tidiano, os exames qualitativos são aplicados com maior frequência, visando identifi car diretamente a forma parasitária. Porém, muitas vezes, o diagnós- tico laboratorial é muito difícil em função do ciclo biológico do parasito e/ou pela disposição irregular dos parasitos nas fezes. Para facilitar a visualização e aumentar a sensibilidade das formas parasitárias, foram criadas técnicas que visam ao enriquecimento ou concentração dos parasitos na amostra. Dentreos principais métodos de enriquecimento, Carli, Paulo e David Neves destacam a sedimentação espontânea (método de Lutz ou Hoff man, Pons e Janer), a sedimentação por centrifugação (métodos de Ritchie e Blagg), a fl utua- ção espontânea (método de Willis), a centrífugo-fl utuação (método de Faust), a fi ta gomada (método de Graham), a concentração de larvas de helmintos por PARASITOLOGIA CLÍNICA 112 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 112 16/12/2020 13:14:01 migração ativa (método de Rugai) e a cultura de larvas (método de Hadara-Mo- ri). O método de Kato-Katz é um método quantitativo e qualitativo. Os autores dizem ainda que nenhum dos métodos apresentados é comple- to e diagnostica todas as formas parasitárias. Recomenda-se a aplicação de um método genérico, associado a um método específi co, de acordo com a hipóte- se. Portanto, o profi ssional deve conhecer bem todos os métodos diagnósticos, os procedimentos e as vantagens e desvantagens de cada um deles para con- seguir escolher adequadamente o método mais indicado para cada situação, aumentando as chances de um diagnóstico preciso. Como os métodos de diagnóstico que utilizam a microscopia ótica não são completos, recomenda-se o uso de mais de um método. Em geral, utiliza-se um método geral e outro específi co, com base na hipótese diagnóstica. As técnicas imunológicas e moleculares de diagnóstico apresentam elevada sensibilidade e especifi cidade. Dado o alto custo, elas são restritas à investigação epidemiológica, para caracterização específi ca do agente etiológico, com a fi nalidade de subsidiar as ações de vigilância e controle, segundo o manual do Ministério da Saúde. Nesse sentido, há três métodos parasitológicos que analisam as formas parasitárias do material fecal: • Método de formol-éter: qualitativo de enriquecimento; • Método de Kato-Katz: qualitativo e quantitativo; • Método de Graham: qualitativo. Método de formol-éter (Ritchie) Este método tem outras denominações, como centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou centrífugo-sedimentação pela formalina-acetato de eti- la. É um método de sedimentação com uso da centrifugação, apresenta- do por Ritchie, em artigo para o Bulletin of the United States Army Medical Department em abril de 1948, derivada da técnica de original elaborada por Telemann. Como explicado por Carli, o método de formol-éter é efi caz para identifi car cistos, ovos e larvas, inclusive os ovos operculados e os do Schistosoma mansoni a partir de material fresco, preservado por formaldeído. PARASITOLOGIA CLÍNICA 113 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 113 16/12/2020 13:14:01 Fundamentos Segundo várias fontes, como Ritchie, Carli, Paulo Neves e o manual do Mi- nistério da Saúde, o método de formol-éter consiste numa técnica de concen- tração de parasitos, baseado na sedimentação pela centrifugação e pela lava- gem do material com formol e éter (ou acetato de etila). O éter é um solvente orgânico, que forma uma fase apolar. Isso faz com que os artefatos vegetais e gorduras nas fezes sejam separados durante o processo de centrifugação. Após os processos de centrifugação, são formadas quatro camadas distintas: a camada superior contém o éter, a seguinte é composta dos detritos sólidos, a terceira é composta por líquidos e a quarta apresenta o sedimento biológico. A desvantagem do método é a utilização do éter, um agente inflamável, volátil e ex- plosivo, apresentando risco de contaminação humana e ambiental. Em função disso, tem sido sugerida a alteração pelo acetato de etila, que é menos inflamável e ainda melhora a eficácia na detecção de cistos de G. lamblia e ovos de Taenia spp. e Hymenolepsis nana. Além disso, a técnica é bastante tra- balhosa, algo indicado por Carli e também por Rabello, no texto “Diagnóstico parasitológico, imunológico e molecular da Esquistossomose mansoni”, parte do livro Schitosoma mansoni e esquistossomose: uma visão multidisciplinar, de 2008. Indicações De acordo com Carli, Paulo Neves e o manual do Ministério da Saúde, o método formol-éter é um método muito abrangente, sendo indicado para vi- sualização de cistos e oocistos de protozoários; ovos e larvas de helmintos; e esporos de microsporídios. A utilização de acetato de etila melhora a visualiza- ção de oocistos de protozoários coccídios e gregarinos intestinais: Isospora belli, Cryptosporidium spp. e Ciclospora sp. Todavia, em artigo para a Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropi- cal, Guizelini afirma que o método não apresenta boa sensibilidade para visua- lização de ovos pesados, como os de S. mansoni e A. lumbricoides. É importante reparar que o pH da formalina interfere na busca de ovos e cistos no sedimen- to, tendo melhor visualização com valores específicos: • Ovos de A. lumbricoides e S. japonicum: pH de 10; • Ovos de ancilostomídeos: pH variando de 4 a 7; • Ovos de T. trichiura e cistos de protozoários: melhor visualização com pH de 7. Apesar disso, segundo Carli, não são afetados pelas alterações do pH nem pelas mudanças. PARASITOLOGIA CLÍNICA 114 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 114 16/12/2020 13:14:01 Rotina laboratorial Os materiais necessários para a preparação da técnica são: • Centrífuga; • Estilete fi no; • Filtro descartável (Parasitofi ltro®) – opcional; • Gaze: Para realização do método, não é recomendado usar uma gaze com mais de duas camadas de espessura pois a gaze mais espessa pode reter o muco que contém oocistos de Cryptosporidium spp. e de Cyclospora sp. e espo- ros de microsporídios; • Lâmina; • Lamínula; • Recipiente de vidro ou copo plástico; • Swab de algodão; • Tubo de centrífuga de 15 ml com fundo redondo; • Microscópio; • Pipeta. Amostra: deve-se utilizar material fecal não preservado, ou seja, fezes fres- cas. Também é possível utilizar amostras coletadas de solução de formalina tamponada, conforme Carli e diretrizes do Ministério da Saúde. Reagentes: para realização do método formol-éter são necessárias algu- mas preparações: • Acetato de etila; • Éter etílico; • Solução de formaldeído a 10% (v/v); • Solução salina a 0,85%. Solução de formaldeído a 10%: a solução de formaldeído, também conhecida como formalina, é usada para preservar os estágios de desenvolvimento de proto- zoários e helmintos. Prepara-se a solução da seguinte forma (produto e volume): • Formaldeído 37-40% - 10 ml; • Água destilada-deionizada – 90 ml. Solução salina a 0,85% ou solução fi siológica: a solução de formaldeído neutra é efi caz para manter as características morfológicas dos parasitos, em especial para fi xar cistos. É composta por (produto e volume): PARASITOLOGIA CLÍNICA 115 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 115 16/12/2020 13:14:01 • Cloreto de sódio (NaCl): 0,85 g; • Água destilada-deionizada: 100 ml. Procedimentos Antes de iniciar qualquer procedimento em laboratório, é preciso atentar aos equipamentos de segurança recomendados, com a utilização de luvas, jaleco e óculos de proteção. Para preparação do método de formol-éter, se obedecem aos seguintes procedimentos: • Selecionar 1 g ou 2 g de fezes frescas; • Depositar o espécime fecal num recipiente contendo 10 ml de água corren- te ou solução salina a 0,85%. Como alternativa, utilizar a formalina a 5% e 10% em substituição à água corrente em todas as etapas da lavagem; • Filtrar a suspensão com auxílio de uma gaze umedecida (umedecer em água corrente). A gaze deve ser dobrada duas vezes. Como alternativa à gaze, filtrar a suspensão com filtro descartável, com alça de segurança (filtro leve- mente umedecido em água corrente); • Colocar o material filtrado num tubo de centrífuga; • Centrifugar (650 rpm por grama, por 1 minuto); • Decantar o líquido sobrenadante; • Adicionar ao sedimento 1 ml a 2 ml de água corrente ou solução salina a 0,85%; • Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) de forma a ocu- par 2/3 do volume do tubo; • Agitar e centrifugar (650 rpmpor grama, por 1 minuto); • Repetir os quatro tópicos anteriores até que o sobrenadante se apresente relativamente claro; • Depois que o último sobrenadante é decantado, se ressuspende o sedi- mento com 1 ml a 2 ml de formalina a 10% (preferir a solução tamponada de formalina a 10%, com pH neutro); • Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a 10%; • Deixar a solução em repouso por cinco minutos; • Adicionar 3 ml de éter ou acetato de etila; • Fechar o tubo e agitar vigorosamente na posição invertida, por 30 segundos; • Remover a tampa com cuidado; • Centrifugar (500 rpm por grama, por 1 minuto); PARASITOLOGIA CLÍNICA 116 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 116 16/12/2020 13:14:01 • São formadas quatro camadas, como pode ser visualizado na Figura 4A: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais e (4) camada de éter na superfície; • Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino; • Decantar, com cautela, as três camadas superiores; • Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes (Figura 4B); • Uma pequena quantidade do líquido permanece nas paredes do tubo, es- correndo para o fundo junto ao sedimento; • Misturar esse líquido e o sedimento (Figura 4C); • Selecionar o material do sedimento com auxílio de uma pipeta; • Preparar a lâmina para visualização em microscópio (Figura 4D); • Pode ser necessário coloração para identificação dos organismos. Colo- rações especiais também são necessárias para a identificação, segundo Carli, Paulo Neves e Ritchie. 4 3 2 1a) b) c) d) Figura 4. Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter. a) quatro camadas no tubo de centrífuga; b) limpeza das pare- des do tubo com swab de algodão; (c) sedimento; (d) preparação da lâmina. Fonte: CARLI, 2001, p. 63. PARASITOLOGIA CLÍNICA 117 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 117 16/12/2020 13:14:02 ASSISTA Para melhor visualizar a técnica, o vídeo Especialização em Ensino de Biologia - Aula prática: Exame parasitológico de fezes descreve de maneira prática os procedimentos necessários para realização do método de Ritchie. Método de Blagg ou MIF-C O método de Blagg, ou método de concentração por sedimentação com o conservador MIF (MIF-C ou MIFC), é um dos principais exames realizados na rotina laboratorial. Apresenta o mesmo princípio que o método de Ritchie, fundamentando-se na sedimentação por centrifugação. A diferença entre os dois métodos é que, no método de Blagg, as fezes são conservadas em MIF (mercurocromo, iodo e formol). Conforme Carli e David Neves, a conservação com MIF permite maior tempo para análise do material fecal, pois não ocorrem transformações de trofozoítos, cistos e de ovos. Para realização do método de Blagg ou MIF-C, procedimentos são seguidos: • Homogeneizar a amostra previamente conservada em MIF; • Filtrar a suspensão em gaze dobrada em copo plástico descartável; • Transferir 2 ml do fi ltrado para um tubo cônico de 15 ml; • Acrescentar 4 a 5 ml de éter sulfúrico e agitar; • Centrifugar por um minuto (1.500 rpm); • Com o auxílio de um bastonete com ponta de algodão, retirar a camada de detritos; • Inverter o tubo para desprezar o líquido, deixando apenas o sedimento; • Acrescentar ao tubo gotas de salina ou lugol; • Inverter o tubo numa lâmina; • Cobrir com uma lamínula e examinar ao microscópio, com objetivas de 10 vezes e 40 vezes. Método de Kato-Katz De acordo com Rabello, o método foi descrito pelos japoneses Kato e Miura, em 1954. No ano de 1960, ele foi modifi cado por Katz, Chaves e Pel- legrine, que simplifi caram a realização da técnica quantitativa, tendo em PARASITOLOGIA CLÍNICA 118 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 118 16/12/2020 13:14:02 vista que é desnecessário pesar previamente o material fecal, substituindo a pesagem por uma fórmula matemática simples. Hoje, é conhecido como método de Kato-Katz. Fundamento Com base nas definições dadas por Carli e Rabello, o método de Kato-Katz é um método quantitativo e qualitativo que avalia uma pequena porção de fezes, combinando um cartão retangular de papelão com pequeno orifício cen- tral e o esfregaço espesso de fezes. O material fecal é espalhado sobre uma lâmina de vidro, coberta com uma lamínula de celofane, previamente tratada por 24 horas por uma solução com glicerina, água destilada e verde de mala- quita ou azul de metileno. Após a evaporação da água, a glicerina atua sobre o esfregaço, clarificando e permitindo a visualização dos parasitos na observação microscópica. No mé- todo de Kato-Katz, para observação microscópica da amostra, a intensidade de luz necessária é, pelo menos, duas vezes maior do que a utilizada pelo exame direto a fresco. Em função disso, as lamínulas de celofane são antes mergulha- das numa solução aquosa de verde de malaquita, com a finalidade de proteger os olhos e aumentar a visibilidade dos ovos. Alguns profissionais adicionam a azida sódica (NaN3), em pó, para impedir alterações na morfologia dos ovos. A azida evita a embriogênese e diminui as atividades dos microrganismos, sem alterar a concentração dos ovos. Porém, é preciso cautela ao manusear e transportar a azida sódica, pois é tóxica. Cálculo do número de ovos Ainda segundo Carli e Rabello, existe uma fórmula elaborada para facilitar a estimativa do número de ovos. Para o cálculo do número de ovos presentes num grama de fezes, deve-se multiplicar o número de ovos observados na lâ- mina pelo fator 24. Isto resulta no número total de ovos por grama de fezes, conhecido pela sigla OPG. Vantagens e desvantagens do método A grande vantagem do método de Kato-Katz é o uso de significativa porção de fezes, examinada sem outros métodos de concentração. É um método de simples execução, e com possibilidade de armazenamento e transporte das lâminas em temperatura ambiente por meses, sem preju- dicar os resultados. PARASITOLOGIA CLÍNICA 119 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 119 16/12/2020 13:14:02 Uma desvantagem do método de Kato-Katz, conforme Rabello explicita, re- fere-se à consistência das fezes. Como o cálculo do número de ovos considera a quantidade de ovos por gramas, uma amostra de fezes seca pode apresentar uma contagem de ovos até sete vezes maior que uma amostra úmida, resultan- do num diagnóstico impreciso. Outros fatores limitantes da quantifi cação dos ovos nas fezes são a fl utuação diária na eliminação dos ovos e a distribuição desigual de ovos nas fezes, que podem ser minimizadas, aumentando o núme- ro de amostras e de lâminas examinadas. Indicações O método de Kato-Katz é indicado para o diagnóstico helmintos, exceto de larvas de Strongyloides sp. Não é indicado para análise de espécimes diarreicos. O método de Kato-Katz é o padrão-ouro para o diagnóstico de S. mansoni, recomendado pelo Ministério da Saúde e pela Organização Mundial da Saúde, apresentando melhor custo-benefício, além da praticidade. De acordo com Barbosa, num artigo publicado no Jornal Brasileiro de Pa- tologia e Medicina Laboratorial em 2017, e também segundo Rabello, o teste apresenta relevância clínica e epidemiológica, tendo em vista que permite clas- sifi car a carga parasitária. A classifi cação pode auxiliar a estimação da inten- sidade de infecção nas comunidades, orientando e avaliando as medidas de controle e prevenção da doença. Como descrito pelos autores, a carga parasitária é defi nida pelo número de casais de vermes que parasitam o hospedeiro defi nitivo, avaliada pelo número de ovos presentes nas fezes. O método é efi caz para o diagnóstico com cargas parasitárias elevadas (acima de 500 ovos por grama de fezes) ou moderadas (100 a 500 ovos por gramas de fezes). Em casos de cargas parasitárias baixas, o método apresenta limitações. Rotina laboratorial Reagentes: para realização do método de Kato-Katz são necessários alguns reagentes: • Verdede malaquita; • Fenol fundido a 44 °C; • Glicerina. PARASITOLOGIA CLÍNICA 120 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 120 16/12/2020 13:14:02 Solução aquosa glicerinada de verde de malaquita: a preparação da solu- ção aquosa glicerinada de verde de malaquita consiste em (produto e volume): • Solução aquosa de verde de malaquita a 3% (m/v): 1 ml; • Solução aquosa de fenol a 6% (m/v): 100 ml; • Glicerina: 100 ml. Deve-se tomar cuidado ao manusear a solução verde de malaquita pois é tóxica ao homem e ao ambiente. Material: para realização do método, são selecionados os seguintes materiais: • Cartão retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm), com um orifício central de 6 mm de diâmetro. É importante a padronização do orifício, pois o volume fecal analisado é estimado a partir dele; • Lamínula de celofane molhável com 20 x 26 mm de tamanho, e com espes- sura média previamente tratada durante 24 horas com solução de glicerina, água destilada e verde malaquita/azul de metileno; • Lâmina; • Lamínula; • Microscópio; • Palito de madeira ou de plástico; • Papel absorvente; • Tela de metal com 60 ou 80 malhas ou tela de náilon com 105 malhas, como recomendam Carli e Rabello. Amostra: para a análise, se selecionam amostras de material fecal não pre- servado, ou seja, de fezes frescas. É possível a utilização de fezes refrigeradas por um período de tempo pequeno. Não é possível realizar a técnica com ma- terial preservado por fixadores porque eles afetam a clarificação de mistura de glicerina. Procedimentos Para realização do método de Kato-Katz, são adotados os procedimentos descritos a seguir: • Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente; • Comprimir, com auxílio de um palito, a tela metálica/náilon sobre as fezes, fazendo com que parte das fezes passe através das malhas (Figura 5A); • Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina (Figura 5B); PARASITOLOGIA CLÍNICA 121 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 121 16/12/2020 13:14:02 • Depois de encher o orifício central, o cartão é removido com cuidado, dei- xando as fezes na lâmina; • Cobrir as fezes com a lamínula de papel-celofane já preparada, conforme des- crito, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente (Figura 5C); • Deixar a preparação em repouso durante 30 minutos, em temperatura de 34 a 40 °C. Alternativamente, é possível deixar em repouso em temperatura ambiente de uma a duas horas; • Examinar a preparação ao microscópio; • Para reanalisar a lâmina, ela é reidratada com uma gota de água corrente ou de solução salina. A B C Figura 5. Método de Kato-Katz. Fonte: CARLI, 2001, p. 136. ASSISTA A descrição dos procedimentos dos métodos parasitológi- cos pode ser um pouco abstrata, ainda mais para quem não tem experiência na prática laboratorial. De modo a facilitar a visualização da técnica, o vídeo Método Kato-Katz origi- nal - por Naftale Katz descreve os procedimentos necessá- rios para a realização do método original de Kato-Katz. Método de Graham O método de Graham, ou fi ta gomada ou adesiva, é um método de diagnósti- co parasitológico de Enterobius vermicularis na região anal e perianal. Fundamento Os vermes adultos de E. vermiculares habitam as regiões do ceco, cólon, apêndice e região anal. Os ovos do parasito são liberados por ação mecânica, através do rompimento ou dessecação do parasito. Apenas 5% dos indivíduos infectados com o E. vermicularis apresentam ovos nas fezes. Os ovos são depo- PARASITOLOGIA CLÍNICA 122 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 122 16/12/2020 13:14:04 sitados fora do corpo, na região perianal. O método de Graham se fundamenta no uso de uma fi ta gomada para apreender os estágios evolutivos de parasitos encontrados na região anal e perianal. Indicações O método de Graham é indicado para pesquisa, na região anal e perianal, de ovos de E. vermiculares. Também permite a visualização de ovos ou progló- tides de Taenia sp., Ascaris lumbricoides, Ancilostomídeos e Trichuris trichiura. Rotina laboratorial Para aumentar a chance de visualização, o exame é realizado algumas ho- ras após o indivíduo acordar, no período da manhã, antes de defecar ou tomar banho. A coleta é feita em dias consecutivos com, no mínimo, uma série de 4 a 6 coletas. Os materiais necessários para coleta são: • Lâmina de microscópio; • Fita de celofane adesiva e transparente: fi ta Durex ou Scotch tape. Não é recomendado o uso de fi ta Magic transparente. O tamanho da fi ta deve ser de 12 cm de comprimento e 20 mm de largura, sobre uma lâmina de micros- cópio. Colocar etiquetas nas extremidades da fi ta de forma que excedam o tamanho da lâmina; • Reagentes: toluol (tolueno) ou xilol (xileno) ou iodo-xilol; • Palito de madeira (abaixador de língua), que pode ser substituído por um tubo de ensaio ou pelo dedo. No último caso, deve-se atentar para o risco de contaminação, sendo necessário o uso de luvas, segundo Carli e David Neves. Procedimentos Para realização dos procedimentos, se realizam os seguintes processos: • Utilizar luvas durante todo o procedimento; • Colocar um pedaço de fi ta-celofane transparente numa lâmina de micros- copia (Figura 6A); • Com o auxílio de um palito de madeira, retirar a fi ta-celofane da lâmina, de forma que a fi ta contorne o palito deixando a superfície gomada voltada para fora (Figura 6B); • Pressionar o swab anal contra as pregas da região anal e perianal (Fi- gura 6C); PARASITOLOGIA CLÍNICA 123 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 123 16/12/2020 13:14:04 • Retire a fita-celofane e coloque-a na lâmina, com a face gomada virada para baixo. Evite a formação de pregas ou bolhas (Figuras 6D e 6E); • Identifique a etiqueta com os dados do paciente; • Levante a fita gomada com cuidado e coloque uma gota de tolueno, xileno ou iodo-xilol. Pressione a fita; • A preparação fica bem clara ou levemente corada, tornando os ovos visíveis; • Carli e David Neves sugerem que a visualização seja realizada em micros- cópio ótico, com objetiva de baixo aumento e baixa luminosidade. D E C A B Figura 6. Método de Graham. Fonte: CARLI, 2001, p. 168. Caso o material não possa ser examinado no mesmo dia, é recomendado conservar em geladeira, embalado por um papel-alumínio. PARASITOLOGIA CLÍNICA 124 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 124 16/12/2020 13:14:05 Sintetizando As parasitoses intestinais são infecções com altas prevalências no Brasil e no mundo. Suas manifestações clínicas dependem de inúmeros fatores, como fatores individuais, relacionados com a imunidade, com o parasito, e questões socioambientais. Alguns grupos especiais apresentam maior risco de desenvol- vimento de formas crônicas e graves, como as crianças, pessoas imunocompro- metidas e imunossuprimidas. O diagnóstico e tratamento adequado são funda- mentais para evitar a morbimortalidade relacionada com esses parasitos. Os parasitos intestinais podem ser classificados como protozoários e hel- mintos. Os protozoários são organismos unicelulares, com estágios de desen- volvimento nas formas de cistos, oocistos, trofozoítos e esporos, já os helmintos consistem em animais multicelulares, que podem ter vida livre ou parasitária. Os parasitos com importância médica pertencem a dois grupos: platelmintos e nematelmintos. Em seus estágios de desenvolvimento, apresentam-se como ovos, larvas ou vermes adultos. Dentre os métodos parasitológicos, focou-se em um método qualitativo e um quanti-qualitativo. O método do formol-éter, qualitativo, fundamenta-se no uso do formol e do éter para fixar e concentrar as estruturas parasitárias, separando-as dos detritos e gorduras. Tem como grande desvantagem o risco de contaminação humana e ambiental em função dos reagentes. Permite a vi- sualização de ovos, larvas, cistos e oocistos. O método de Blagg ou MIFC é uma variação do método formol-éter, e utiliza material fecal preservado. O método de Kato-Katz éum método qualitativo e quantitativo recomen- dado para inquéritos parasitológicos em função da fácil execução e rapidez. É o padrão-ouro para o diagnóstico do S. mansoni. O método de Graham é um método qualitativo, recomendado para diagnóstico de Enterobius vermicularis, e eventualmente de outros parasitos. Não existe um método completo e único que diagnostique todas as formas parasitárias. Portanto, é preciso conhecer cada método e suas variações, van- tagens e desvantagens, para auxiliar na escolha do método mais adequado para cada situação. Ao escolher o método parasitológico mais adequado, a hi- pótese sugerida no pedido médico é levada em conta, bem como as caracterís- ticas macroscópicas da amostra fecal, como cor, odor, preservação, presença PARASITOLOGIA CLÍNICA 125 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 125 16/12/2020 13:14:05 de gordura e consistência, que podem fornecer pistas de qual método escolher. Livros, manuais, artigos científicos e vídeos sobre o assunto são importantes para aprimorar conhecimentos sobre os métodos parasitológicos para que se tenha segurança ao realizá-los. PARASITOLOGIA CLÍNICA 126 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 126 16/12/2020 13:14:05 Referências bibliográficas BARBOSA, C. S. et al. Controle de qualidade das lâminas pelo método Kato-Katz para o diagnóstico parasitológico da esquistossomose mansônica. Jornal Brasi- leiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Rio de Janeiro, v. 53, n. 2, p. 110-114, 2017. Disponível em: <http://www.jbpml.org.br/detalhes/313/controle-de-quali- dade-das-laminas-pelo-metodo-kato-katz-para-o-diagnostico-parasitologico- -da-esquistossomose-mansonica>. Acesso em: 03 dez. 2020. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Coordenação- -Geral de Laboratórios de Saúde Pública. Manual de diagnóstico dos agentes oportunistas: parasitos intestinais e Pneumocystis jirovecii. Brasília: Ministério da Saúde, 2012. Disponível em: <http://www.ial.sp.gov.br/resources/editorinplace/ ial/2016_3_11/manual_oport.pdf>. Acesso em: 03 dez. 2020. CARLI, G. A. Parasitologia clínica. São Paulo: Editora Atheneu, 2001. CENTERS FOR DISEASE, CONTROL AND PREVENTION (CDC). Amebiasis. 15 out. 2019. Disponível em: <https://www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html>. Aces- so em: 03 dez. 2020. CENTERS FOR DISEASE, CONTROL AND PREVENTION (CDC). Parasites – Tae- niasis. Disponível em: <https://www.cdc.gov/parasites/taeniasis/>. Acesso em: 03 dez. 2020. CENTERS FOR DISEASE, CONTROL AND PREVENTION (CDC). Parasites. Dispo- nível em: <https://www.cdc.gov/parasites/about.html>. Acesso em: 03 dez. 2020. CIMERMAN, S.; CIMERMAN, B.; LEWI, D. S. Avaliação da relação entre parasito- ses intestinais e fatores de risco para o HIV em pacientes com AIDS. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Uberaba, v. 32, n. 2, p. 181-185, abr. 1999. Disponível em: <https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pi- d=S0037-86821999000200010&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt>. Acesso em: 03 dez. 2020. DULGHEROFF, A. C. B. et al. Amebíase intestinal: diagnóstico clínico e laborato- rial. Revista Científica do ITPAC, Araguaína, v. 8, n. 2, pub. 1, ago. 2015. Dis- ponível em: <https://assets.unitpac.com.br/arquivos/Revista/75/Artigo_1.pdf>. Acesso em: 03 dez. 2020. ESPECIALIZAÇÃO em Ensino de Biologia - Aula prática: Exame parasitológico de fezes. Postado por CIAR UFG. (11 min. 14 s.). son. color. port. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=HxoKMHSz20s>. Acesso em: 03 dez. 2020. PARASITOLOGIA CLÍNICA 127 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 127 16/12/2020 13:14:05 GUIZELINI, E. et al. Pesquisa de ovos “pesados” de helmintos nas fezes: estudo comparativo entre os métodos da sedimentação espontânea em água e de Rit- chie. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Uberaba, v. 20, n. 1, p. 23-24, mar. 1987. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=s- ci_arttext&pid=S0037-86821987000100005&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 03 dez. 2020. MÉTODO de Kato-Katz original – por Naftale Katz. Postado por Fiocruz Minas (6 min. 38 s.). son. color. port. Disponível em: <https://www.youtube.com/wat- ch?v=apuE0YQxVnk>. Acesso em: 03 dez. 2020. NEVES, D. P. Parasitologia humana. 11. ed. São Paulo: Atheneu, 2016. NEVES, P. A. Manual Roca de técnicas de laboratório. São Paulo: Roca, 2010. PIERROTTI, L. C.; SANTORO-LOPES, G. Panorama das infecções em imunossu- primidos sem HIV. Medscape. 17 out. 2019. Disponível em: <https://portugues. medscape.com/verartigo/6504097?pa=JQwWE6mhA59LYC0OAFklQ1i1uG4X%- 2F%2BVXGqb3ckYcep42B7cKNbniILwg0%2BUT7yBF56MI7dGTgNawPfsOtJla- 9Q%3D%3D>. Acesso em: 03 dez. 2020. RABELLO, A. et al. Diagnóstico parasitológico, imunológico e molecular da Esquis- tossomose mansoni. In: CARVALHO, O. S.; COELHO, P. M. Z.; LENZI, H. L. (orgs.). Schitosoma mansoni e esquistossomose: uma visão multidisciplinar. Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2008. p. 895-925. REY, L. Bases da parasitologia médica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017. RITCHIE, L. S. An ether sedimentation technique for routine stool examination. Bulletin of the United States Army Medical Department. Arlington, v. 8, n. 4, p. 326, abr. 1948. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PEDIATRIA (SBP). Departamento Científico de Pedia- tria Ambulatorial (2019-2021). Parasitoses intestinais. 4. ed. Rio de Janeiro: SBP, 2020a. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PEDIATRIA (SBP). Departamento Científico de Gas- troenterologia e Infectologia (2019-2021). Guia prático de atualização. Parasito- ses intestinais: diagnóstico e tratamento. n. 7. Rio de Janeiro: SBP, 2020b. PARASITOLOGIA CLÍNICA 128 SER_FARMA_PARACLI_UNID4.indd 128 16/12/2020 13:14:05