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Microbiologia
Aula 3
✔ Fisiologia bacteriana
Energia, nutrição e crescimento bacteriano
✔ Fontes de energia e processos
Bactérias utilizam 3 fontes de energia:
1) REAÇÕES QUÍMICAS (quimiotrofia);
2) LUZ (fototrofia);
3) CÉLULA HOSPEDEIRA (paratrofia).
Podem ser ORGANOTRÓFICAS >> quando a
produção de energia ocorre a partir de compostos
orgânicos;
* Podem ser LITOTRÓFICAS >> quando a
produção de energia ocorre a partir da utilização
de compostos inorgânicos
✔ Nutrição
⎯ Célula BACTERIANA: cerca de 70 % de
água, ou seja, suas reações estão
preparadas para ocorrer em meio aquoso.
⎯ Presença de parede celular rígida que
envolve toda a membrana celular visto que
as bactérias se nutrem apenas de material
em solução.
⎯ Necessitam de elementos químicos
orgânicos e inorgânicos
2 classes de nutrientes:
1. Macronutrientes: lipídeos, carboidratos,
ácidos nucléicos e proteínas
2. Micronutrientes:
- Elementos minerais (ferro, magnésio,
manganês, potássio....)
- Componentes não protéicos de proteínas
(ferro no citocromo, transportador de
elétrons na respiração celular)
- Componentes de estruturas (cálcio no
envoltório dos esporos)
- Osmorreguladores
✔ Classificação nutricional
⎯ Quimiotróficos: utilizam compostos
químicos para obtenção de energia
⎯ Fototróficos: utilizam energia radiante
(luminosa) para obtenção de energia
⎯ Quimioautotróficos: utilizam compostos
inorgânicos como fonte de energia
⎯ Quimioheterotróficos: utilizam compostos
orgânicos como fonte de energia
⎯ Fotoautotróficos: usam luz como fonte de
energia e compostos inorgânicos como
fonte de carbono
⎯ Fotoheterotróficos: usam luz como fonte de
energia e compostos orgânicos como fonte
de carbono
⎯ Algumas são versáteis!!!
✔ Condições de cultivo:
Requisitos básicos obrigatórios para cultivo:
1. Inocular em meio de cultura adequado;
2. Incubar em condições ambientais;
Inoculo: é uma AMOSTRA de material que
contem geralmente uma pequena quantidade de
microrganismos
***os microrganismos contidos no inoculo
MULTIPLICAM-SE, aumentando em numero e
massa.
Meios de cultura:
⎯ O que são?
É um ambiente onde a bactéria encontra os
nutrientes necessários para o seu
crescimento
⎯ Formulação: considera-se o tipo bacteriano
✔ Meios de cultura:
Mistura de nutrientes que proporcionam o
crescimento microbiano.
A formulação de um meio de cultura deve levar em
conta:
o tipo nutritivo ao qual o microorganismo pertence,
considerando-se a fonte de energia (luz ou
substância química) e a fonte de carbono
(orgânica ou inorgânica).
Influencia de fatores ambientes
↓
Temperatura, pH, pressão osmótica, atmosfera
gasosa
✔ Interferência ambientais no crescimento
bacteriano em meios de cultura:
Temperatura: cada tipo de bactéria apresenta
uma temperatura ótima de crescimento; as
bactérias de interesse medico crescem entre 28 e
37 graus (ideal 35 graus)
PH: deve estar em torno de neutralidade para que
ocorra a absorção de alimentos para a grande
maioria das bactérias
Oxigênio: pode ser indispensável, letal ou inócuo
para as bactérias.
✔ Temperatura:
Cada espécie tem uma temperatura mínima, ótima
e máxima de crescimento:
⎯ Mínima: é a menor onde ela cresce
⎯ Ótima: melhor crescimento
⎯ Máxima: é a mais alta onde ela cresce
Se ultrapassar LIMITE SUPERIOR: desnaturação
celular, ocorrendo MORTE bacteriana;
Se estiver abaixo de LIMITES INFERIORES:
desaceleração metabólica, gerando diminuição
da multiplicação, neste caso a morte bacteriana só
ocorre após muito tempo...
Classificação de acordo com a temperatura
◆ Psicrófilos: temperaturas baixas (10-15ºC)
◆ Psicrotróficos: 20-30ºC
◆ Mesófilos: temperaturas moderadas (25-40ºC)
Bactérias de interesse clínico
◆ Termófilos: temperaturas elevadas (50-60ºC)
◆ Termófilos extremos: mais de 80ºC – Archaea
✔ pH:
Acidez/alcalinidade
Ideal: pequena variação, próximo ao neutro
Utilização de tampões nos meios (sais de fosfato:
não tóxicos e servem como fonte de nutrientes)
✔ pressão osmótica:
Água é fundamental para a vida celular, a pressão
osmótica: pode alterar a concentração de água na
célula
Plasmólise: célula em meio hipertônico
✔ atmosfera gasosa
Principais gases: oxigênio e dióxido de carbono
Classificação:
– Aeróbios obrigatórios: requerem oxigênio (21%)
– Anaeróbios facultativos: aerobiose ou
anaerobiose
– Anaeróbios obrigatórios: oxigênio é tóxico
– Microaerófilos: requerem menos oxigênio (17%)
e mais dióxido de carbono (3,5%)
Toxicidade do oxigênio para anaeróbios estritos
Micro-organismos têm desenvolvido mecanismos
de proteção contra formas tóxicas do oxigênio:
– Produção de superóxido dismutase: 2 oxigênios
+ 2 hidrogênios = H2O2
– Produção de catalase: conversão de H2O2 em O2
e H2O
– Produção de peroxidase: remoção de H2O2, mas
não gera O2
OBS: anaeróbicos não produzem estas enzimas
superóxido dismutase e catalase porque não tem
contato com o oxigênio!!!
✔ Meios de cultura
Meio de cultura: nutriente preparado em
laboratório para crescimento de micro-organismo
Cultura: micro-organismo que crescem e se
multiplicam nos meios de cultura
Generalidades:
⎯ Conter nutrientes corretos
⎯ Água suficiente
⎯ pH ajustado
⎯ atmosfera gasosa adequada
⎯ meio estéril
⎯ incubação adequada para crescimento
⎯ disponíveis comercialmente ou não
⎯ ágar: essencial para microbiologia; extraído
de algas marinhas; pode ser adicionado a
45°C em cultura sem matar os
micro-organismos crescendo
✔ meios de cultura para bactérias:
imitam o habitat (pouca glicose)
algumas só crescem em meios quimicamente
definidos (fonte de energia e íons)
fastidiosas: muitas exigência nutricionais
✔ meios de cultivo para fungos:
meio: mistura de altas concentração de açúcar,
fonte de nitrogênio orgânico/inorgânico e minerais
(muita glicose)
pH: baixo (3,8 – 5,6)
obs.: bactérias contaminam substratos com pH
neutro (leite, carnes) enquanto fungos contaminam
frutas cítricas, composto de frutas, geleias
✔ meios especiais
usados para isolar, identificar e contar
microrganismo
tipos de meios de cultura:
sintéticos>> preparados a partir de substancias
químicas puras e em quantidades conhecidas
complexo>> a partir de extratos desidratados de
diversos órgãos de diferentes animais ou plantas,
onde não se conhece exatamente a composição
qualitativa e quantidade de meio;
Líquidos: solução aquosa de nutrientes;
Sólidos: quando a solução nutriente é gelificada
por um polissacarídeo extraído de algas- ágar-;
Seletivos: contém uma substância que inibe o
crescimento de um determinado grupo de
microrganismos, permitindo o desenvolvimento de
outros. Ex Maconkei meio inibitório para G+;
Diferenciais: permitem a distinção de colônias de
microrganismos diferentes. Ex ágar-sangue
proporciona visualização de bactérias hemolíticas.
✔ Meios de cultura
Meios para microrganismo anaeróbios:
Deve-se utilizar meios redutores para eliminar o
oxigênio do meio de cultura;
Pode-se utilizar jarras especiais, livres de
oxigênio, quando necessário a utilização de placas
de petry;
Exemplo:
Reagente inibidor: tioglicolato de sódio
Clostridium: sulfito redutores
✔ Meios para anaeróbios (meios redutores)
Exemplo:
–Clostridium tetani
Antes:
–Cultivados na camada profunda de meio
solidificado
Agora:
–Adição de agente redutor que remove oxigênio e
produz meio reduzido (tioglicolato de sódio)
✔ Meios para anaeróbios estritos
Nenhum oxigênio
Exemplo: arqueobactérias produtoras de metano
Precauções para o preparo de meio
– Ferver para eliminar oxigênio dissolvido
–Adição de agente redutor
– Esterilização com válvula de selagem
– Trabalhar em câmara de anaerobiose ou jarras
anaeróbicas
✔ Meio sintético, mínimo ou quimicamente
conhecido:
– Constituído por compostos químicos exatamente
conhecidos, ou seja, sabe-se exatamente a
composição e concentração dos componentes;
– Formado por minerais e uma fonte de carbono
conhecida; – Geralmente utilizados para estudos
de comportamento do metabolismo microbiano;
– Exemplo:
meio utilizados para reações de
biotransformações;
✔ Meio completo ou complexo:
– Constituídopor matérias-primas complexas
como extrato de carne, extrato de leveduras, de
plantas ou de produtos de digestão protéica
destas;
– O componente protéico fornece carbono,
nitrogênio e enxofre;
– Os extratos de carne e extratos de levedura
fornecem as vitaminas e outros fatores de
crescimento orgânico;
Exemplo:
Meio PCA (Plate Count Agar);
Meio PDA (Potato Dextrose Agar);
✔ Meio de enriquecimento:
Utilizados para isolar micro-organismos em baixa
quantidade, misturados a micro-organismos em
alta quantidade;
Apresentam características especiais para
estimular o micro-organismo de interesse,
favorecendo a detecção;
Neste meio de cultura nenhum agente inibidor é
utilizado para evitar crescimento de indesejáveis;
Exemplo:
Caldo lactosado – Salmonella;
✔ Meios diferenciais:
Utilizados para diferenciar os vários tipos de
micro-organismos em uma placa de meio de
cultura;
Quando em culturas puras, os micro-organismos
apresentam reações características quando
cultivados em meio diferencial;
Permitem visualizar diferenças fisiológicas entre
as espécies de microorganismos através de
alterações na coloração do meio (mudança de
pH), na coloração das colônias ou ainda produção
de gás.
Exemplo:
Ramback – para Salmonella;
Meio diferencial
✔ Meios diferenciais
Diferenciam em cor
Diferenciam em tipo de hemólise das hemácias
Diferencia vários microrganismos numa placa com
ágar
Exemplos:
Ágar sangue: β-hemólise pelo S. pyogenes
Ágar chromocult: colônias coloridas
✔ Meios seletivos
Permite o crescimento de 1 tipos de
microrganismo ou suprime o crescimento de
outros tipos (seleção)
Exemplos:
– Ágar Sabouraud: seletivo para fungos (pH 5,6 e
alta concentração de açúcar)
– Ágar verde brilhante: isola bacilo gram negativo
do gênero Salmonella sp
– Meio com antibiótico: meio com rifampicina onde
as espiroquetas crescem
Meios de cultura:
✔ Meios seletivos
Utilizados para promover e/ou inibir o crescimento
de um determinado micro-organismo ou grupo de
micro-organismos, impedindo o crescimento de
outras;
Exemplo:
Agar sulfeto de bismuto – Salmonella typhi;
Agar Sabouraud dextrose – fungos (favorecidos
pelo baixo pH);
✔ Meios seletivos/diferenciais
Exemplo:
– Ágar MacConkey
Contêm sais biliares e cristal violeta que inibe as
BGP e permite o crescimento de BGN
Contêm lactose que é usado pelas BGN
(fermentadoras ou não)
– Ágar Sangue com azida
Cresce apenas Gram positivas
– Ágar SS
Salmonella sp e Shigella sp
✔ Meios diferenciais e seletivos:
Utilizados em microbiologia de saúde pública,
ou seja, na qualidade de água e alimentos;
Com propriedades dos meios diferenciais e
seletivos;
Exemplo:
Meio BP (Baird Parker) – para Staphylococcus
aureus;
Agar MacConkey – inibe bactérias
gram-positivas;
✔ Meios de enriquecimento
Em cada meio cresce mais (muito mais) uma
determinada bactéria
Bactéria presente em pequena quantidade entre
várias outras numerosas (mista)
Enriquecimento: favorece o crescimento daquela
espécie de interesse e não das demais, sem
adição de inibidores!!!
Após cultivos seriados em meios novos obtêm-se
a população desejada predominante
✔ Meios para ensaios microbiológicos
Usados para medir a concentração de substâncias
como antibiograma e vitaminas
Exemplo: –Ágar Müller Hinton
✔ Outros meios de cultura
Avaliação de agentes bactericidas ou
bacteriostáticos
Antibiograma ou difusão em placas – MH (Muller
Hinton)
Concentração inibitória mínima (CIM) – LB (Luria
Bentani)
✔ Microelementos do meio de cultura
Água: principal solvente dos nutrientes
necessários á vida
Fonte de carbono: pode ser proveniente de
dióxido de carbono ou de nutrientes orgânicos
variados (carboidratos, álcoois, ácidos orgânicos e
lipídeos e proteínas)
Fonte de energia: carboidratos como amido,
glicogênio, pentoses, monossacarídeos e
hexoses;
Fonte de nitrogênio: nitratos, nitrito, amônia,
nitrogênio orgânico (aminoácidos, nucleotídeos,
peptídeos e proteínas complexas)
Fontes de hidrogênio, oxigênio, enxofre e fosforo:
os dois primeiros são encontrados na composição
gasosa do ambiente, enxofre a principal fonte são
os sulfatos, fosforo a principal fonte são os
fosfatos
✔ Inoculação e técnicas de semeadura
Isolamento e cultivo de culturas puras
✔ Matérias necessários
✔ Técnicas de semeadura
Esgotamento por estrias (1 alçada):
✔ Técnica de semeadura por esgotamento:
✔ Técnica de semeadura
Semeadura em profundidade (0,1 a 1mL) e
superfície (0,1mL) de inoculo
✔ Semeadura em profundidade
Semeadura em profundidade em tubos: semear o
material contido em uma agulha fazendo picadas
ate o fundo do tubo, proporcionando o
crescimento de micro-organismos anaeróbicos
✔ Incubação e manutenção de
micro-organismo
Incubação: multiplicação de células viáveis ->
colônias;
conservação: preservar culturas para futuros
estudos;
curto prazo: 4 a 10°c;
longo prazo: nitrogênio líquido, freezers (-80°c) ou
liofolizado;
micro=organismo isolados: teste laboratoriais;
identificação em microscópio luminoso ou
eletrônico;
patente; venda
● Cultura
Obtenção de cultuas puras, preservação e
crescimento de culturas bacterianas
⎯ Obtenção de culturas puras
A amostra é semeada em ágar solido (meio
escolhido)
Técnica de esgotamento
Final de semeadura: deve haver colônias isoladas
1 colônia pode ser colocada em tubo com caldo
nutriente e originar culturas puras de 1 tipo celular
✔ Preservação de culturas
Curto período: Refrigeração
Logo período:
Congelamento e liofilização (congela, desidrata,
frasco selado)
O congelamento é feito com glicerina para
proteger a bactéria da lise na membrana
✔ Crescimento de culturas
Divisão bacteriana:
–Crescimento bacteriano:
É o aumento de indivíduos em número não em
tamanho!
–Crescimento bacteriano: divisão binária
Alongamento da célula e replicação do DNA
Invaginação da parede celular e membrana
plasmática Formação de parede em torno das
regiões contendo DNA Separação das células
✔ Tempo de geração
Tempo de geração:
Tempo necessário para uma célula se dividir
Varia conforme o tipo de micro-organismo e
condições ambientais
Ex: E. coli 20 minutos; M. tuberculosis 13 horas
⎯ Multiplicação das bactérias:
Progressão geométrica
✔ Fases do crescimento bacteriano
Curva de crescimento bacteriano:
-Demonstra crescimento de células num dado
período de tempo
–Fase lag: fase de adaptação, síntese de DNA
(atividade metabólica)
–Fase log: fase de crescimento exponencial,
sintomatologia
–Fase estacionária: equivalência entre
crescimento e morte; uso de antibiótico,
fagocitose, anticorpos, escassez de nutrientes...
–Fase de declínio: morte celular, acúmulo de
produtos tóxico
✔ Métodos para quantificar diretamente o
crescimento microbiano:
Diretos: Indiretos:
-Contagem em placa Turbidimetria
-Filtração Atividade metabólica
- NMP Peso seco
-Contagem no
microscópio
✔ Diretos
Contagem em placa e diluição em série:
– Considera que uma única célula bacteriana
formará uma colônia
– Mas nem sempre temos uma única célula, pois
existem os arranjos (estreptococos,
estafilococos...)
– Assim as contagens em placas são
frequentemente chamadas de unidades
formadoras de colônia (UFC)
As vantagens da contagem padrão em placa são:
– Somente células viáveis são contadas
– Permite o isolamento das colônias, que podem
ser subcultivadas em culturas puras, as quais
podem ser facilmente estudadas e identificadas
No entanto, algumas desvantagens são
apresentadas:
– Não existe um meio que permita o crescimento
de todos os microrganismos
– É necessária a incubação apropriada para
permitir o desenvolvimento das colônias (pode
demorar)
– Usa-se muita vidraria e é relativamente
trabalhoso
– A necessidade de muita manipulação pode
originar erros nas contagens devido a erros de
diluição e/ou plaqueamento
✔ Contagem em placa: “pour plate”
–Principal desvantagem
ágar a 50 °C pode eliminar microrganismos!
–O método por espalhamento não possui esta
desvantagem
● Filtração:
Utilizado para concentrar os microrganismos em
uma membrana de filtro (porosa)
Apenas utilizadapara amostras líquidas!!
Poros pequenos impedem a passagem de
microrganismos!
Amostras de água em riachos e lagos, pois
possuem pouca quantidade de células (poluição
fecal – coliformes fecais)
◆ Procedimento: Filtro 100 mL de água
◆ Em seguida coloca-se a membrana em meio de
cultura (incubação)
◆ Contagem UFC
✔ Método do número mais provável (MNP):
– É uma técnica estatística baseada: quanto maior
o número de bactérias, maior será o número de
diluições necessárias para eliminar totalmente o
crescimento em tubos contendo meio de cultura
– Técnica utilizada quando as bactérias não
crescem em meio sólido
– Fornece apenas uma estimativa
– Utilizada para a análise de água e de leite
● Contagem direta no microscópio:
– Um volume conhecido de uma suspensão
bacteriana é colocado em uma área definida da
lâmina de microscópio
– Uma amostra de 0,01 mL é espalhada na
superfície de 1 cm da lâmina e um corante é
adicionado
– Após a contagem de diferentes regiões da
lâmina a média do número de bactérias pode ser
determinado
– Multiplicado por 100 (para se determinar em mL)
Vantagem:
– Não precisa de incubação (resultado imediato)
Desvantagens:
– Não é bom para contagem de bactérias móveis
–As células mortas também são contadas junto
com as vivas
– Uma contagem satisfatória necessita de um
grande número de células
✔ Indiretos
Turbidimetria
– Quando uma bactéria de multiplica em meio
líquido, esse meio fica turvo ou com alta
densidade de células
– Utilização do espectrofotômetro
– Utilizada na pesquisa e diagnóstico clínico
Atividade metabólica:
–Assume que a quantidade de um produto
metabólico determinado (ácido ou CO2) é
diretamente proporcional ao número de bactérias
presentes
Peso seco:
– Usado pra medir a quantidade de microrganismo
O Microrganismo é removido do meio de
crescimento, filtrado (ou centrifugado) e seco em
dissecador, sendo então pesado
Bom método para fungos filamentosos
● Quanto à necessidade de O2 as bactérias
podem ser:
1) Aeróbias:
◆ aeróbias estritas: exigem a presença de O2.
Ex: Acinetobacter;
◆ microaerófilas: necessitam de baixos teores de
O2.
Ex: Campylobacter jejuni;
◆ facultativas: apresentam mecanismos que as
capacitam utilizar O2 quando disponível, mas
podem desenvolver-se também na sua ausência
Ex: Escherichia coli e outras enterobactérias;
◆ aerotolerantes: suportam a presença de O2,
apesar de não o utilizarem.
Ex: Streptococcus faecalis e Lactobacillus.
● Quanto à necessidade de O2...
2) Anaeróbias:
◆ anaeróbias estritas: NÃO TOLERAM O2.
◆ Ex Clostridium tetani e Clostridium botulinum
são bactérias produtoras de potentes toxinas, que
só se desenvolvem respectivamente, em tecidos
necrosados e alimentos proteicos enlatados,
ambos carentes de O2.
● Reprodução:
O período de duplicação ou tempo de geração
corresponde ao intervalo de tempo entre as
divisões bacterianas >>> FISSÃO BINÁRIA.
– Divisão binária é um método de reprodução
assexuada, onde uma única célula bacteriana se
divide em duas, após desenvolver uma parede
celular transversal, que parte das camadas mais
externas.
● Metabolismo:
◆ Rede complexa de reações químicas que
organizam nas células os processos de obtenção,
armazenamento e utilização de energia.
◆ As bactérias apresentam enorme variação no
que se refere a vias metabólicas devido à sua
grande variabilidade genética.
FERMENTAÇÃO
◆ Fermentação = Respiração anaeróbia;
◆ O baixo rendimento energético da
FERMENTAÇÃO é revelado pela baixa velocidade
de crescimento...
◆ Microrganismos FERMENTATIVOS
desenvolvem-se muito mais LENTAMENTE do
que bactérias aeróbias.
Exemplos:
◆ >>utilização de açúcar como substrato:
◆ fermentação láctica>> obtenção de iogurtes;
◆ obtenção de ácido lático para medicamentos.
◆ >> utilização de aminoácidos como substrato:
◆ Clostridium botulinum em carnes
contaminadas>>> a disponibilidade de substrato
fermentável e a anaerobiose tornam o ambiente
favorável ao desenvolvimento da bactéria que
produz a TOXINA BOTULÍNICA