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UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP RELATÓRIO AULA PRÁTICAS Prof° Dra. Fernanda tomé CURSO: Nutrição DISCIPLINA: microbiologia dos Alimentos NOME DO ALUNO: Aline Soares Bastos Leite R.A: 2240363 POLO: Dutra, São José dos Campos DATA: 20/04/2023 allin Lápis INTRODUÇÃO Através da análise dos micróbios nos alimentos em geral, podemos constatar que os micróbios são essenciais para o controlo de qualidade e são ferramentas que ajudam a melhorar e manter a qualidade dos alimentos em geral, melhorando e mantendo assim a sua segurança e textura. Medido pelo armazenamento, distribuição e preparação. Portanto, evite a contaminação de alimentos e condições médicas que podem causar doenças. As bactérias vêm em muitos tipos morfológicos diferentes, sendo os mais comuns cocos (esféricos), bacilos (em forma de bastão), espirila (helicoidal) e vibrio (em forma de magátide). Isso é importante, pois pode indicar terapia antimicrobiana contra grupos específicos de patógenos e a necessidade de selecionar meios apropriados para atingir crescimento bacteriano adequado (BARBOSA HR, TORRES EB, 1998)1. Dentre os diversos microrganismos testados, o patógeno Staphylococcus aureus é um dos mais importantes na indústria alimentícia. A principal via de transmissão é através dos seres humanos, e os seres humanos podem ser portadores. Staphylococcus aureus. Os usuários podem introduzir micróbios em alimentos prontos para consumo sem refrigeração, por exemplo, por meio de secreções nasais. Nessa situação, o S. aureus se multiplica e produz a toxina estafilocócica, que pode causar intoxicação alimentar em pessoas que ingerem alimentos contaminados (FRANCO, 2003)2. Este relatório apresenta um curso prático de microbiologia de alimentos realizado no laboratório da UNIP no Sítio Dutra em São José dos Campos. As aulas foram divididas em dois dias, e algumas aulas foram realizadas na manhã do dia 1º de abril. E na tarde do dia 15 de abril, a segunda aula de arte. Ambos os cursos foram realizados sob a orientação da Profa. Fernanda Tomé. O objetivo deste relatório foi analisar os resultados obtidos após observações laboratoriais e comentar essa análise. 1 1 BARBOSA HR, TORRES EB. Microbiologia Básica. São Paulo: Atheneu, 1998. 196p 2 FRANCO, B.D.G; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. São Paulo, Editora Atheneu, 2003. Objetivos ▪ Analisar as diferentes morfologias bacterianas expostas e classificá-las. ▪ Executar a coloração de Gram em bactérias da microbiota bucal. ▪ Classificar as bactérias, segundo a coloração de Gram. Em aula analizou-se diferentes morfologias bacterianas, e assim sua classificação. Foi executado a técnica coloração de Gram na bacteria microbiota bucal, analizou-se o material disponilibizado pela professora. As bactérias foram classificadas segundo a coloracao de Gram. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia de Alimentos Aula prática: Morfologia e coloração de bactérias Aula 1 ROTEIRO 1 Materiais Quantidade Álcool-acetona Frasco de 500 mL (kit coloração Gram) Bico de Bunsen 1 unidade por grupo Espátula de madeira 2 unidades por grupo Fucsina de Gram Frasco de 500 mL (kit coloração Gram) Lâmina 2 unidades por grupo Lamínula 2 unidades por grupo Lugol Frasco de 500 mL (kit coloração Gram) Microscópio 1 unidade por grupo Solução de cristal de violeta Frasco de 500 mL (kit coloração Gram) Atividade I – Técnica de coloração de Gram Para a observação usou-se uma espatula esteril e uma lâmina para fazer a coleta do material biologico. Figura 1: Espatula Figura 2: Lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Coletou-se o material com o auxilio de uma espatula esteril. Figura 3: Bico de bunsen Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. O bico de bunsen foi aceso para criar uma zona de assepcia Aqueçeu-se a espatula para a coletagem da porção a ser observada, foi feito o esfregaço. Figura 4: zona de assepsia Figura 5: coletagem da amostra Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Após isso pingou-se uma goticula de agua destilada na lâmina. Figura 6: goticula de agua Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. A secagem da lamina feita na zona de assepsia para o inicio do procedimento de coloração. Figura 7: secagem da lâmina Figura 8: secagem da lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Apos a secagem total da amostra iniciou-se ao processo de coloracão. Cobriu-se a lamina com a solucão de cristal de violeta, cronometrou-se 1 minuto e desprezou-se na pia. Figura 9: cristal de violeta figura 10: cristal de violeta depositado na lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Em seguida cobriu-se a lâmina com a solução de lugol, cronometrou-se 1 minuto e 30 segundos e desprezou-se o corante na pia. figura 11: lugol figura 12: lugol depositado na lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Com a lâmina inclinada fez-se o gotejamento com Alcool-acetona para limpar a lâmina até que não saia mais corante. Aproximadamente 30 segundos Figura 13:Alcool-acetona figura 14:Alcool-acetona depositado na lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório. Feito a lavagem da lâmina rapidamente em agua corrente em seguida cobriu-se ela com solucão de fucsinia de gram e aguardou-se mais 30 segundos. Figura 15: Fucsina figura 16: Fucsina depositada na lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Lavou-se a lâmina em água corrente e secou-se (sem esfregar), levou- sea lâmina ja preparada para o microscópio, com a objetiva de imersão. Observou-se a coloração foi Gram positiva(+) ou Gram negativa(- Figura 16: vizualizando a lâmina Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Atividade II – Análise da morfologia bacteriana • Visualizar as lâminas expostas na bancada e classificá-las conforme a morfologia observada. Escolher duas e esquematizar nos círculos abaixo. O procedimento foi o mesmo na lâmina de Estecherichia coli, todo o processo de preparo para observação via microscopio. Nas imagens abaixo pôde-se observar a coloração de cada uma, a Gram positiva (+) Staphylococus aureus, ficou com a coloração aroxeada,como mostra na figura 17, a lâmina com a Gram negativa (-) Escherichia coli, ficou com a coloração rosa, como mostra na figura 18. Abaixo as colorações: Figura 17: Gram positiva Figura 18: Gram negativa Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Análise morfologica das bactérias A primeira lâmina que foi analisada ao microscópio, observou-se uma coloração roxa, é a Staphylococcus aureus na forma de cocos foi detectado nesta amostra formatos de cachos. Staphylococcus aureus é um dos agentes patogênicos mais comuns, responsáveis por surtos de intoxicação alimentar. As peculiaridades do seu habitat tornam sua presençaamplamente distribuída na natureza, sendo transmissíveis aos alimentos por manipuladores, na maioria, portadores assintomáticos, e pelos animais, principalmente o gado leiteiro com mastite (BALABAN; RASOOLY, 2000). A Segunda lâmina foi testada para a bactéria Escherichia coli, conhecida na literatura como bactéria gram-negativa que aparece rosa/vermelha quando vista ao microscópio. Escherichia coli, pertencente à família Enterobacteriaceae, além de apresentar formato de bacilo, é gram- negativa, anaeróbia facultativa e fermentadora de açúcares. Ela é encontradanormalmente na microbiota entérica (intestino) de aves e mamíferos. Possui representantes comensais e alguns tipos patogênicos, destacando-se como as causadoras mais comuns de infecções urinárias, além de provocarem diarreia. Perguntas para discussão: 1. Qual a importância dos métodos de coloração diferencial? R: ajuda na classificação das bactérias para testes específicos e diagnósticos de gênero: Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia sp 2. Que estrutura bacteriana está envolvida na diferenciação das bactérias nos métodos de coloração? R: A diferenciação ocorre na parede celular bacteriana. Este é outro método para manchar bactérias resistentes ao álcool (baar). Este método é utilizado para detecção de microrganismos no monitoramento do desempenho de pacientes com tuberculose. 3. Como são classificadas as bactérias que se coram no método de coloração de Gram? R: Gram positiva e Gram negativa 4. Qual o principal grupo de bactérias que não se cora no método de coloração de Gram? R: Existem bactérias que não coram pelo método de Gram e são conhecidas como bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). Isso se aplica aos micróbios, cujo principal representante é o Mycobacterium tuberculosis, que causa a tuberculose. 5.O que explica a reação positiva das bactérias no método de coloração de Gram? R: Elas contem uma camada pepitideoglicano, por isso reagem ao metodo de coloração de gram. 7. Qual a cor apresentada pelas bactérias Gram positivas? R: Cor Roxa 8. Qual a cor apresentada pelas bactérias Gram negativas? R: Cor Rosa Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia de Alimentos Aula prática: Deterioração microbianade alimentos Aula 2 ROTEIRO 1 Objetivo: discutir os mecanismos da conservação e da deterioração dos alimentos. Materiais Quantidade por grupo Açúcar 160 g por grupo Amido de milho 33 g por grupo Caneta para plástico 1 unidade por grupo Colher 1 unidade por grupo Copo plástico descartável (200 mL) 15 unidade por grupo Filme plástico 1 rolo Fogão 1 unidade por grupo Geladeira 1 unidade Leite UHT 330 mL por grupo Óleo de cozinha 150 mL por grupo Panela 1 por grupo Vinagre de maçã 125 mL por grupo Procedimento: O preparo do mingau Em uma panela ao fogo adicinou-se 1 colher de sopa de açúcar, e 3 colheres de sopa de amido de milho e 1 copo de leite. Junto ao fogo foi mexendo até o liquido ficar homogêneo, e ficar com uma consistência de mingau, feito isso o mingau foi dividido em 15 copos plásticos. Três dos copos foram separados para ser o controle, ou melhor eles ficaram em temperatura ambiente, os outros foram sujeitos a diferentes tratamentos como: geladeira, adição de óleo, adição de açúcar, com adição de vinagre e tampado com filme plástico. Após todo esse processo do preparo para o estudo das análises, foram utilizados três repetições por tratamento, e para que se consiga obter resposta dos experimentos são de 7 dias. Figura 19: copos preparados Figura 20: mingau ja colocado nos copinhos Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório O mingau doi dividido em 5 copinhos de plastico: Copo 1: controle ( temperatura ambiente) Copo2: adição de vinagre Copo3: adição de óleo Copo4: armazenado na geldeira Copo5: embalado no plastico filme Após 7 dias foram feitas observações da proliferação dos fungos. Foram feitos os experimentos adicionando, oleo, vinagre, controle, geladeira filme plástico vejam nas imgens a seguir: Figura 21: Controle e vinagre Figura 22: Controle e óleo Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Figura 23: Controle e geladeira Figura 24: Controle e plástico filme Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Observou-se que o copo 1 controle(temperatura ambiente) houve mais proliferação de mricroorganismos, sendo os fungos os principais sendo possivel observar atravez do mricroscópio. E alguns eram perceptiveis a olho nu, em alguns deles apresentou larvas. O copo 2, com adição de vinagre houve a proliferação de fungos. O copo 3, com adição de óleo e houve alteração, com proliferacao de microorganismos. O copo 4, armazenado na geladeira nao houve nenhuma alteração, não houve proliferação Copo 5, embalado com plastico filme, percebemos que houve alteração na textura do mingau. Conclusão Concluíu-se que os alimentos podem estragar sob influência de fatores internos e externos, fatores internos referem-se às propriedades do próprio alimento. Fatores internos podem ser considerados pH, atividade de água, potencial redox, composição química, presença de substâncias antimicrobianas naturais e interações entre microrganismos nos alimentos. Fatores externos referem-se ao ambiente em que o alimento é encontrado. Os fatores externos incluem umidade, temperatura ambiente e composição química. Informações sobre fatores internos e externos que afetam a atmosferaque contém alimentos, permite prever sua vida útil, estabilidade microbiológica e conhecer a capacidade de microrganismos potencialmente patogênicos em um determinado alimento. Perguntas para discussão 1. Quais são os fatores intrínsecos? R: Fatores intrinsecos na Biologia, compreendem elementos que podem intervir nos processos biológicos de forma interiorizada, como é caso de fatores existentes nas próprias células, como pH, temperatura, concentração de elementos. 2. Quais são os fatores extrínsecos? R: fatores extrínsecos são aqueles que estão presentes no ambiente, e que podem intervir na homeostase biológica, como é o caso dos recursos existentes nos ecossistemas, como os alimentos. 3. Qual a importância dos fatores intrínsecos na produção e na conservação dos alimentos? R: Oxidação-redução ou potencial redox é definido como a facilidade com que um substrato pode ganhar (redução) ou perder (oxidação) elétrons. O potencial de oxidação-redução é muito positivo e sua presença é determinada pelos tipos de microorganismos que se desenvolvem nos alimentos, também os nutrientes desempenham um papel importante neste fator. 4. De acordo com o papel que desempenham, como são classificados os microrganismos? R: No alimento podem ser benignas ou chamadas de fermentadoras ou aindacausar infecções ou intoxicações, sendo chamadas de patógenas 5. Quais as fontes de contaminação dos microrganismos? R: fontes de contaminação mais comuns são animais, humanos e insetos. Direta que ocorre entre pessoas e secreções.Indireta que ocorre por secreções e excreções carregadas por fômites(material inanimado que carrega matéria orgânica)Ambiental quando a contaminação ocorre no meio ambiente e promove acontaminação no alimento. 6. Quais os principais microrganismos encontrados no solo, água, vegetais, trato intestinal e manipuladores de alimentos? 7. De que dependerá a velocidade de deterioração dos alimentos? R: isso depende do tempo, humidade, temperatura, nutrientes, luninosidade oxigenio entre outros. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia de Alimentos Aula prática: Deterioração microbiana de alimentos Aula 3 ROTEIRO 1 Objetivo: discutir os mecanismos da deterioração dos alimentos. Materiais Quantidade por grupo Carne de frango 50 g por grupo Placa de Petri com PCA (Plate Count Agar) 2 unidades por grupo Caneta permanente 1 unidade por grupo Swab 2 unidades por grupo Procedimentos: ▪ Fazer swab no pedaço de frango cru e deixar por 15 minutos no tubo de ensaio com caldo nutriente. Figura 25: carne Figura 26: caldo Figura 27: Swab com de frango nutriente amostras de frango Fonte:foto de autoria própria tirada em laboratório Deixou-se o swab com a amostra de frango no liquido nutriente por 15minutos, após essa pausa foi feito a transferencia para uma placa de petri utilizando a técnica de estriamento no meio de cultura PCA, as amostras ficaram por 7 dias na estufa em temperatura de 35°C e a 5°. ▪ Estriar, em duplicata, nas Placas de Petri com PCA. Figura 28: Placa de pretri Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório ▪ Incubar a 35 ºC e a 5 ºC/7 dias, respectivamente Figura 29: Placa de pretri estriada Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Resultado da amostra: O crescimento das colônias bacterianas foi analisado a partir de amostras colhidas anteriormente, as bactérias precisam de tempo e temperatura adequadas para se desenvolver. E olhando o resultado, dá para ver que o crescimento da população bacteriana foi numa fase exponencial, onde o número de bactérias ainda é alto. Uma curva de crescimento bacteriano é obtida calculando a população de bactérias em um líquido durante um certo período de tempo. O crescimento tem quatro estágios: inicial (ou lag), exponencial, estacionário e declínio. Na fase inicial, é a fase de adaptação da bactéria ao meio ambiente, onde o tamanho da bactéria aumenta, mas não há divisão celular. A fase exponencial é um período conhecido pela proliferação vigorosa e contínua de bactérias que crescem e se reproduzem assexuadamente por fissão binária; cada duplicação dá origem a uma nova geração. Na fase estacionária, há falta de nutrientes e acúmulo de substâncias tóxicas produzidas pelas próprias bactérias, e no meio o crescimento da bactéria pode parar. Nesta fase, há uma falta significativa de nutrientes na fase de declínio e isso enfatiza a diminuição do número e da população de células mortas. Perguntas para discussão: 1. Qual a importância dos fatores extrínsecos na produção e na conservação dos alimentos? R: Esses fatores são o tempo necessário para que os microorganismos se multipliquem, e um dos outros fatores é a atividade de água nos alimentos. 2. Correlacionar os fatores extrínsecos com a curva de crescimento dos microrganismos. R: A correlação entre elas são o oxigênio, umidade relativa do ambiente e a temperatura. 3. Como os microrganismos podem ser classificados de acordo com a temperatura de crescimento? Qual a importância dessa informação para a inocuidade dos alimentos? R: Eles podem ser classificados em Psicrotrófilos temperatura ótima de 10 e 15°C, os mesófilos de temperatura de 20 a 45°C, os termófilos de 40 a 45°C e os Psicrófilos em tempertura ótima entre 12 a 15°C. A segurança dos alimentos é um fator muito importante, para o controle dos microrganismos, na conservação de um alimento depende muito da eliminação total ou parcial de microrganismos, que podem levar a alteração do produto.5 4. Qual a diferença entre microrganismos patogênicos e microrganismos deteriorantes? R: A diferença entre eles é que contêm toxinas e outras que regulam o crescimento de microorganismos. 5. Por que é importante conhecer essa diferença para o controle de alimentos? R: Novos métodos alternativos de controle microbiano foram criados, cada novo desenvolvimento tem seu próprio potencial, consequências intencionais ou não intencionais que devem ser consideradas na cadeia alimentar. Algumas dessas tecnologias reduzem ou eliminam riscos microbiológicos; enquanto outros podem causar a presença de patógenos6 6. Quais as principais fontes de contaminação de produtos cárneos? R: Das fontes mais comuns de contaminação da carne destacam- se: a deficiência no controle da higiene durante o abate do animal, a temperatura de estocagem da carne nos estabelecimentos comerciais, higienização durante o processamento e a manipulação7 Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia de Alimentos Aula prática: Vias de contaminação por manipuladores de alimentos Aula 4 ROTEIRO 1 Objetivo: Discutir as vias de contaminação por manipuladores de alimentos. Materiais Quantidade por grupo Placa de Petri com PCA (Plate Count Agar) 3 unidades por grupo Caneta permanente 1 unidade por grupo Procedimentos: ▪ Simular uma tosse na primeira placa Figura 30: Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório ▪ Colocar um fio de cabelo na segunda Figura 31: Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório ▪ terceira placa aberta por 30 minutos Figura 32: Fonte: foto de autoria própria tirada em laboratório Resultados e discussões. Existem muitas fontes de contaminação de alimentos e vários fatores aumentam a probabilidade de contaminação. A higiene do manipulador e de tudo que entra em contato com o alimento deve ser muito rigorosa e é muito importante para a produção segura e segurança do produto final. A contaminação ocorre: por meio de espirros e tosse, que espalham microrganismos contidos em pequenas gotículas de água; o hábito de retirar a saliva dos dedos tocando papéis para dobrar ou embrulhar alimentos; com uso e manuseio constante do lenço, etc. As mãos, que são o segmento do corpo humano que tem as atividades empresariais mais importantes e, portanto, muito exigentes em suas funções de trabalho, sujam-se facilmente. Vale esclarecer que a lavagem das mãos não é dada a eles inocuidade; é eficaz apenas contra bactérias coliformes, porque os estafilococos deixados nos poros e fendas da pele pelo processo de limpeza podem subir à superfície. As mãos, principalmente em restaurantes onde não há meios mecânicos, devem ser suficientemente manuseadas para que estejam sempre limpas.Esta contaminação é causada principalmente pela falta de cuidados higiênicos, incluindo a prática de não lavar as mãos após o manuseio. excreção (porosidade) graças ao papel higiênico, as bactérias podem entrar nas mãos); também tocar objetos, materiais suspeitos e atividades inadequadas. As doenças transmitidas por alimentos (DTA) são causadas pelo consumo de alimentos ou água contaminados com microorganismos patogênicos, substâncias químicas ou toxinas. :1. A infecção tóxica resulta do consumo de alimentos contaminados com microorganismos patogênicos que produzem ou liberam toxinas após o consumo.2. Infecção resultante da ingestão de um patógeno e subseqüente multiplicação no intestino com invasão de mucosa ou tecido.3. Intoxicações causadas pelo consumo de toxinas microbianas produzidas pela sua reprodução nos alimentos As boas práticas são medidas que a indústria e os serviços de restauração devem implementar para garantir a qualidade higiénico-sã e prevenir a ocorrência destas doenças Perguntas para discussão: 1. Qual a importância da higiene pessoal dos manipuladores de alimentos para evitar Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA)? R: As DTAS são doenças associadas à presença de microrganismos adicionados aos alimentos durante a produção ou armazenamento do produto. R: Produz toxinas que causam intoxicação alimentar. Essas doenças ocorrem quando as pessoas comem alimentos contaminados com micróbios ou toxinas produzidas por micróbios. A higiene pessoal é um fator muito importante para prevenir a contaminação e o crescimento de microrganismos e a propagação de doenças. 2. Quais as possíveis vias de contaminação de alimentos pelos manipuladores? R: São as mãos, saliva, roupa do manipulador, também de forma direta ou indireta. 3. Quais são os microrganismos da família Enterobacteriaceae que podem causar as DTA? R: Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli etc 4. Classificar esses microrganismos de acordo com o tipo de DTA (infecção, toxinfecção). R: Infecção - quando a bactéria causa a infecção. Toxinfecção - quandoa infecção é produzida por ela. 5. Quais são as principais medidas profiláticas para evitar as DTA? R: Lavar as mãos e utensílios, evitar intoxicação cruzada, higienizar alimentos. Conclusão: aprendeu-se conservação de alimentos na aula de microbiologia. Leve à geladeira a 2-8°C. Congeladores abaixo de 0°C a 21°C impedem o crescimento de microorganismos. As embalagens vazias excluem o oxigênio e aditivos como sal, açúcar, vinagre, óleo, capacetes e conservantes químicos impedem o crescimento de alguns microrganismos. Potencial para contaminação de alimentos, deterioração, alterações de sabor ou textura e doença patológica. Alguns grupos microbianos causam mudanças positivas. Pão, vinho e cerveja também são úteis, por exemplo. Vegetação Classificação dos microorganismos: Vírus e fungos: fiapos, leveduras = mofo Bactérias: Staphylococcus aureus (pele), Escherichia coli (fezes, habitat intestinal), Bacillus cereus (solo), Vibrio parahaemolyticus (mar), etc. é um fator em relação à umidade, pH, água e microbiota. Fatores externos são fatores que promovem a infecção ou inibem o crescimento de microorganismos. Os tipos de contaminação são divididos em biológicos (bactérias), físicos (cabelos, plásticos, unhas, etc.) e químicos (detergentes, produtos químicos). Fontes primárias de contaminação: solo, água, utensílios, poeira, ar, trato intestinal, manipuladores de alimentos. REFERÊNCIAS BARBOSA HR, TORRES EB. Microbiologia Básica. São Paulo: Atheneu, 1998. 196p FRANCO, B.D.G; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. São Paulo, Editora Atheneu, 2003. SALVATIERRA, CLABIJO MÉRIDA. Microbiologia: Aspectos Morfológicos, Bioquímicos e Metodológicos. Saraiva Educação SA, 2014. FORSYTHE, Stephen J. Microbiologia da segurança dos alimentos. Artmed Editora, 2013. Microbiologia das carnes: visão geral. Seminário: panorama atual da microbiologia de carnes e produtos cárneos. Renata Bromberg. CTC/ITAL. 2018 BALABAN, N. e Rasooly, A. (2000) Enterotoxinas estafilocócicas. Revista Internacional de Microbiologia de Alimentos, 61, 1-10. https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/escherichia-coli.htm