Análises de Restrição sumario

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ANÁLISES DE RESTRIÇÃO 
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ANÁLISE DE RESTRIÇÃO 
 
 
 
 A análise do perfil de restrição consiste em submeter amostras de DNA à 
clivagem por enzimas de restrição e, a partir do tamanho dos fragmentos gerados, obter 
informações sobre a sequência nucleotídica observada e/ou realizar a identificação de 
diferentes amostras. 
 
 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E A CLIVAGEM DE SEQUÊNCIAS 
ESPECÍFICAS DO DNA 
 
 Uma das descobertas fundamentais para o desenvolvimento das técnicas de 
biologia molecular ocorreu na década de 1970, com o isolamento das enzimas de 
restrição (também chamadas de endonucleases de restrição). Essa classe especial de 
enzima é produzida por determinadas bactérias como resposta de defesa à invasão por 
vírus, denominados bacteriófagos. No processo de infecção, o bacteriófago transfere 
seu material genético para a célula hospedeira e passa a produzir cópias de si mesmo 
até que a célula bacteriana se rompa e libere novos vírus. Nesse processo, as enzimas 
de restrição atuam como tesouras moleculares, produzindo cortes no genoma viral, de 
modo a torná-lo inativo. 
O grande diferencial das enzimas de restrição reside na capacidade de clivar 
cadeias duplas de DNA exógeno em sequências específicas de nucleotídeos. Isso ocorre 
porque cada enzima reconhece apenas um determinado sítio de restrição, ou seja, uma 
sequência específica de quatro a oito pares de bases onde ocorrerá a clivagem da 
molécula de DNA (Figura 1). 
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Figura 1 – Representação ilustrativa de algumas enzimas de restrição com os respectivos sítios de clivagem (setas 
verticais) e os organismos em que foram isoladas. 
Fonte: Klug et al. (2010). 
 
A maioria dos sítios de restrição são constituídos por sequências simétricas 
denominadas palíndromo, ou seja, sequências nucleotídicas lidas igualmente em ambas 
as fitas no sentido 5’ → 3’. Além disso, cada enzima tem um padrão de clivagem que 
pode produzir extremidades lisas devido ao corte da dupla fita de DNA no mesmo par 
de nucleotídeos, como é o caso da AluI e HaeIII; ou elaborar extremidades coesivas 
devido a cortes desencontrados, como é o caso das enzimas EcoRI e HindIII (Figura 1). 
Essa alta especificidade torna as enzimas de restrição ferramentas laboratoriais muito 
úteis, pois permitem a identificação de semelhanças ou diferenças por meio da análise 
do perfil de restrição apresentado por amostras distintas de DNA. 
Atualmente, centenas de enzimas de restrição já foram isoladas de 
microrganismos específicos, sendo frequentemente empregadas na prática laboratorial. 
Ao incubar qualquer amostra de DNA em solução com uma enzima de restrição e todas 
as condições necessárias para o seu funcionamento (tampão, temperatura e tempo 
adequados), a digestão enzimática produzirá a clivagem de todos os sítios de restrição 
específicos existentes na amostra em questão. Por exemplo, se uma amostra for 
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submetida à clivagem pela enzima EcoRI, todas as sequências 5’ GAATTC 3’ serão 
reconhecidas e clivadas por essa enzima. Por outro lado, se a enzima utilizada na reação 
for a AluI, então todas as sequências 5’ AGCT 3’ serão reconhecidas e clivadas, conforme 
observado na Figura 1. Nesse sentido, cada amostra de DNA submetida à clivagem por 
uma determinada enzima de restrição produzirá um número fixo de fragmentos que 
corresponderá ao número de sítios de restrição ali existentes, formando um perfil de 
restrição (SNUSTAD; SIMMONS, 2018). Com o conhecimento da sequência de 
nucleotídeos que compõe o sítio de restrição específico de cada enzima e a comparação 
dos perfis de restrição de diferentes amostras, torna-se possível caracterizar 
polimorfismos, detectar mutações pontuais e realizar a identificação de indivíduos, por 
exemplo. 
 
 SEPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO POR 
ELETROFORESE EM GEL 
 
 Após realizar a reação de digestão por enzima de restrição, os diferentes 
fragmentos de DNA produzidos precisam ser separados para que o perfil de restrição 
obtido possa ser identificado. Para isso, o método mais utilizado é a eletroforese em gel 
(de agarose ou poliacrilamida). Nessa técnica, cada amostra da reação de restrição será 
aplicada em um poço na extremidade do gel que, suspenso em solução tamponante, 
será submetido a um campo elétrico. Para a correta identificação dos diferentes 
tamanhos produzidos pela clivagem, um marcador molecular contendo fragmentos de 
DNA de tamanhos conhecidos também é adicionado ao gel. Como o DNA é 
negativamente carregado devido à presença de agrupamentos fosfato, ao aplicar o 
campo elétrico, os fragmentos irão migrar em direção à extremidade positiva do campo. 
Nesse processo, o gel funciona como uma barreira física por meio da qual os fragmentos 
de DNA maiores migram mais lentamente que os menores. Ao fim do processo, os 
fragmentos de restrição de cada amostra estarão separados, formando bandas de 
diferentes tamanhos, que poderão ser visualizadas sob luz ultravioleta (Figura 2). Isso é 
possível porque após a corrida da eletroforese, o gel utilizado é submerso em uma 
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solução contendo um agente intercalante denominado brometo de etídio. Essa 
substância tem capacidade de se intercalar entre os pares de base do DNA e emitir 
fluorescência quando exposto à luz ultravioleta, evidenciando, assim, as bandas 
formadas. Devido ao potencial mutagênico, ambos os reagentes — brometo de etídio e 
luz ultravioleta — devem ser manipulados com especial atenção para o uso correto dos 
equipamentos de proteção (EPIs). 
 Como resultado, são obtidos os perfis de restrição de cada amostra, de forma a 
tornar possível identificar a presença e/ou ausência de sítios de restrição, bem como 
comparar e identificar amostras específicas. 
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Figura 2 – Separação dos fragmentos de restrição por eletroforese em gel de agarose. 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
KLUG, W. S. et al. Conceitos de genética. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 
 
SADAVA, D. et al. Vida: a ciência da biologia. 11. ed. Porto Alegre: Artmed, 2020. v. 1. 
 
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 7. ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2018. 
 
 
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