Relatório_DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM HORTALIÇAS E LEGUMES POR HPLC (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA)

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<p>MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO</p><p>INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO CEARÁ - IFCE</p><p>PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO - PRPI</p><p>DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA</p><p>DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM HORTALIÇAS E</p><p>LEGUMES POR HPLC (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA</p><p>EFICIÊNCIA)</p><p>Dayana Kelly Felipe Silva(1); Emilia Maria Alves Santos(2)</p><p>Bolsista(1); Instituto Federal do Ceará, Maracanaú; dayakellyf@gmail.com.</p><p>Orientador(2); Instituto Federal do Ceará, Maracanaú; santosemilia@gmail.com.</p><p>1 RESUMO No que se refere às áreas agricultáveis, um grande desafio para a humanidade é a</p><p>produção de alimentos para uma população em plena expansão. Os setores rurais estão disputando</p><p>espaço com a expansão das áreas de urbanização e industrialização. Nesse contexto, na busca de</p><p>uma maior produtividade agrícola por hectare, o emprego de pesticidas tem apresentado papel</p><p>preponderante. Atualmente a exploração comercial e econômica de qualquer cultura agrícola faz</p><p>uso de pesticidas, exceto a agricultura orgânica (GRISOLIA, 2002). Este trabalho propõe criação de</p><p>método de análise de resíduos de Clorpirifós em amostras de tomate por cromatografia líquida de</p><p>alta eficiência (CLAE). A análise foi realizada em cromatógrafo, com detector de UV/Visível. Para</p><p>início do experimento foram utilizadas as seguintes condições cromatográficas: Coluna C-18 (4,6</p><p>mm x 25 cm x 5 µm) Thermo, com detector de ultravioleta ajustado em 229 nm, Coluna C-18,</p><p>modelo Zorbax ODS (4,6 mm x 25 cm, 5 µm), fluxo de 1 mL/min e temperatura de 35ºC. Usou-se</p><p>Metanol:Ácido Acético 0,2% como fase móvel e volume injetado de 50 µL. Amostras de tomate</p><p>foram trituradas submetida a processo QuEChERS e injetado no cromatógrafo (injetor automático).</p><p>Os resultados do teste de linearidade mostraram r 0,99. O método proposto é simples e rápido para</p><p>determinação de resíduos de Clorpirifós em amostras de tomate.</p><p>Palavras chaves: Pesticida; tomate; CLAE; método analítico.</p><p>2 INTRODUÇÃO</p><p>O uso de pesticidas é ainda atualmente a principal estratégia no campo para o combate e a</p><p>prevenção de pragas agrícolas, garantindo alimento suficiente e de qualidade para a população.</p><p>Esses compostos, porém, são potencialmente tóxicos ao homem, podendo causar efeitos adversos</p><p>ao sistema nervoso central e periférico, ter ação imunodepressora ou ser cancerígeno, entre outros</p><p>(ECOBICHON, 1993). Segundo a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), o Brasil é o</p><p>país que mais utiliza pesticidas no mundo, com um faturamento de 7,3 bilhões de dólares ao ano.</p><p>Segundo pesquisas, o país é responsável por 1/5 do consumo mundial destes compostos, utilizando</p><p>19% de todos os defensivos agrícolas produzidos no mundo. É necessário desenvolver e validar um</p><p>método de análises que permita atingir as concentrações que estão sendo requeridas. Por</p><p>conseguinte, o desenvolvimento de um procedimento de preparação adequado da amostra</p><p>envolvendo o enriquecimento, extração e etapas de limpeza torna-se obrigatório para obter um</p><p>extrato final concentrado do analito e tão livre quanto possível de contaminantes. Em vista do</p><p>exposto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de um método para análise de resíduos de</p><p>pesticidas em hortaliças e frutas por cromatografia líquida de alta eficiência o qual, depois de</p><p>validado, será aplicado em amostras reais de tomate, pimentão e alface utilizadas numa instituição</p><p>federal de ensino e comercializadas na região metropolitana de Maracanaú.</p><p>3 METODOLOGIA</p><p>3.1 Condições cromatográficas para análise dos pesticidas em amostras de tomate</p><p>MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO</p><p>INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO CEARÁ - IFCE</p><p>PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO - PRPI</p><p>Na pesquisa foi utilizado Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência da marca Thermo, com</p><p>detector de UV/Visível. Para início do experimentos foram utilizadas as seguintes condições</p><p>cromatográficas: Coluna C-18 (4,6 mm x 25 cm x 5 µm) e o seguinte gradiente de eluição:</p><p>Tabela 1 – gradiente de eluição.</p><p>Tempo (minuto) Metanol Solução de Ácido Acético</p><p>0,2%</p><p>0,01 65% 35%</p><p>5,00 65% 35%</p><p>7,00 90% 10%</p><p>12,00 90% 10%</p><p>15,00 65% 35%</p><p>Fonte: Autores, 2017</p><p>A vazão da fase móvel foi mantida em 1,0 mL min-1 e o volume de injeção foi de 50 µL.</p><p>Para a calibração do cromatógrafo foi utilizada a técnica do padrão externo. As curvas de calibração</p><p>foram obtidas com soluções padrões do pesticida investigado (já previamente adquirido) com</p><p>concentrações divididas em duas curvas (0,05 a 2 ppm) e (2 a 10 ppm). Foi estudado o pesticida,</p><p>por ser este bastante comum no cultivo de tomate.</p><p>3.3 Preparo das amostras</p><p>A amostra de tomate foi picada e trituradas por aproximadamente 30 segundos, a partir do</p><p>procedimento foi obtido o extrato. O material obtido, da etapa anterior, foi submetido ao processo</p><p>de limpeza de matriz segundo PRESTES, 2011, método este possui três etapas: extração, partição e</p><p>limpeza; 10g da amostra foi acrescido de 10 ml de acetonitrila, a solução foi agitada por 1 minuto</p><p>(extração), em seguida foi acrescido 4g de sulfato de magnésio (MgSO4) e 1g de cloreto de sódio</p><p>(NaCl) e agitada por 1 minuto (partição) ao fim foi retirado 1 ml do sobrenadante e acrescido 0,15g</p><p>de sulfato de magnésio (MgSO4) e 0,025g de PSA, o eluato foi injetado no cromatógrafo líquido</p><p>com auxílio de injetor automático.</p><p>3.4 Fortificação das amostras de tomate para validação do método analítico</p><p>O estudo da recuperação consiste na "fortificação" da amostra, ou seja, na adição de</p><p>soluções com diferentes concentrações do analito de interesse seguida pela determinação da</p><p>concentração do analito adicionado ARDREY (2003).</p><p>No estudo da recuperação serão realizados testes de significância, utilizando o teste "t" de</p><p>Student. Se o valor de t obtido estiver enquadrado no intervalo estabelecido pelo valor tabelado,</p><p>para n 1 graus de liberdade em dado nível de significância, então o método será considerado exato</p><p>VOGEL (2002). Serão utilizadas mostras de tomate (isentas de agrotóxicos). As amostras serão</p><p>fortificadas com 50 µL da solução padrão de trabalho contendo o agrotóxico a ser investigado na</p><p>concentração de 2,0 mg/L obtendo-se uma amostra fortificada com concentração de 0,20 µg/g, para</p><p>o estudo da porcentagem de recuperação dos agrotóxicos. As amostras fortificadas deverão ser</p><p>deixadas em repouso por 3 h, para evaporação do solvente e promoção uma maior interação dos</p><p>agrotóxicos com a amostra, antes da extração (a ser realizada conforme procedimento descrito no</p><p>tópico 3.3) O método será validado, avaliando-se os seguintes itens: curva analítica, linearidade,</p><p>limite de detecção (limit of detection, LOD), limite de quantificação (limit of quantification, LOQ),</p><p>exatidão (recuperação) e precisão (repetibilidade e precisão intermediária), parâmetros sugeridos</p><p>pela ANVISA (2006).</p><p>3 RESULTADOS E DISCUSSÃO</p><p>MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO</p><p>INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO CEARÁ - IFCE</p><p>PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO - PRPI</p><p>O estudo da determinação do intervalo de coleta e da recuperação do clorpirifós no hplc,</p><p>mostrou que ele começa a eluir do sistema aos 12 min e só termina sua eluição após 15 min. A</p><p>eficiência do QuEChERS na purificação de extratos de tomate para análise de resíduos de</p><p>pesticidas, fica demonstrada na Figura 1, que apresenta um cromatograma do padrão Clorpirifós na</p><p>concentração de 100 ppm, 50 ppm e 10 ppm. Pode-se notar a existência de muitos picos de</p><p>coextrativos no cromatograma, que podem causar interferência na quantificação do Clorpirifós,</p><p>tempo de retenção = 11,05. Para a construção das curvas analíticas injetou-se 3 vezes cada solução</p><p>padrão com concentrações de 0,05 ppm a 10 ppm, cobrindo toda a faixa de resposta para os níveis</p><p>de fortificações estudados, a média das áreas foram distribuídas m duas curvas analíticas (Fig. 2)</p><p>onde se obteve o coeficiente de correlação</p><p>(R2) igual a 0,998 e 0,9931, demonstrando uma ótima</p><p>linearidade de resposta do detector para a faixa estudada e está de acordo com o recomendado pela</p><p>Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América (EPA, 1996) e pelo Codex</p><p>Alimentarius (CODEX, 2000).</p><p>Figura 1 – Cromatograma do Clorpirifós 100ppm, 50ppm e 10ppm.</p><p>Fonte: Autores, 2017</p><p>Figura 2 – Curvas analíticas para o clorpirifós</p><p>Fonte: Autores, 2017</p><p>MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO</p><p>INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO CEARÁ - IFCE</p><p>PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO - PRPI</p><p>4 CONSIDERAÇÕES FINAIS</p><p>Considerando a performance analítica, o método proposto apresenta-se como ferramenta</p><p>alternativa para determinação de resíduos de Clorpirifós em amostras de tomate. A técnica escolhida</p><p>Quechers e (CLAE) possibilitou a determinação de Clorpirifós de forma rápida, simples e com</p><p>baixo custo.</p><p>5 REFERÊNCIAS</p><p>ARDREY, R. E.; Liquid Chromatography – Mass Spectrometry: An Introduction; John Wiley &</p><p>Sons Ltd, p. 276. 2003.</p><p>BLASCO, C.; PICÓ, Y.; MAÑES, J.; FONT, G.; J. Chromatogr. A. 947, 227. 2002.</p><p>CODEX ALIMENTARIUS. Pesticide Residues in Food – Methods of analysis and sampling.</p><p>Rome: Food and Agriculture of the United Nations, 2000. 2A, Part 1.</p><p>ECOBICHON D.J. Toxic effects of pesticides. In: Amdur MO, Doull J, Klaassen CD, editors.</p><p>Casarett and Doll’s toxicology: the basic science of poisons. 4th ed. New York: Mc Graw Hill. p.</p><p>565-622. 1993.</p><p>ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA) Residue Chemistry Test Guidelines. Office</p><p>of Prevention, Pesticides and Toxic Substances 860.1340: Residue Analytical Method. Washington:</p><p>EPA, 1996.12p.</p><p>GRISOLIA, C. K. A. Comparison between mouse and fish micronucleous test using</p><p>cyclophosphamide mitomyxin C and various pesticides. Mutation Research. v.518, p.145-150,</p><p>2002.</p><p>LEHOTAY, S. J.. J. Chromatogr., A 785, 289. 2002</p><p>PRESTES, O.D.; ADAIME, M.B.; ZANELLA, R.;. QUECHERS: possibilidades e tendências no</p><p>preparo de amostra para determinação multirresíduo de pesticidas em alimentos. Scientia</p><p>Chromatographica 2011; 3(1):51-64 Instituto Internacional de Cromatografia DOI:</p><p>10.4322/sc.2011.004 ISSN 1984-4433.</p><p>VOGEL, Arthur. Análise Química Quantitativa. 6ª ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Técnicos e</p><p>Científicos Editora S.A, 462p. 2002.</p>