Problema 01- módulo 10

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<p>Problema 01</p><p>Objetivos</p><p>01. Explicar o ciclo celular</p><p>a) interfase</p><p>b) Mitose</p><p>c) Regulação (proteínas, principalmente p16, cdk 4/6, cíclica D e RB)</p><p>02. Esclarecer o processo de replicação do DNA (telômero)</p><p>03. Compreender a importância da apoptose no ciclo celular</p><p>Objetivo 01</p><p>O ciclo celular</p><p>Todas as atividades que as células desempenham durante a divisão celular são organizadas em fases específicas</p><p>em um ciclo - o ciclo celular. Este é composto de 4 fases principais que ocorrem sempre na seguinte ordem: G1,</p><p>S, G2 e M (Figura 10.2). Essas fases são importantes para que a célula tenha tempo de duplicar seu material</p><p>antes da divisão e de verificar se todas as etapas estariam ocorrendo de maneira apropriada.</p><p>O núcleo e o citoplasma dividem-se na fase M, que é a primeira etapa do ciclo mitótico, quando os</p><p>cromossomos se separam. Na segunda parte, ocorre a divisão física do citoplasma, denominada citocinese. Após</p><p>as divisões nuclear e citoplasmática, a nova célula precisa avaliar o que fará na próxima etapa: se irá se</p><p>autorrenovar (iniciar um novo ciclo celular), se irá se diferenciar ou se irá morrer. Essa avaliação depende das</p><p>condições em que essa célula se encontra. Se as condições induzem a diferenciação celular ou a morte</p><p>programada, por exemplo, a célula pode sair do ciclo celular e iniciar a fase GO; caso contrário, a célula segue</p><p>para a fase G1. A fase G1 é a etapa em que a célula interpreta diferentes sinais provenientes do microambiente,</p><p>de células vizinhas e sinais internos, preparando-se para os próximos passos do ciclo celular. Nessa fase, a célula</p><p>cresce, isto é, aumenta em massa, confere a integridade do DNA e se há mitógenos e nutrientes. A célula pode</p><p>permanecer na fase G1 por um longo período antes de prosseguir com o ciclo celular, porém, se as condições</p><p>propiciam uma nova entrada no ciclo celular e a divisão da célula, ela prossegue pela fase G1. A próxima fase é</p><p>a de síntese de DNA, denominada fase S, quando todo o genoma da célula será duplicado uma única vez, por</p><p>um processo nomeado "replicação" (ver Capítulo 9). Na fase S também ocorre a síntese de histonas e a</p><p>duplicação dos centrossomos. Após a fase de síntese, a célula se direciona para a fase G2, na qual verificará se o</p><p>DNA se duplicou corretamente ou se ocorreu algum erro de replicação, para, então, preparar-se para a fase de</p><p>divisão das células: a fase M. As fases G1, S e G2, em conjunto, são conhecidas como interfase.</p><p>a) Interfase</p><p>Fase G1</p><p>Ao completar um ciclo, a nova célula avalia as condições para iniciar o próximo. Essa avaliação acontece</p><p>durante a fase G1. Nessa fase, a célula inativa temporariamente os complexos ciclina-CDK por meio da</p><p>destruição proteolítica das ciclinas através da ação do complexo APC e consequente inativação das CDKs. Essa</p><p>inativação é reforçada por ação das CKIs e pela supressão da expressão dos genes das ciclinas. Se as condições</p><p>nutricionais forem insuficientes ou se existirem sinais antiproliferativos no ambiente, as células retardam a</p><p>progressão do ciclo celular ou até mesmo saem do ciclo, entrando na fase GO.</p><p>Em contrapartida, se as condições forem favoráveis, os fatores proliferativos (mitógenos) ativam uma cascata de</p><p>sinalização intracelular que resulta na transcrição dos genes das ciclinas de G1 (ciclinas D), que se acumula na</p><p>célula apesar da atividade do APC. Isso é possível porque, diferentemente das demais ciclinas, as ciclinas de G1</p><p>não são alvo do complexo APC. Além disso, os complexos G1-CDKs também não são alvos das CKIs; portanto,</p><p>na fase G1, o APC e a CKI agem em conjunto para inibir as ciclinas-CDKs de outras fases, mas não modulam</p><p>G1-CDKs quando estas surgem.</p><p>Fase S</p><p>Para se dividir, primeiro a célula precisa fazer cópias do seu DNA original, e esse processo é denominado</p><p>"replicação", explicado em detalhes no Capítulo 9. A replicação do DNA acontece na fase S e é um processo</p><p>altamente controlado, para garantir que o genoma da célula seja duplicado corretamente e apenas uma vez por</p><p>ciclo. Havendo qualquer erro na replicação ou danos ao DNA, uma sinalização é ativada para que esse processo</p><p>seja temporariamente interrompido no ponto de checagem até que o problema seja sanado.</p><p>Como dito anteriormente, o primeiro ponto de checagem é o G1/S. Nesse ponto, a célula avalia as condições</p><p>ideais para a proliferação, ativando os complexos G1/S-CDKs e S-CDK que irão fosforilar proteínas que</p><p>iniciam a replicação do DNA, duplicação do centrossomo e demais proteínas dessa fase.</p><p>Superado o ponto de checagem G1/S, a célula entra na fase S de modo irreversível, pois o complexo S-CDK</p><p>fosforila e inativa as ciclinas de G1/S. Esse mecanismo de retroalimentação negativa impede que o ciclo celular</p><p>retroceda. Se ocorrerem erros ou danos durante a síntese, o ciclo será interrompido novamente mais adiante, no</p><p>ponto de transição entre as fases G2 e M, que é o ponto de checagem G2/M. Esse ponto previne que o DNA</p><p>danificado seja distribuído para as duas células-filhas durante a fase M, retardando o andamento do ciclo para</p><p>que o DNA possa ser reparado. É importante ressaltar que, na impossibilidade do reparo, as células sofrerão</p><p>morte celular ou senescência. Esses dois destinos são tão importantes quanto o reparo do DNA. Deficiências no</p><p>reparo do DNA, na execução da morte celular ou da senescência são causas comuns de tumores.</p><p>Cada fita dupla de DNA serve como modelo para a síntese da nova fita, por isso o primeiro passo é "abrir" a</p><p>dupla-fita de DNA. A abertura do DNA consiste na separação das pontes de hidrogênio que conectam as duas</p><p>cadeias de nucleotídios e é promovida pelas helicases, que transformam as fitas duplas em simples e são</p><p>recrutadas pelas S-CDKs ativadas. Nessa etapa, as DNA polimerases interagem com a fita simples de DNA e</p><p>sintetizam uma cadeia de nucleotídios complementares na sequência correta. O local do DNA em replicação</p><p>apresenta formato característico que parece um "Y" e recebe o nome de forquilha de replicação.</p><p>As forquilhas de replicação são alvos de pontos de checagem. Quando são detectadas falhas de pareamento de</p><p>nucleotídios na fita de DNA, vias de sinalização ativam as proteínas quinases ATR (do inglês</p><p>ataxia-telangiectasia mutated Rad3-related) no local da forquilha (Figura 10.9 C). As ATRs são proteínas</p><p>quinases que fosforilam e ativam outras quinases efetoras, como Rad3 (em leveduras) e Chkl (do inglês</p><p>checkpoint kinase 1) em mamíferos. Essas quinases efetoras ativadas interrompem a replicação, impedem o</p><p>desacoplamento das polimerases e evitam o início da fase M do ciclo celular até que o DNA seja completado.</p><p>Fase G2</p><p>Nessa fase, a cromatina e o citoesqueleto começam a se preparar para as alterações estruturais da fase M.</p><p>Contudo, se algum DNA danificado for detectado na fase G2, os pontos de checagem retardarão a passagem</p><p>para essa fase até que aconteça o reparo.</p><p>A entrada em mitose é regulada pelo complexo M-CDK (CDK1-Ciclina B1) formado na fase G2. Enquanto a</p><p>CDK1 é expressa constantemente durante as fases do ciclo celular, a S-CDK (que permanece ativa até o fim de</p><p>G2) ativa a expressão do gene da ciclina M (ciclina B1) nessa fase. Dessa maneira, os níveis dessa ciclina</p><p>aumentam gradativamente.</p><p>Apesar disso, o complexo M-CDK permanece inativo devido a uma fosforilação inibitória na CDK, mencionada</p><p>anteriormente. Para que o complexo M-CDK cumpra seu papel, o fosfato inibitório deve ser removido.</p><p>A presença ou ausência do fosfato inibitório é controlada por duas enzimas que desempenham um papel central</p><p>no controle do ciclo celular: a quinase Weel e a fosfatase cdc25 (Figura 10.10). A quinase Weel adiciona um</p><p>fosfato inibitório a M-CDK. Em contrapartida, por meio de um ativador ainda desconhecido, cdc25 é acionada,</p><p>resultando na remoção do fosfato inibitório e na ativação de M-CDK. Essa regulação tem um mecanismo de</p><p>retroalimentação positiva muito importante, que torna a ativação da M-CDK "tudo ou nada". Cdc25 e Weel são</p><p>alvos da própria M-CDK, porém o efeito dela sobre ambas é oposto. A fosforilação de Cdc25 pela M-CDK é</p><p>ativadora (feedback positivo); em contraste, a fosforilação</p><p>de Weel a inativa (feedback negativo). Dessa</p><p>maneira, a ativação de poucas moléculas de M-CDK é ampliada para que se ative cada vez mais complexos</p><p>M-CDKs.</p><p>b) mitose</p><p>A fase M do ciclo celular é destinada à segregação das cromatides duplicadas durante a fase</p><p>S. Ao microscópio, a fase M chama atenção pelas alterações notáveis que acontecem no núcleo da célula. A</p><p>maior diferença entre a mitose e as outras fases do ciclo (interfase) está relacionada com as mudanças</p><p>morfológicas dos cromossomos, que se condensam, se conectam aos microtúbulos e associam-se às proteínas do</p><p>fuso mitótico, e se separam de suas cromátides-irmãs. Todo esse processo é dividido em cinco fases, com base</p><p>no estado dos cromossomos e do fuso mitótico. Em sequência temporal de ocorrência, essas fases são prófase,</p><p>prometáfase, metáfase, anáfase e telófase (Figura 10.11), que serão detalhadas a seguir. Alguns autores</p><p>consideram a separação física da célula como uma sexta fase da mitose, conhecida como citocinese.</p><p>A ativação de M-CDK no final de G2 resulta na fosforilação de centenas de substratos.</p><p>Dentre eles, há fatores que auxiliam em montagem das fibras do fuso, condensação dos cromossomos e</p><p>alinhamento das cromátides-irmãs na região equatorial da célula . Além disso, as M-CDKs fosforilam as</p><p>laminas da lâmina nuclear, promovendo a desmontagem do envelope nuclear.</p><p>Na metáfase, a checagem do fuso mitótico serve para verificar se ocorreram deficiências na condensação dos</p><p>cromossomos ou se as cromátides-irmãs não foram corretamente alinhadas e conectadas às fibras do fuso. Nesse</p><p>ponto, a célula interrompe a progressão até que a montagem das fibras e sua interação com as cromátides sejam</p><p>corrigidas. Esse ponto de checagem garante que a segregação dos cromossomos aconteça corretamente.</p><p>Prófase</p><p>A prófase é marcada pela compactação da cromatina, ou seja, quando o material genético da célula começa a</p><p>condensar, diminuindo o espaço que o DNA ocupa no núcleo, ao mesmo tempo que a cromatina se torna mais</p><p>espessa. Nessa fase, os complexos de transcrição são inativados e a célula interrompe, temporariamente, as</p><p>transcrições. Por causa da compactação, o DNA apresenta-se em unidades visíveis denominadas cromossomos.</p><p>Essa compactação é mediada, em parte, pelas proteínas coesina e condensina, que formam complexos proteicos</p><p>(Figura 10.12). As coesinas formam anéis ao redor das cromátides-irmãs mantendo-as unidas, e as condensinas</p><p>ligam-se e circundam o DNA em múltiplos locais, torcendo a cromatina até que esta se dobre, promovendo seu</p><p>empacotamento.</p><p>Com a compactação do DNA, o nucléolo se dispersa e libera suas partículas no nucleoplasma. Componentes do</p><p>poro nuclear e fibras de lamina da lâmina nuclear são hiperfosforiladas pela ação de M-CDK, o que faz com que</p><p>as laminas se dispersem em forma de proteínas solúveis no núcleo, enfraquecendo o envelope nuclear e</p><p>promovendo seu desmonte. O aumento do cálcio intracelular e a ativação da proteína quinase C (PKC; ver</p><p>Capítulo 6) participam da dissolução do envelope nuclear, que acaba desaparecendo. Curiosamente, nem todos</p><p>os eucariotos apresentam a dissolução do envelope nuclear. Amebas e alguns fungos, por exemplo, mantêm o</p><p>envelope nuclear durante a mitose.</p><p>No citoplasma, a síntese de proteínas diminui com a redução de atividade dos ribossomos. Os microtúbulos</p><p>preexistentes e os microfilamentos de actina perdem sua estabilidade e despolimerizam-se no citoplasma;</p><p>porém, novos microtúbulos começam a se formar a partir dos centrossomos, iniciando a montagem do fuso</p><p>mitótico. As alterações do citoesqueleto durante a prófase são inter-relacionadas, pois as proteínas do</p><p>citoesqueleto que se desarranjaram serão reutilizadas na formação do fuso mitótico e na citocinese. Além disso,</p><p>a célula torna-se arredondada e mais simétrica, possibilitando a distribuição uniforme do seu conteúdo entre as</p><p>células-filhas.</p><p>Prometáfase</p><p>Nessa fase, os cromossomos interagem com os microtúbulos do fuso mitótico, conectando-se e garantindo que</p><p>as cromátides estejam ancoradas nesse fuso antes de sua segregação.</p><p>Cada cromátide apresenta uma região de sequência de DNA especializada que conecta o par de</p><p>cromátides-irmãs entre si, denominada centrômero. Na prometáfase, os centrômeros formam complexos com</p><p>múltiplos peptídios e proteínas, que se transformam em uma região especializada que recebe o nome de</p><p>cinetocoro, o qual interage com os microtúbulos (Figura 10.14). Dentro desse complexo de proteínas,</p><p>encontram-se proteínas fibrosas que se ligam à parede dos microtúbulos, como Ndc80, NKL1, CLASP1 e</p><p>CENP-F, por exemplo. Também participam da composição do cinetocoro as proteínas motoras, como a dineína e</p><p>a cinesina (ou quinesina), que se ligam aos microtúbulos, auxiliando-os na sua dinâmica e no deslocamento dos</p><p>cromossomos (ver Capítulo 7).</p><p>Antes de encontrarem os cromossomos, os microtúbulos do fuso mitótico são dinâmicos, polimerizando-se em</p><p>direção aos cromossomos e despolimerizando-se constantemente, em busca de um cinetocoro. Ao fazerem</p><p>contato com essa região, os microtúbulos do fuso estabilizam-se e interrompem essa dinâmica de "vai e volta"</p><p>Apenas quando todos os cromossomos estão apropriadamente ligados a um microtúbulo do fuso mitótico, a</p><p>célula passa para a próxima etapa da mitose.</p><p>Metáfase</p><p>O alinhamento dos cromossomos na região central da célula estabelece a fase de metáfase. O alinhamento na</p><p>região equatorial coloca todos os cromossomos na mesma "região de partida" antes da separação física das</p><p>cromátides. Esse arranjo central diminui as chances da distribuição desigual dos cromossomos durante a</p><p>segregação. Os cromossomos alinham-se na região central pela ação dos cromossomos do fuso e das proteínas</p><p>do cinetocoro. Esse alinhamento é conhecido como placa metafásica. Com o surgimento da placa metafásica, a</p><p>M-CDK fosforila e ativa o complexo APC, promovendo a proteólise das ciclinas M e S, e a consequente</p><p>inativação das CDKs associadas a essas ciclinas; portanto, a M-CDK promove a sua própria inativação.</p><p>Os cromossomos só serão separados se todas as cromátides estiverem conectadas aos microtúbulos do fuso e</p><p>apropriadamente alinhadas na placa metafásica. O fim da metáfase é marcado pelo início da separação das</p><p>cromátides-irmãs. Esse processo é importante, pois é um ponto irreversível, ou seja, uma vez iniciado, as</p><p>cromátides serão separadas na anáfase.</p><p>Anafase</p><p>As cromátides são separadas pela ação da enzima separase, que hidrolisa as coesinas que mantêm as</p><p>cromátides-irmãs unidas. Os microtúbulos despolimerizam-se em direção ao seu polo de origem, carregando as</p><p>cromátides a eles associadas para a periferia da célula (Figura 10.16). De modo interessante, ao mesmo tempo</p><p>que as cromátides se direcionam para o polo, a força exercida por esses microtúbulos para chegarem ao polo</p><p>"empurra" esse polo para fora, fazendo com que a célula se torne mais alongada e aumentando a distância entre</p><p>os polos opostos. Esse alongamento é importante, pois ajudará na separação física das células-filhas nas</p><p>próximas etapas da mitose.</p><p>Essas movimentações envolvem a dinâmica de polimerização dos microtúbulos e as proteínas motoras</p><p>associadas. O encurtamento dos microtúbulos que estão conectados aos cinetocoros acontece pela perda de</p><p>subunidades de tubulina nesses complexos proteicos, fazendo com que o microtúbulo se retraia em direção ao</p><p>polo de origem. Esse movimento denomina-se anáfase A. Nessa fase, as proteínas motoras cinesina e dineína,</p><p>presentes no cinetocoro, podem participar da ligação do cromossomo ao microtúbulo que está se</p><p>despolimerizando, fazendo com que o encurtamento desse microtúbulo carregue a cromátide para próximo do</p><p>polo mitótico.</p><p>Telófase</p><p>Ao final da anafase, dois conjuntos de cromossomos são encontrados em polos opostos da célula (Figura 10.17).</p><p>A inativação da M-CDK promove a desfosforilação de várias proteínas, favorecendo o restabelecimento do</p><p>envelope e da lâmina nuclear. O complexo APC permanece ativo e há aumento da expressão de CKIs,</p><p>garantindo que as CDKs permaneçam inativas durante a fase G1 das células recém-geradas.</p><p>No começo da</p><p>telófase, os cromossomos condensam-se ainda mais por causa da atividade da condensina, ficando bem</p><p>próximos do fuso do polo mitótico. As proteínas da região interna do envelope nuclear ligam-se aos</p><p>cromossomos recém-separados, formando pedaços de envelope nuclear que se conectam entre si e se fundem,</p><p>criando novo envelope nuclear ao redor dos cromossomos recém-divididos. Nesse ponto, os poros nucleares</p><p>também se reorganizam, permitindo que a célula reestabeleça a relação entre o nucleoplasma e o citoplasma.</p><p>Ao final da telófase, condensinas perdem sua atividade e a cromatina começa a se descondensar, as transcrições</p><p>que foram interrompidas na prófase são reativadas e o nucléolo forma-se novamente. Em muitas células, a</p><p>próxima etapa consiste na separação física das duas células-filhas, dividindo o citoplasma em dois, em um</p><p>processo denominado citocinese. Algumas células, como as musculares esqueléticas, por exemplo, não fazem</p><p>citocinese, formando longas fibras de células multinucleadas.</p><p>Citocinese</p><p>A separação física das duas células-filhas, ou citocinese, ocorre pelo arranjo bem orquestrado de moléculas do</p><p>citoesqueleto, que começa muito antes da última fase da mitose. Durante a mitose, o fuso mitótico direciona os</p><p>cromossomos para a periferia da célula. A citocinese deve ocorrer exatamente na região que fica entre esses</p><p>cromossomos segregados, conhecida como região interzonal ou zona intermediária do fuso. Esse espaçamento</p><p>garante que cada célula-filha receba um conjunto completo de cromossomos, além de organelas e componentes</p><p>citoplasmáticos.</p><p>Nessa região interzonal surge um sulco de clivagem, caracterizado por uma leve dobra na superfície celular</p><p>(como se fosse a "cintura" da célula), que se aprofunda para dentro da célula conforme a mitose progride. A</p><p>porção intracelular do sulco contém filamentos de actina, miosina II e outras proteínas que se tornam cada vez</p><p>mais organizadas ao redor da região interzonal (ver Figura 10.18 B). A miosina Il intercala-se entre filamentos</p><p>de actina, e toda essa estrutura recebe o nome de anel contrátil, por causa da capacidade de contração criada por</p><p>esse arranjo (ver Capítulo 7). A redução de diâmetro desse anel inicia a separação física entre os componentes</p><p>das duas células-filhas. Durante essa contração, os microtúbulos da região interzonal começam a se compactar</p><p>em uma estrutura eletrodensa denominada "corpo mediano". Conforme a contração continua e os componentes</p><p>citoplasmáticos separam-se completamente entre as duas células, as células-filhas permanecem conectadas</p><p>apenas pelos microtúbulos condensados da região do corpo mediano, formando uma ponte citoplasmática entre</p><p>as células.</p><p>c)</p><p>Controle do ciclo celular</p><p>As fases do ciclo celular são controladas por muitos agentes reguladores que viabilizam ou restringem sua</p><p>progressão, como se fossem sinais e agentes de trânsito checando as condições do veículo e sua documentação</p><p>antes de liberar a viagem (Figura 10.4). Esses mecanismos garantem que eventos importantes do ciclo, como a</p><p>replicação do DNA ou a separação dos cromossomos, por exemplo, aconteçam corretamente e no momento</p><p>adequado. Os reguladores também garantem que os eventos do ciclo celular aconteçam na sequência apropriada,</p><p>certificando-se de que a progressão por uma fase do ciclo ative os eventos necessários para o início da próxima</p><p>fase. Por exemplo, a progressão pela fase G1 inclui os preparativos para que a fase S possa iniciar em seguida.</p><p>Esse controle é muito importante, pois, ao longo do ciclo, podem ocorrer diferentes erros (mutações, deleções,</p><p>quebras, replicação incompleta do DNA, por exemplo) ou as condições para que a célula gere uma nova célula</p><p>podem não ser ideais (insuficiência de nutrientes e/ou de mitógenos). Pelos motivos expostos, essas etapas do</p><p>ciclo são constantemente monitoradas e sua progressão pode ser interrompida por agentes reguladores até que a</p><p>célula corrija o erro.</p><p>principais agentes que controlam o andamento do ciclo celular e os pontos importantes em que a célula analisa</p><p>as condições para o progresso do ciclo, chamados "pontos de checagem". As principais famílias de agentes</p><p>reguladores da progressão do ciclo celular são as ciclinas, as quinases dependentes de ciclinas (do inglês cyclin</p><p>dependent kinases [CDK]), os inibidores de CDKs (CKI), as proteínas E2F e Rb e dois complexos proteicos que</p><p>promovem a proteólise: o SCF e o APC.</p><p>Ciclinas e CDKs</p><p>As CDKs (quinases dependentes de ciclinas) são enzimas serina/treonina-quinases que fosforilam muitos alvos</p><p>essenciais relacionados com o controle do ciclo celular. Essas quinases são expressas continuamente na célula e</p><p>se mantêm na forma inativa até que se associem a proteínas ciclinas, sendo ativadas . As ciclinas recebem esse</p><p>nome pois sua expressão é cíclica, dependente do estágio do ciclo celular. Em determinadas fases do ciclo, sua</p><p>expressão aumenta por ativação da expressão de seus genes ou diminui rapidamente, quando não são mais</p><p>necessárias, pela ação de complexos de degradação.</p><p>Dessa maneira, as ciclinas são subunidades regulatórias periodicamente sintetizadas e degradadas pela célula.</p><p>Sozinhas, as ciclinas não têm atividade enzimática, porém, quando estão associadas às CDKs, formam um</p><p>complexo ativado que regula diferentes etapas do ciclo. Mais de 11 ciclinas e 20 CDKs diferentes já foram</p><p>identificadas em mamíferos até o momento, e cada complexo formado por uma ciclina e uma CDK específica</p><p>regula uma ação específica no ciclo celular.</p><p>As ciclinas são nomeadas de acordo com o estágio celular em que atuam em conjunto com as respectivas CDKs.</p><p>As classes mais comuns de ciclinas são as da fase G1, ciclinas da fase 1/S, ciclinas da fase S e ciclinas da fase M</p><p>(Figura 10.5 B e C). As ciclinas da fase M, em conjunto com as CDKs específicas, formam complexos M-CDK</p><p>e atuam para a entrada da célula na fase M do ciclo, assim como as ciclinas da fase G1 formam complexos</p><p>G1-CDK e promovem a progressão da célula pela fase G1, e assim por diante.</p><p>Inibidores de CDKs</p><p>Os reguladores que ativam a progressão do ciclo celular são tão importantes quanto aqueles que interrompem</p><p>sua atividade. Para controlar a atividade do complexo ciclina-CDK, existe uma categoria de proteínas</p><p>denominadas "inibidores de CDKs" - CKIs ou CDIs. A importância dessas proteínas torna-se evidente em</p><p>animais que apresentam defeitos nessas proteínas inibidoras. Esses indivíduos manifestam crescimento corporal</p><p>anormal e hiperplasia de órgãos.</p><p>As CKIs associam-se às CDKs ou aos complexos formados pelas ciclinas e CDKs para inibir sua ação (Figura</p><p>10.6). Elas são divididas em duas classes: as que pertencem à família INK4 e aquelas que são da família</p><p>Cip/Kip.</p><p>A família INK4 é composta das proteínas p16INK4, p15INK4b, p18INK4c e p19INK4d. Essas proteínas</p><p>ligam-se às CDKs e impedem sua interação com a ciclina correspondente, ou seja, competem com as ciclinas</p><p>pelo sítio de ligação com as CDKs, inibindo diretamente sua ação.</p><p>A família Cip/Kip (do inglês CDK interacting protein e Kinase inhibitory protein) é composta de três membros:</p><p>p21 Cipl, p27kipl e p57kip2. Essas proteínas inibem a atividade das CDKs através da formação de um complexo</p><p>trimérico entre as ciclinas, as CDKs e as CKIs.</p><p>As Cip/Kip apresentam capacidade inibitória mais ampla que as INK4, interagindo com vários complexos e</p><p>inibindo-os em diferentes fases do ciclo, como no fim da fase G1 e no início da fase S. Ao interagir com o</p><p>complexo G1-CDK, por exemplo, elas previnem a fosforilação de Rb durante a transição de G1 para S (ver</p><p>tópico "Rb e E2F', adiante), tornando-se importantes mecanismos de regulação do ciclo celular.</p><p>Rb e E2F</p><p>Como mencionado anteriormente, a ciclina de Gl interage com as CDKs de G1. Os complexos G1-CDKs e</p><p>G1/S-CDKs promovem a progressão do ciclo celular pela fase G1.</p><p>Um dos principais alvos das G1-CDK é a proteína retinoblastoma (Rb), que reprime a transição da fase Gl para</p><p>S (Figura 10.7). Essa proteína exerce atividade inibitória constante no fator de transcrição E2F. E2F ativa a</p><p>transcrição dos genes necessários para a</p><p>síntese de DNA e de outras ciclinas que atuam nas fases G1/S e S,</p><p>como as ciclinas E e A.</p><p>Os complexos G1/S-CDK (ciclina E-CDK2) e S-CDK (ciclina A-CDK2) também fosforilam Rb,</p><p>retroalimentando positivamente a liberação de E2F.</p><p>Em humanos, as proteínas Rb têm 16 sítios de fosforilação conhecidos que são alvos de CDKs, e sua</p><p>fosforilação varia ao longo do ciclo celular. Quando o complexo G1-CDK fosforila Rb, uma cascata de reações</p><p>tem início, resultando na ativação de complexos G1/S CDKs e S-CDKs e na remoção da repressão do ciclo</p><p>exercida por Ro, tornando possível a progressão da célula para a fase S.</p><p>Complexos SCF e APC</p><p>Para que o ciclo celular prossiga pelas fases na ordem correta (G1-S-G2-M) e de modo irreversível, a célula</p><p>destrói os reguladores utilizados na fase anterior e mantém apenas os das próximas fases sob controle, evitando,</p><p>assim, que esses agentes atuem em momentos errados do ciclo.</p><p>Essa destruição atinge as ciclinas, as CDKs e as CKIs, sendo promovida por dois grandes complexos proteicos</p><p>que regulam a proteólise no ciclo celular: os complexos SCF e APC.</p><p>O complexo SCF recebe esse nome por causa dos três componentes mais importantes que fazem parte deste</p><p>grupo: Skp1, Cullin e F-box. Esse grupo de proteínas "marca" os reguladores que serão degradados, por adição</p><p>de outras pequenas proteínas denominadas "ubiquitinas".</p><p>Objetivo 02</p><p>Replicação</p><p>É o processo pelo qual uma nova cópia do DNA de uma célula é sintetizada a cada ciclo celular. Esse</p><p>mecanismo é essencial na proliferação celular, pois provê às novas células material genético idêntico ao da</p><p>célula-mãe. Para que as células-filhas sejam idênticas às células progenitoras, a replicação deve ocorrer de</p><p>maneira precisa, completa (i. e., todo o DNA deve ser replicado) e somente uma vez por ciclo (ver Capítulo 10).</p><p>O DNA é composto de duas cadeias de nucleotídios associados em uma dupla-hélice. Essas cadeias estão</p><p>ligadas por bases nitrogenadas complementares que interagem entre si por meio de pontes de hidrogênio (ver</p><p>Capítulo 2). Em essência, a replicação consiste na abertura da dupla-fita de DNA, de modo a expor as bases</p><p>nitrogenadas da fita molde às DNA polimerases e outras moléculas essenciais na síntese de uma nova fita de</p><p>DNA. Neste capitulo, será abordada especialmente a replicação em células de eucariotos.</p><p>Montagem do complexo pré-replicativo</p><p>Embora a replicação propriamente dita ocorra na fase S do ciclo celular, a montagem da maquinaria responsável</p><p>por esse processo começa em G1. O propósito dessa montagem é preparar o DNA para "disparar" a replicação,</p><p>caso a célula supere a transição G1/S. Cada molécula de DNA apresenta várias sequências de nucleotídios,</p><p>denominadas "origem de replicação". Há várias origens de replicação em uma molécula de DNA, portanto o</p><p>DNA é duplicado simultaneamente em múltiplos pontos. Estudos recentes indicam que a localização do</p><p>cromossomo no núcleo e a cromatina, mais do que a sequência de DNA, definem o local das origens de</p><p>replicação. Essas origens de replicação estão reunidas nas fábricas de replicação, à semelhança das fábricas de</p><p>transcrição. O DNA replicado sob o controle de uma mesma origem de replicação é denominado replicon. As</p><p>origens de replicação são reconhecidas pelo complexo reconhecedor da origem ORC1-6 (do inglês origin</p><p>recognition complex). A esse complexo, ligam-se as proteínas Cdtl e Cdeo e, em seguida, a DNA-helicase ainda</p><p>não ativa (complexo Mem2-7), formando o complexo pré-replicativo (Figura 9.24 A). Muitos autores</p><p>referem-se ao DNA pronto para ser replicado como "DNA licenciado" (licensed DNA) e ao processo de</p><p>montagem do complexo pré-replicativo como RSL (do inglês replication licensing system). Algumas</p><p>subunidades do complexo proteico ORC1-6, da DNA-helicase (complexo Mem) e do Cdc6 são membros de</p><p>uma familia de ATPases denominada "AAA+". Essas enzimas usam a energia do ATP para alterar a</p><p>conformação de moléculas grandes como o DNA. A helicase é um anel que se mantém ao redor da fita molde e</p><p>tem a função de desenrolar e desfazer as pontes de hidrogênio para separar a dupla-fita de</p><p>DNA à medida que a replicação prossegue. Por isso, ela acompanha a DNA polimerase na forquilha de</p><p>replicação, que será explicada adiante.</p><p>Montagem do complexo de pré-iniciação</p><p>Na fase S do ciclo celular, a ativação da S-Cdk resulta na fosforilação e na degradação dos componentes do</p><p>complexo pré-replicativo. Outras CDKs também atuam do mesmo modo.</p><p>Como essas quinases só serão inativadas no final de M, novos complexos de pré-replicação não serão montados,</p><p>garantindo que a replicação ocorra uma só vez por ciclo (Figura 9.25; ver</p><p>Capítulo 10). Proteínas do complexo de pré-iniciação e as DNA polimerases a, 8, e e associam-se à origem de</p><p>replicação e ativam a helicase (Mcm2-7), dando início à replicação.</p><p>Figura 9.24 Montagem dos complexos de pré-replicação e de pré-iniciação de replicação. A. O complexo</p><p>proteico ORC1-6 (do inglês origin replication complex) reconhece e se liga às sequências de ácido</p><p>desoxirribonucleico (DNA), que correspondem às origens de replicação. Em seguida, as proteínas Cdt1 e Cdc6</p><p>unem-se ao ORC1-6. 0 complex ORC1-6-Cdt1-Cdc6 recruta as proteínas do complexo Mcm2-7, que é a própria</p><p>DNA-helicase. O recrutamento da DNA-helicase (ainda inativa) marca o término da montagem do complexo de</p><p>pré-replicação. B. A ativação das S-Cdks resulta na ligação das proteínas do complexo de pré-iniciação, que</p><p>ativa DNA-helicase e desloca as proteínas Cdt1 e Cdc6. A abertura da dupla-fita de DNA permite que as DNA</p><p>polimerases se acoplem ao DNA, iniciando sua replicação.</p><p>Montagem do complexo de elongação</p><p>A primeira ação necessária é a abertura da dupla-hélice de DNA. Essa função é executada pela DNA-helicase,</p><p>enzima que já estava presente no complexo pré-replicativo (Mcm2-7). Como as origens de replicação estão no</p><p>meio da dupla-fita de DNA, ao se abrirem originarão uma bolha de replicação com duas forquilhas de replicação</p><p>que progredirão em sentidos opostos (Figura 9.26 A).</p><p>Antes de descrever a replicação, é preciso compreender como funcionam as DNA polimerases. Há dois detalhes</p><p>importantes: o primeiro é o fato de essas polimerases não serem capazes de iniciar uma nova cadeia de DNA,</p><p>elas só adicionam novos nucleotídios a uma sequência de nucleotídios preexistente anelada à fita molde; o</p><p>segundo é o fato de as DNA polimerases só conseguirem adicionar um novo nucleotídio a uma hidroxila do</p><p>carbono 3, denominada "extremidade 3'-OH", e não à outra extremidade, onde há um fosfato no carbono 5</p><p>(Figura 9.26 B). Devido a essas duas características e ao fato da dupla-fita de DNA ser antiparalela (ver</p><p>Capítulo 2), um lado da forquilha é replicado continuamente (por isso é conhecido como fita contínua) e o outro</p><p>é replicado descontinuamente (por isso denominado "fita descontínua") (Figura 9.26 C). Curiosamente, a</p><p>replicação começa com a síntese de um fragmento de RNA de cerca de 7 a 14 nucleotídios (RNA iniciador, ou</p><p>primer) catalisada pela polimerase-alfa primase (Pol a). Em seguida, essa mesma enzima adiciona 10 a 20</p><p>desoxiribonucleotídios ao fragmento de RNA, produzindo, então, um primer híbrido de RNA/DNA</p><p>(Figuras 9.26 A e 9.27). A partir daí a replicação nas fitas contínua e descontínua seguem caminhos diferentes:</p><p>na fita contínua, a Pol-a é desacoplada do sistema pela ação conjunta dos fatores RFC (do inglês replication</p><p>factor C), PCNA (do inglês proliferating cell nuclear antigen) e pela DNA polimerases &, que seguirá</p><p>adicionando desoxiribonucleotídios e replicando a fita contínua (ver Figura 9.27, lado esquerdo). Na fita</p><p>descontínua, a Pol-a sintetiza o primer de RNA-DNA várias vezes ao longo da fita. Em seguida, a Pol-a é</p><p>removida pelos mesmos fatores RFC e PCNA e substituída pela DNA polimerase &. A DNA polimerase o, por</p><p>sua vez, adiciona cerca de 200 desoxiribonucleotídios.</p><p>Esses pedaços formados pelo primer RNA/DNA e mais 200 nucleotídios são chamados "fragmentos de</p><p>Okasaki" (ver Figuras 9.26 e 9.27). A PCNA também cumpre o importante papel de manter as polimerases</p><p>associadas à fita molde, de</p><p>tal modo que elas sintetizem longos trechos de DNA. Sem a PCNA, as DNA</p><p>polimerases "caem" rapidamente do trilho, interrompendo a replicação. Participam dessa etapa moléculas que</p><p>estabilizam e protegem a fita simples de DNA aberta pela helicase - as RPA (do inglês replication protein A) -,</p><p>também conhecidas por SSBs (do inglês single strand binding proteins). Além dessas, uma topoisomerase</p><p>posiciona-se logo à frente da forquilha de replicação para</p><p>aliviar a tensão provocada pela helicase (ver Figura 9.27). A replicação progride nos dois sentidos até que uma</p><p>forquilha se comunique com uma outra iniciada em uma origem de replicação adjacente. Com esse encontro, as</p><p>polimerases dissociam-se do DNA, nucleases clivam os pedaços de primers de RNA e as ligases unem os</p><p>fragmentos de Okasaki.</p><p>Replicação dos telômeros</p><p>As extremidades dos cromossomos lineares precisam de umas etapas a mais para serem replicadas.</p><p>Enquanto a fita contínua pode ser replicada até o último nucleotídio, a extremidade descontínua não apresenta</p><p>espaço para sintetizar um último fragmento de Okasaki. Se esse pedaço se mantivesse como fita simples,</p><p>rapidamente seria reconhecido e clivado por nucleases. Com isso, o cromossomo perderia um pedaço a cada</p><p>nova divisão celular, o que terminaria comprometendo o material genético. Esse problema é evitado pelos</p><p>telômeros, longos trechos de DNA repetitivo (10 kb em humanos) nas extremidades dos cromossomos. Essa</p><p>sequência repetitiva é sintetizada pela enzima telomerase. A telomerase estende a extremidade da fita molde</p><p>contínua (rica em resíduos de guanina), usando como molde uma sequência de RNA presente em sua própria</p><p>estrutura que pareia com as sequências repetitivas (Figura 9.28). O domínio catalitico da telomerase</p><p>assemelha-se com as transcriptases reversas, enzimas que usam um molde de RNA para sintetizar um DNA. A</p><p>replicação é terminada por uma DNA polimerase, prevenindo o encurtamento dos cromossomos. Ao final desse</p><p>processo, a extremidade 3' sempre termina despareada, montando uma "argola" no final de cada cromossomo,</p><p>denominada "T-loop".</p><p>objetivo 03</p>