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CAPÍTULO Ciclo celular 17 A única maneira de formar uma nova célula é duplicando uma célula já existente. Esse NESTE CAPÍTULO fato simples, inicialmente estabelecido na metade do século XIX, traz consigo uma profunda mensagem de continuidade da vida. Todos os organismos vivos, da bactéria VISÃO GERAL DO CICLO unicelular ao mamífero multicelular, são produtos de repetidos ciclos de crescimento CELULAR e divisão celular que remontam aos primórdios da vida na Terra, há mais de 3 bilhões de anos. SISTEMA DE CONTROLE DO Uma célula se reproduz ao executar uma sequência organizada de eventos em CICLO CELULAR que ela duplica seu conteúdo e, então, divide-se em duas. Esse ciclo de duplicação e divisão, conhecido como ciclo celular, é o mecanismo essencial pelo qual todos os FASE S seres vivos se reproduzem. Em espécies unicelulares, como bactérias e leveduras, cada divisão celular produz um novo organismo completo. Em espécies multicelulares, MITOSE sequências longas e complexas de divisões celulares são necessárias à produção de CITOCINESE um organismo funcional. Mesmo no indivíduo adulto, a divisão celular normalmente é necessária à substituição das células que morrem. Na verdade, cada um de nós deve MEIOSE fabricar milhões de células a cada segundo simplesmente para sobreviver: se toda a di- visão celular fosse interrompida por exposição a uma alta dose de raios X, por exem- CONTROLE DA DIVISÃO E DO plo morreríamos em poucos dias. CRESCIMENTO CELULAR Os detalhes do ciclo celular variam de organismo para organismo e em diferen- tes fases da vida de um organismo. Certas características, contudo, são universais. No mínimo, a célula deve executar sua tarefa fundamental: passar as informações gené- ticas para a próxima geração de células. Para produzir duas células-filhas genetica- mente idênticas, DNA de cada cromossomo deve primeiro ser fielmente replicado para produzir duas cópias completas. Os cromossomos replicados devem então ser acuradamente distribuídos (segregados) para as duas células-filhas, assim cada uma recebe uma cópia completa do genoma (Figura 17-1). Além da duplicação do genoma, a maioria das células também duplica suas outras organelas e macromoléculas; se não fosse assim, as células-filhas ficariam menores a cada divisão. Para manter seu tama- nho, as células em divisão devem coordenar o crescimento (i.e., o aumento da massa celular) com a divisão. Este capítulo descreve os eventos do ciclo celular e como eles são controlados e coordenados. Começaremos com um breve panorama geral do ciclo celular. Descreve- remos sistema de controle do ciclo celular, uma rede complexa de proteínas reguladoras que disparam diferentes eventos do ciclo. Na sequência, consideraremos de forma deta- lhada os principais estágios do ciclo celular, nos quais os cromossomos são duplicados e então segregados em duas células-filhas. Por fim, consideraremos como sinais extrace- lulares governam as taxas de crescimento e divisão celular e como esses dois processos são coordenados. VISÃO GERAL DO CICLO CELULAR A função básica do ciclo celular é duplicar a imensa quantidade de DNA nos cromosso- mos e, então, segregar as cópias em duas células-filhas geneticamente idênticas. Esses processos definem as duas principais fases do ciclo celular. A duplicação dos cromosso- mos ocorre durante a fase (S de síntese de DNA), que requer de 10 a 12 horas e ocupa cerca de metade do tempo do ciclo celular de uma célula típica de mamífero. Após a fase S, a segregação dos cromossomos e a divisão celular ocorrem na fase M (M de mitose), que requer muito menos tempo (menos de 1 hora em uma célula de mamífero). A fase M compreende dois eventos principais: a divisão nuclear, ou mitose, durante a qual os964 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-1 o ciclo celular. A divisão de uma célula eucariótica hipotética com dois cromossomos (um vermelho e outro preto) é mostrada para ilustrar como duas Células-filhas células-filhas geneticamente idênticas são produzidas em cada ciclo. Em geral, cada uma das células-filhas continuará a se dividir, passando por ciclos celulares 3 DIVISÃO adicionais. CELULAR CRESCIMENTO CICLO 1 CELULAR E CELULAR REPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA 2 SEGREGAÇÃO CROMOSSÔMICA cromossomos copiados são distribuídos em um par de núcleos-filhos; e a divisão cito- plasmática, ou citocinese, quando a própria célula se divide em duas (Figura 17-2). Ao fim da fase S, as moléculas de DNA em cada par de cromossomos duplicados se entrelaçam e são mantidas fortemente unidas por ligações proteicas especializadas. No começo da mitose, em um estágio chamado de prófase, as duas moléculas de DNA são gradativamente desembaraçadas e condensadas em pares de bastonetes rígidos e compactos chamados de cromátides-irmãs, as quais permanecem ligadas por meio da coesão de cromátides-irmãs. Quando posteriormente o envelope nuclear se desfaz na mi- tose, os pares de cromátides-irmãs ficam ligados ao fuso mitótico, um gigantesco arranjo bipolar de microtúbulos (discutido no Capítulo 16). As cromátides-irmãs são fixadas a polos opostos do fuso, e, por fim, alinham-se na placa equatorial do fuso em um estágio chamado de metáfase. A destruição da coesão de cromátides-irmãs, no início da anáfase, separa as cromátides-irmãs, que são puxadas para polos opostos do fuso. Em seguida, o fuso se desfaz e os cromossomos segregados são empacotados em núcleos separados na telófase. Então, a citocinese cliva a célula em duas, de forma que cada célula-filha herde um dos dois núcleos (Figura 17-3). Citoplasma Núcleo O ciclo celular eucariótico geralmente é composto por quatro S Fase fases Duplicação cromossômica A maioria das células requer muito mais tempo para crescer e duplicar sua massa de proteínas e organelas do que necessário para duplicar seus cromossomos e se dividir. A fim de reservar, em parte, tempo para crescimento, a maioria dos ciclos celulares possui fases de intervalo a fase entre a fase M e a fase S, e a fase entre a fase S e a mitose. Assim, ciclo celular eucariótico é tradicionalmente dividido em quatro fases sequenciais: S, e M. As fases S e são, em conjunto, chamadas de interfase MITOSE (Figura 17-4 e ver Figura 17-3). Em uma célula humana típica se proliferando em cultu- ra, a interfase pode ocupar 23 horas de um ciclo celular de 24 horas, com 1 hora de fase Fase M M. crescimento celular ocorre ao longo do ciclo celular, exceto durante a mitose. As duas fases de intervalo são mais do que um simples retardo de tempo que garante 0 crescimento celular. Elas também dão tempo para que a célula monitore ambiente in- terno e externo a fim de se assegurar de que as condições são adequadas e os preparativos CITOCINESE estejam completos, antes que a célula se comprometa com as principais transformações Figura 17-2 Os principais eventos do ciclo celular. Os principais eventos cromossômicos do ciclo celular ocor- rem na fase S, quando os cromossomos são duplicados, e na fase M, quando cromossomos duplicados são segregados em um par de núcleos-filhos (na mitose), após que a própria célula se divide em duas (citocinese).CAPÍTULO 17 Ciclo celular 965 Citocinese Mitose Transição metáfase-anáfase Interfase Prófase Prometáfase Metáfase Anáfase Telófase + FASE M INTERFASE Replicação do DNA Figura 17-3 Os eventos da divisão celular eucariótica vistos sob o microscópio. Os processos facilmente visíveis de divisão nuclear (mitose) e divisão celular (citocinese), coletivamente chamados de fase M, normalmen- te ocupam somente uma pequena fração do ciclo celular. A outra parte do ciclo, muito mais longa, é conhecida como interfase, que inclui a fase S e as fases de intervalo (discutido no texto). Os cinco estágios da mitose são apresentados: uma mudança brusca no estado bioquímico da célula ocorre na transição da metáfase à anáfase. A célula pode fazer uma pausa antes desse ponto de transição, mas, uma vez ultrapassado esse ponto, a célula continua até fim da mitose e atravessa a citocinese, chegando à interfase. da fase S e da mitose. Nesse sentido, a fase G₁ é especialmente importante. Sua duração pode variar imensamente, dependendo das condições externas e de sinais extracelulares de outras células. Se as condições extracelulares forem desfavoráveis, por exemplo, as cé- lulas retardam a progressão a G₁ e podem entrar em um estado de repouso especializado conhecido como G₀ (G zero), no qual podem permanecer por dias, semanas ou mesmo anos antes que a proliferação seja retomada. Na verdade, muitas células ficam permanen- temente em G₀ até que elas ou organismo morram. Se as condições extracelulares são favoráveis e os sinais para crescer e se dividir estão presentes, as células no início de G₁ ou G₀ avançam até um ponto de comprometimento próximo ao fim de G₁ conhecido como Início (em leveduras) ou ponto de restrição (em células de mamíferos). Usaremos ter- mo Início tanto para células de leveduras como para células de animais. Uma vez passado esse ponto, as células se comprometem com a replicação do DNA, mesmo que os sinais extracelulares que estimulam o crescimento e a divisão celular sejam removidos. controle do ciclo celular é similar em todos os eucariotos Algumas características do ciclo celular, inclusive o tempo necessário para completar certos eventos, variam muito de um tipo celular para outro, mesmo no próprio organis- mo. Contudo, a organização básica do ciclo celular é essencialmente a mesma em todas as células eucarióticas, e todos os eucariotos parecem usar uma maquinaria e mecanis- FASE M Mitose (divisão Citocinese nuclear) (divisão FASE G₂ M citoplasmática) G2 INTERFASE Figura 17-4 As quatro fases do ciclo celular. Em muitas células, fases de inter- S valo separam os principais eventos da fase S e fase M. G₁ é intervalo entre a fase M FASE FASE S e a fase S, enquanto G₂ é intervalo entre (replicação do DNA) a fase S e a fase M.966 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-5 Células de mamífero se proliferando em cultura. As células nesta micrografia eletrônica de varredura são fibroblastos de rato. As células na parte inferior à esquerda são arredondadas e estão em mitose. (Cortesia de Guenter Albrecht-Buehler.) mos de controle similares para conduzir e regular os eventos do ciclo celular. As proteí- nas do sistema de controle do ciclo celular, por exemplo, apareceram pela primeira vez há mais de 1 bilhão de anos. Notavelmente, elas têm sido tão bem conservadas durante curso da evolução que muitas delas funcionam perfeitamente quando transferidas de uma célula humana para uma célula de levedura. Portanto, podemos estudar o ciclo ce- lular e sua regulação em vários organismos, usando as descobertas obtidas para montar um quadro unificado de como as células eucarióticas se dividem. Muitos organismos-modelo são usados para análise do ciclo celular eucariótico. Brotos das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe de fissão são eucariotos simples nos quais abordagens genéticas e moleculares eficazes podem 10 µm ser usadas para identificar e caracterizar genes e proteínas que controlam características fundamentais da divisão celular. Os embriões iniciais de certos animais, particularmente os da rã Xenopus laevis, são excelentes ferramentas para dissecação bioquímica dos me- canismos do controle do ciclo celular, enquanto a mosca-das-frutas Drosophila melano- gaster é útil para análise genética de mecanismos subjacentes do controle e coordenação da divisão e crescimento celular em organismos multicelulares. As culturas de células humanas fornecem um excelente sistema para a exploração microscópica e molecular de processos complexos pelos quais nossas próprias células se dividem. A progressão do ciclo celular pode ser estudada de várias maneiras Como podemos dizer que estágio uma célula alcançou no ciclo celular? Uma maneira é simplesmente observar as células vivas sob o microscópio. Uma olhada rápida em uma população de células de mamíferos se proliferando em cultura revela que uma fração das células assumiu uma forma arredondada e está em mitose (Figura 17-5). Outras podem ser observadas no processo de citocinese. Similarmente, a observação de brotos de células de levedura no microscópio é muito útil, porque o tamanho dos brotos fornece indicações do estágio do ciclo celular (Figura 17-6). Podemos ter indícios adicionais sobre a posição no ciclo celular ao corar as células com corantes fluorescentes que se ligam ao DNA (re- velando a condensação dos cromossomos na mitose) ou com anticorpos que reconhecem componentes celulares específicos, como os microtúbulos (revelando fuso mitótico). As células em fase S podem ser identificadas no microscópio pelo fornecimento de moléculas visualizáveis que são incorporadas na nova síntese de DNA, como a bromodesoxiuridina (BrdU) artificial, um análogo da timidina; os núcleos celulares que incorporaram BrdU são, então, revelados pela coloração com anticorpos anti-BrdU (Figura 17-7). Normalmente, em uma população de células de mamíferos em cultura que está proliferando de modo rápido, porém de forma assíncrona, cerca de 30 a 40% estarão em fase S em qualquer instante e se tornam marcadas por um breve pulso de BrdU. Confor- me a proporção de células em tal população que está marcada, podemos estimar a dura- ção da fase S como uma fração da duração total do ciclo celular. Similarmente, a partir da proporção de células em mitose (índice mitótico), podemos estimar a duração da fase M. Outra forma de avaliar estágio que uma célula tenha alcançado no ciclo celular é pela medida do seu conteúdo de DNA, que duplica durante a fase S. Essa abordagem é grandemente facilitada pelo uso de corantes fluorescentes de ligação ao DNA e citôme- tro de fluxo, que permite a análise rápida e automática de um grande número de células (Figura 17-8). Podemos usar 0 citômetro de fluxo para determinar a duração das fases S, e + M, medindo conteúdo de DNA em uma população de células sincroniza- das conforme avançam no ciclo celular. Figura 17-6 Morfologia do brotamento das células de levedura. Em uma população normal de células de levedura em proliferação, brotos variam de tamanho de acordo com estágio do ciclo celular. As células sem brotamento estão em A progressão a partir do Início da transição, dispara a formação de um pequeno broto, que cresce em tamanho durante as fases S e M, até quase atingir tamanho da célula-mãe. (Cortesia de Jeff 20 µm Ubersax.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 967 Figura 17-7 Marcação de células na fase S. Micrografia de imunofluorescência de células epiteliais do intes- tino de peixe-zebra marcadas com BrdU. peixe foi exposto à BrdU, após tecido ser fixado e preparado para marcação com anticorpos fluorescentes anti-BrdU (verde). Todas as células estão coradas com um corante fluo- rescente vermelho. (Cortesia de Cécile Crosnier.) Resumo A divisão celular normalmente começa com a duplicação do conteúdo da célula, seguida da distribuição desse conteúdo para duas células-filhas. A duplicação dos cromossomos ocorre durante a fase do ciclo celular, enquanto a maioria dos outros componentes ce- lulares é duplicada de forma contínua ao longo do ciclo. Durante a fase M, os cromosso- mos replicados são segregados em núcleos individuais (mitose), e a célula então se divide em duas (citocinese). A fase e a fase M geralmente são separadas por fases de intervalo chamadas de e quando vários sinais intracelulares e extracelulares regulam a pro- gressão do ciclo celular. organização e controle do ciclo celular têm sido altamente conservados durante a evolução, e estudos em um grande número de sistemas têm levado a uma visão unificada do controle do ciclo celular eucariótico. SISTEMA DE CONTROLE DO CICLO CELULAR Células na fase Por muitos anos os biólogos celulares observaram os eventos de síntese de DNA, da mi- tose e da citocinese, mas não faziam ideia dos mecanismos de controle desses eventos. Não estava nem ao menos claro se havia um sistema de controle separado ou se os pro- cessos de síntese de DNA, mitose e citocinese de algum modo se autocontrolavam. Um avanço importante surgiu no final da década de 1980 com a identificação das principais proteínas do sistema de controle, juntamente com a percepção de que elas são distintas das proteínas que executam os processos de replicação do DNA, de segregação dos cro- mossomos, entre outros. Número de células Células nas Nesta seção, primeiro consideraremos os princípios básicos sobre os quais o sis- fases e M tema de controle do ciclo celular opera. Em seguida, discutiremos os componentes pro- teicos do sistema e como eles trabalham em conjunto para sincronizar e coordenar os Células na fase eventos do ciclo celular. O sistema de controle do ciclo celular desencadeia os principais 0 1 2 eventos do ciclo celular Quantidade relativa de DNA por célula sistema de controle do ciclo celular opera de forma muito semelhante a um cronô- (unidades arbitrárias) metro que aciona os eventos do ciclo celular em uma sequência determinada (Figura Figura 17-8 Análise do conteúdo de DNA 17-9). Em sua forma mais simples como visto no ciclo celular de embriões precoces com um citômetro de fluxo. Este gráfico mostra resultados típicos obtidos para uma de animais, por exemplo sistema de controle é rigidamente programado para for- pulação de células em proliferação, em que necer uma quantidade fixa de tempo para a realização de cada evento do ciclo celular. conteúdo de DNA das células individuais é de- sistema de controle nas divisões desses embriões precoces é independente dos even- terminado em um citômetro de fluxo. (Um ci- tos que ele controla, para que seus mecanismos continuem a operar mesmo que esses tômetro de fluxo, também chamado de separa- eventos falhem. Contudo, na maioria das células, sistema de controle não responde a dor de células ativado por fluorescência [FACS; do inglês, fluorescence-activated cell sorter], informações recebidas dos processos que controla. Se algum mau funcionamento im- também pode ser usado para separar células de pede a conclusão bem-sucedida da síntese de DNA, por exemplo, sinais são enviados ao acordo com sua fluorescência ver Figura 8-2.) sistema de controle para retardar a progressão da fase M. Tais atrasos fornecem tempo As células aqui analisadas foram coradas com para a maquinaria ser reparada e também previnem o desastre que poderia resultar se o um corante que se torna fluorescente quando ciclo seguisse prematuramente ao próximo estágio e cromossomos incompletamente se liga ao DNA, de forma que a quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à replicados segregassem, por exemplo. quantidade de DNA de cada célula. As células sistema de controle do ciclo celular tem como base em uma série conectada de são divididas em três categorias: aquelas que interruptores bioquímicos, cada um dos quais inicia um evento específico do ciclo celular. têm um complemento não replicado de DNA e, Esse sistema de interruptores possui muitas características importantes, as quais aumen- portanto, estão em aquelas que possuem um complemento totalmente replicado de DNA tam tanto a precisão como a confiabilidade da progressão do ciclo celular. Em primeiro (duas vezes conteúdo de DNA de G₁) e estão lugar, os interruptores geralmente são binários (ativo/inativo) e desencadeiam eventos em fase G₂ ou M, e aquelas que possuem uma de maneira completa e irreversível. Seria claramente desastroso, por exemplo, se eventos quantidade intermediária de DNA e estão em como a condensação dos cromossomos ou a desintegração do envelope nuclear fossem fase S. A distribuição das células indica que elas estão em maior número de células em G₁ iniciados apenas parcialmente ou começados e não completados. Em segundo lugar, do que nas fases G₂ +M, mostrando que G₁ é sistema de controle do ciclo celular é notavelmente intenso e confiável, em parte devido maior do que + M nessa população.968 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-9 o controle do ciclo ce- Todos os cromossomos lular. Um sistema de controle do ciclo Todo DNA está replicado? estão ligados ao fuso? celular desencadeia os processos essenciais do ciclo como a replicação do DNA, ambiente é favorável? TRANSIÇÃO METÁFASE ANÁFASE a mitose e a citocinese. sistema de TRANSIÇÃO G2/M controle é representado aqui como um INICIAR ANÁFASE E INÍCIO DA MITOSE braço central controlador que gira PROSSEGUIR PARA CITOCINESE no sentido horário, disparando processos essenciais quando alcança transições M específicas no mostrador exterior (caixas amarelas). A informação sobre a realização CONTROLADOR dos eventos do ciclo celular, assim como sinais oriundos do ambiente, pode levar sistema de controle a interromper o ciclo nessas transições. S ENTRADA NO CICLO CELULAR E PROSSEGUIR PARA FASE S INÍCIO DA TRANSIÇÃO Ambiente favorável? a mecanismos de reserva e outras características que permitem que sistema opere de maneira eficiente sob várias condições, mesmo que alguns componentes falhem. Por fim, sistema de controle é altamente adaptável e pode ser modificado para se adequar a tipos celulares específicos e para responder a sinais intracelulares ou extracelulares específicos. Na maioria das células eucarióticas, sistema de controle do ciclo celular controla a progressão do ciclo celular em três principais pontos de transição reguladora (ver Fi- gura 17-9). primeiro é o Início (ou ponto de restrição) no final de onde a célula se compromete à entrada no ciclo celular e à duplicação dos cromossomos. segundo é a transição de G₂/M, onde o sistema de controle dispara um evento mitótico precoce que leva ao alinhamento de cromossomos no eixo mitótico na metáfase. terceiro é a tran- sição entre metáfase e anáfase, onde o sistema de controle estimula a separação das cromátides-irmãs, levando à conclusão da mitose e da citocinese. Se detecta problemas dentro ou fora da célula, sistema de controle impede a progressão através de cada uma dessas transições. Se sistema de controle identifica problemas na realização da replica- ção de DNA, por exemplo, isso manterá a célula na transição G₂/M até que esses proble- mas sejam resolvidos. Similarmente, se as condições extracelulares não são apropriadas à proliferação celular, sistema de controle bloqueia a progressão ao Início, impedindo dessa forma a divisão celular até que as condições se tornem favoráveis. O sistema de controle do ciclo celular depende de proteínas-cinase dependentes de ciclinas (Cdks) ciclicamente ativadas Os componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular são membros de uma Ciclina família de cinases conhecidas como cinases dependentes de ciclinas (Cdks; do inglês, cyclin-dependent kinases). As atividades dessas cinases aumentam e diminuem à medida que a célula avança no ciclo, levando a mudanças cíclicas na fosforilação de proteínas in- tracelulares que iniciam ou regulam os principais eventos do ciclo celular. Um aumento na atividade de Cdk na transição G₂/M, por exemplo, aumenta a fosforilação de proteí- nas que controlam a condensação de cromossomos, rompimento do envelope nuclear, Cinase dependente da Ciclina (Cdk) agrupamento no eixo e outros eventos que ocorrem nas etapas iniciais da mitose. As mudanças cíclicas na atividade das Cdks são controladas por um complexo ar- Figura 17-10 Dois componentes- -chave do sistema de controle do ciclo ranjo de enzimas e outras proteínas. mais importante desses reguladores das Cdks são celular. Quando uma ciclina forma um proteínas conhecidas como ciclinas. As Cdks, como implica nome, são dependentes complexo com uma Cdk, a proteína-cinase de ciclinas para sua atividade: a menos que estejam fortemente ligadas a uma ciclina, é ativada e desencadeia eventos específi- elas não têm atividade de cinase (Figura 17-10). As ciclinas foram originalmente de- do ciclo celular. Sem a ciclina, a Cdk é inativa. nominadas desse modo porque sofrem um ciclo de síntese e degradação a cada cicloCAPÍTULO 17 Ciclo celular 969 S-ciclina M-ciclina Figura 17-11 Complexos de ciclina-Cdk do sistema de controle do ciclo celu- lar. As concentrações dos três principais tipos de ciclinas oscilam durante o ciclo ce- lular, enquanto as concentrações das Cdks (não mostrado) não mudam e superam as Início G₂/M Metáfase-anáfase quantidades de ciclinas. Na fase tardia, S M G1 níveis crescentes de levam à formação de complexos que pro- movem a progressão através da transição Ciclina APC/C de Início. Os complexos S-Cdk se formam no início da fase S e desencadeiam a repli- cação do DNA, assim como alguns eventos S-Cdk M-Cdk mitóticos iniciais. Os complexos M-Cdk se formam durante mas são mantidos em um estado inativo; eles são ativados celular. Os níveis de proteínas Cdk, ao contrário, são constantes. As modificações cíclicas no fim de e desencadeiam a entrada na nos níveis das proteínas ciclinas resultam no agrupamento e ativação cíclicos dos com- mitose na transição Um complexo proteico separado, APC/C, inicia a transi- plexos ciclina-Cdk nos estágios específicos do ciclo celular. ção metáfase-anáfase, como discutiremos Existem quatro classes de ciclinas, cada uma definida pelo estágio do ciclo celular mais tarde. no qual se ligam às Cdks e em que atuam. Todas as células eucarióticas necessitam de três dessas classes (Figura 17-11): 1. As ativam Cdks no final de G1 e, com isso, ajudam a desencadear a progressão ao Início, resultando no comprometimento à entrada no ciclo celular. Seus níveis diminuem na fase S. 2. As S-ciclinas se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a duplicação dos cromossomos. Os níveis das S-ciclinas permanecem elevados até a mitose, e essas ciclinas também contribuem ao controle de alguns eventos mitó- ticos iniciais. 3. As M-ciclinas ativam Cdks que estimulam a entrada na mitose na transição G₂/M. Os níveis de M-ciclinas diminuem na metade da mitose. Na maioria das células, uma quarta classe de ciclinas, as G₁-ciclinas, ajuda a regular as atividades das as quais controlam, no final de a progressão ao Início. Em células de leveduras, uma única proteína Cdk se liga a todas as classes de cicli- nas e desencadeia diferentes eventos do ciclo celular, mudando de ciclina associada em diferentes estágios do ciclo. Por outro lado, em células de vertebrados, existem quatro Cdks. Duas interagem com ciclinas uma com cilinas e S, e uma com ciclinas S e M. Neste capítulo, referir-nos-emos simplesmente aos diferentes complexos de ciclina- -Cdk como G₁/S-Cdk, S-Cdk e M-Cdk. Na Tabela 17-1 estão listados os nomes das Cdks e ciclinas individuais. Como diferentes complexos de ciclina-Cdk desencadeiam diferentes eventos do ciclo celular? A resposta, ao menos em parte, parece ser que a proteína ciclina não somente ativa sua Cdk parceira, mas também a direciona para proteínas-alvo específi- cas. Como resultado, cada complexo de ciclina-Cdk fosforila um conjunto diferente de proteínas-substrato. mesmo complexo de ciclina-Cdk também pode induzir diferentes TABELA 17-1 As principais ciclinas e Cdks de vertebrados e da levedura de brotamento Vertebrados Levedura de brotamento Complexo de ciclina-Cdk Ciclina Parceiro de Cdk Ciclina Parceiro de Cdk Ciclina D* Cdk4, Cdk6 Cln3 Cdk1** Ciclina E Cdk2 Cln1, 2 Cdk1 S-Cdk Ciclina A Cdk2, Cdk1** Clb5, 6 Cdk1 M-Cdk Ciclina B Cdk1 Clb1,2,3,4 Cdk1 Existem três ciclinas D em mamíferos (ciclinas D1, D2 e D3). nome original da Cdk1 era Cdc2 em vertebrados e na levedura de fissão, e Cdc28 na levedura de brotamento.970 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-12 Base estrutural da ativa- Ciclina Cinase ativadora de Cdk (CAK) ção das Cdks. Estas ilustrações são basea- das em estruturas tridimensionais de Cdk2 Ciclina e ciclina A humanas, como determinadas em cristalografia por difração de raios X. A localização do ATP ligado está indicada. A ATP ATP enzima é mostrada em três estados. (A) No estado inativo, sem ciclina ligada, sítio ativo está bloqueado por uma região da proteína denominada alça-T (vermelho). (B) A ligação da ciclina afasta a alça-T do sítio ativo, resultando na ativação parcial Alça-T da Cdk2. (C) A fosforilação da Cdk2 (pela Cdk Sítio ativo Fosfatase ativadora CAK) em um resíduo de treonina na alça- (A) INATIVA -T ativa ainda mais a enzima ao mudar a (B) PARCIALMENTE ATIVA (C) TOTALMENTE ATIVA forma da alça-T, melhorando a capacidade da enzima de se ligar a seus substratos proteicos. (Animação 17.1) efeitos em diferentes tempos do ciclo, provavelmente porque a acessibilidade de alguns substratos das Cdks muda durante ciclo celular. Certas proteínas que atuam na mitose, por exemplo, podem ser disponibilizadas à fosforilação somente em Estudos estruturais em três dimensões de proteínas Cdk e ciclinas têm revelado que, na ausência de ciclinas, o sítio ativo na proteína Cdk é parcialmente obstruído por uma alça proteica, como uma pedra bloqueia a entrada de uma caverna (Figura 17-12A). A ciclina ligada faz a alça se mover do sítio ativo, resultando em uma ativação parcial da enzima Cdk (Figura 17-12B). A ativação total do complexo de ciclina-Cdk ocorre, então, quando uma outra cinase, a cinase ativadora de Cdk (CAK; do inglês, Cdk-activating kinase), fosforila um aminoácido próximo à entrada do sítio ativo da Cdk. Isso causa uma pequena mudança conformacional que aumenta ainda mais a atividade da Cdk, per- mitindo que a cinase fosforile de maneira eficiente suas proteínas-alvo e, desse modo, induza eventos específicos do ciclo celular (Figura 17-12C). Atividade de Cdk pode ser suprimida pela fosforilação inibitória e por proteínas inibidoras Cdk aumento e a diminuição dos níveis de ciclinas são os determinantes primordiais da atividade das Cdks durante ciclo celular. Contudo, vários mecanismos adicionais aju- dam a controlar a atividade das Cdks em estágios específicos do ciclo. A fosforilação de um par de aminoácidos na cavidade do sítio ativo da cinase inibe a atividade de um complexo de ciclina-Cdk. A fosforilação desses sítios por uma cinase conhecida como Weel inibe a atividade das Cdks, enquanto a desfosforilação desses sítios por uma fosfatase conhecida como Cdc25 aumenta a atividade das Cdks (Figura 17-13). Veremos posteriormente que esse mecanismo regulador é particularmente im- portante no controle da atividade das M-Cdks no início da mitose. A ligação de proteínas inibidoras Cdk (CKIs) inativam complexos ciclina-Cdk. A estrutura tridimensional de um complexo de ciclina-Cdk-CKI revela que a ligação de CKI Ciclina Fosfato inibitório estimula um grande rearranjo na estrutura do sítio ativo da Cdk1, tornando-o inativo Cinase (Figura 17-14). As células usam as CKIs primordialmente para auxiliá-las na regulação Wee1 das atividades de e S-Cdks no início do ciclo celular. Fosfatase Cdc25 Proteólise regulada desencadeia a transição metáfase-anáfase Cdk Fosfatase ativada Enquanto a ativação de complexos específicos ciclina-Cdk controla a progressão através do Início e transições (ver Figura 17-11), a progressão através da transição me- ATIVA INATIVA táfase-anáfase é desencadeada não pela fosforilação proteica, mas pela degradação de Figura 17-13 Regulação da atividade proteínas, levando a estágios finais da divisão celular. de Cdk por fosforilação. complexo de principal regulador da transição entre metáfase e anáfase é complexo pro- ciclina-Cdk ativo é inativado quando a cinase Wee1 fosforila dois sítios próximos acima do motor da anáfase, ou ciclossomo (APC/C), um membro da família enzimática de ubi- sítio ativo. A remoção desses fosfatos pela quitinas-ligase. Como discutido no Capítulo 3, essas enzimas são usadas em numerosos fosfatase Cdc25 ativa complexo de ciclina- processos celulares para estimular a degradação proteolítica de proteínas reguladoras -Cdk. Por questão de simplicidade, somente específicas. Elas poliubiquitinam proteínas-alvo específicas, resultando na sua degrada- um fosfato inibidor é mostrado. A CAK adiciona fosfato ativador, como mostrado ção em proteassomos. Outras ubiquitinas-ligase marcam proteínas para outros propósi- na Figura 17-12. tos que não a degradação (discutido no Capítulo 3).CAPÍTULO 17 Ciclo celular 971 Ciclina Cdk Complexo Complexo ciclina-Cdk p27-ciclina-Cdk ativo p27 inativo Figura 17-14 Inibição de um complexo de ciclina-Cdk por uma CKI. Esta ilustração é baseada em uma es- trutura tridimensional de um complexo ciclina A-Cdk2 humana ligado a CKI determinado por cristalografia de difração de raios X. A proteína p27 se liga a ambas, ciclina e Cdk, no complexo, deformando o sítio ativo de Cdk. Ela também se insere no sítio de ligação a ATP, inibindo ainda mais a atividade da enzima. APC/C catalisa a ubiquitinação e a destruição de dois tipos principais de proteí- nas. A primeira é a securina, que protege as ligações proteicas que mantêm os pares de cromátides-irmãs unidos no início da mitose. A destruição de securinas na metáfase ativa a protease que separa as cromátides-irmãs e desencadeia a anáfase, como descrito mais tarde. As S-ciclinas e as M-ciclinas são os segundos principais alvos do APC/C. A destrui- ção dessas ciclinas inativa a maioria das Cdks da célula (ver Figura 17-11). resultado é que muitas proteínas fosforiladas por Cdks da fase S ao início da mitose são desfosfori- ladas por várias fosfatases na célula em anáfase. Essa desfosforilação de alvos das Cdks é necessária para a conclusão da fase M, incluindo as etapas finais da mitose e citocinese. Seguindo sua ativação na metade da mitose, APC/C permanece ativa em G₁ para fornecer um período estável de Cdk inativa. Quando é ativada em G₁ tardio, APC/C é ina- tivado, permitindo, desse modo, um acúmulo da ciclina no próximo ciclo celular. sistema de controle do ciclo celular também utiliza outra ubiquitina-ligase cha- mada SCF (ver Figura 3-71). Ela tem várias funções na célula, mas seu principal papel no ciclo celular é ubiquitinar certas proteínas CKI em tardio, ajudando, portanto, 0 controle da ativação de S-Cdks e replicação de DNA. SCF é também responsável pela destruição das ciclinas na fase S inicial. Tanto APC/C como a SCF são grandes complexos de multissubunidades que possuem componentes em comum (Figura 3-71), mas que são diferencialmente regula- dos. As modificações na atividade de APC/C durante ciclo celular, inicialmente como resultado das trocas nas suas associações com uma subunidade ativadora tanto Cdc20 na metade da mitose ou a partir do final da mitose através de precoce. Tais su- bunidades ajudam o APC/C a reconhecer suas proteínas-alvo (Figura 17-15A). A ativi- dade de SCF depende das subunidades ligadas ao substrato chamadas proteínas F-box. Contudo, diferentemente da atividade do APC/C, a atividade da SCF é constante durante o ciclo celular. Em vez disso, a ubiquitinação pela SCF é controlada por mudanças no estado de fosforilação de suas proteínas-alvo, uma vez que as subunidades de F-box re- conhecem somente proteínas específicas fosforiladas (Figura 17-15B). controle do ciclo celular também depende de regulação transcricional Nos ciclos celulares simples de embriões precoces de animais a transcrição de genes não ocorre. controle do ciclo celular depende exclusivamente de mecanismos pós- -transcricionais que envolvem a regulação de Cdks e ubiquitinas-ligase e de suas prote- ínas-alvo. Contudo, nos ciclos celulares mais complexos da maioria dos tipos celulares, o controle transcricional proporciona um nível adicional de regulação importante. As mudanças na transcrição dos genes de ciclinas, por exemplo, auxiliam controle dos níveis de ciclinas na maioria das células. Uma variedade de métodos discutidos no Capítulo 8 tem sido usados para anali- sar modificações na expressão de todos os genes do genoma conforme a célula progride através do ciclo celular. Os resultados desses estudos são surpreendentes. Na levedura de brotamento, por exemplo, cerca de 10% dos genes codificam mRNAs cujos níveis osci- lam durante ciclo celular. Alguns desses genes codificam proteínas de função conheci- da no ciclo celular, mas as funções de muitas outras são desconhecidas.972 PARTE IV Organização interna da célula O sistema de controle do ciclo celular funciona como uma rede de interruptores bioquímicos A Tabela 17-2 resume alguns dos principais componentes do sistema de controle do ci- clo celular. Essas proteínas estão funcionalmente ligadas, formando uma intensa rede, que opera de forma essencialmente autônoma e ativa uma série de interruptores bioquí- micos, cada um dos quais desencadeia um evento específico do ciclo celular. Quando as condições para a proliferação celular são adequadas, vários sinais externos e internos estimulam a ativação de G₁-Cdk, que por sua vez estimula a ex- pressão de genes que codificam e S-ciclinas (Figura 17-16). Então, a ativação resultante de G₁/S-Cdk controla a progressão através do Início da transição. Por meio de mecanismos que discutiremos posteriormente, as G₁/S-Cdks desenca- deiam uma onda de atividade das S-Cdks, que inicia a duplicação dos cromossomos na fase S e também contribui para alguns eventos iniciais da mitose. Então, a ativação de M-Cdk dispara a progressão através da transição de G₂/M e eventos da mitose ini- cial, levando ao alinhamento de pares de cromátides-irmãs na placa equatorial do (A) Controle da proteólise por APC/C Subunidade ativada (Cdc20) APC/C inativa Cadeia poliubiquitinada M-ciclina APC/C ativa DEGRADAÇÃO DE M-CICLINA NO PROTEASSOMO Cdk Ubiquitina (?) + E1 E2 Enzimas de ubiquitinação (B) Controle da proteólise por SCF Complexo SCF ativo Cadeia Proteína poliubiquitina F-box P DEGRADAÇÃO Cinase DE CKI NO PROTEASSOMO Proteína inibidora de Cdk Ubiquitina (?) + (CKI) E1 E2 Enzimas de ubiquitinação Figura 17-15 o controle da proteólise pelo APC/C e pela SCF durante o ciclo celular. (A) APC/C é ativado na mitose por associação a Cdc20, que reconhece sequências específicas de aminoácidos na M-ciclina e em outras proteínas-alvo. Com a ajuda de duas proteínas adicionais chamadas E1 e APC/C liga cadeias liubiquitina à proteína-alvo. alvo poliubiquitinado é, então, reconhecido e degradado em um proteassomo. (B) A atividade da ubiquitina-ligase SCF depende de subunidades de ligação ao substrato denominadas proteínas F-box, das quais existem muitos tipos diferentes. A fosforilação de uma proteína-alvo, como a CKI mostrada, permite que alvo seja reconhecido por uma subunidade específica de F-box.CAPÍTULO 17 Ciclo celular 973 TABELA 17-2 Resumo das principais proteínas reguladoras do ciclo celular Nome geral Funções e comentários Cinases e fosfatases que modificam Cdks Cinase ativadora de Cdk (CAK) Fosforila um sítio ativador nas Cdks Cinase Wee1 Fosforila sítios inibidores nas Cdks; primariamente envolvida na supressão da atividade de Cdk1 antes da mitose Fosfatase Cdc25 Remove fosfatos inibidores das Cdks; três membros da família (Cdc25A, C) em mamíferos; primariamente envolvida no controle da ativação de Cdk1 no início da mitose Proteínas inibidoras de Cdk (CKIs) Sic1 (levedura de brotamento) Suprime a atividade de Cdk1 em a fosforilação por Cdk1 no final de G₁ aciona sua destruição p27 (mamíferos) Suprime as atividades de e S-Cdk em auxilia a saída das células do ciclo celular quando se diferenciam terminalmente; a fosforilação por Cdk2 aciona sua ubiquitinação por SCF p21 (mamíferos) Suprime as atividades de e S-Cdk após danos ao DNA p16 (mamíferos) Suprime a atividade de em G₁; frequentemente inativada no câncer Ubiquitinas-ligase e seus ativadores APC/C Catalisa a ubiquitinação de proteínas reguladoras primariamente envolvidas na saída da mitose, inclusive securina, S-ciclinas e M-ciclinas; regulada por associação com subunidades ativadoras Cdc20 ou Cdh1 Cdc20 Subunidade ativadora de APC/C em todas as células; aciona a ativação inicial de APC/C na transição entre metáfase e anáfase; estimulada pela atividade de M-Cdk Cdh1 Subunidade ativadora de APC/C que mantém a atividade de APC/C após a anáfase e ao longo de inibida pela atividade de Cdk SCF Catalisa a ubiquitinação de proteínas reguladoras envolvidas no controle de inclusive algumas CKIs (Sic1 na levedura de brotamento, p27 em mamíferos); a fosforilação da proteína- alvo normalmente é necessária a essa atividade eixo mitótico. Finalmente, APC/C, junto ao ativador Cdc20, dispara a degradação de securinas e ciclinas, desencadeando a separação de cromátides-irmãs e a segregação e finalização da mitose. Quando a mitose está completa, múltiplos mecanismos cola- boram na supressão da atividade das Cdks, resultando em um período estável de Agora estamos prontos para discutir esses estágios do ciclo celular em maiores deta- lhes, começando com a fase S. Ambiente Cromossomo extracelular Dano DNA não Dano não ligado favorável no DNA replicado no DNA ao fuso Figura 17-16 Visão geral do sistema de controle do ciclo celular. 0 componente central do sistema de controle do ciclo celular consiste em uma série de comple- XOS de ciclina-Cdk (amarelo). A atividade G1-Cdk S-Cdk M-Cdk APC/C de cada complexo também é influenciada por vários mecanismos inibidores, que fornecem informações sobre ambiente Síntese de extracelular, danos celulares e eventos in- + Síntese de S-ciclina Rerreplicação do DNA completos do ciclo celular (parte superior). Esses mecanismos inibitórios não estão presentes em todos os tipos celulares; mui- S M tos não estão presentes nos ciclos celulares iniciais do embrião, por exemplo.974 PARTE IV Organização interna da célula Resumo sistema de controle do ciclo celular desencadeia eventos do ciclo celular e assegura que eles sejam apropriados e coordenados. sistema de controle responde a vários sinais intracelu- lares e extracelulares e interrompe ciclo quando a célula falha em completar um processo essencial do ciclo celular ou encontra condições ambientais ou intracelulares desfavoráveis. Os componentes centrais do sistema de controle são proteínas-cinase dependentes de ciclina (Cdks), que dependem de subunidades de ciclina para suas atividades. As os- cilações nas atividades de diferentes complexos de ciclina-Cdk controlam vários eventos do ciclo celular. Dessa maneira, a ativação de complexos de ciclina-Cdk da fase (S-Cdk) inicia a fase S, ao passo que a ativação de complexos de ciclina-Cdk da fase M (M-Cdk) de- sencadeia a mitose. Os mecanismos que controlam as atividades dos complexos de ciclina- -Cdk incluem a fosforilação das subunidades das Cdks, a ligação de proteínas inibidoras de Cdk (CKIs), a proteólise de ciclinas e mudanças na transcrição de genes que codificam reguladores das Cdks. sistema de controle do ciclo celular também depende decisiva- mente de dois complexos enzimáticos adicionais, APC/C e as ubiquitinas-ligase SCF, que catalisam a ubiquitinação e a consequente de proteínas reguladoras específi- cas que controlam eventos críticos do ciclo. FASE S Os cromossomos lineares das células eucarióticas são estruturas imensas e dinâmicas de DNA e proteína, e sua duplicação é um complexo processo que ocupa uma fração impor- tante do ciclo celular. A longa molécula de DNA de cada cromossomo deve não apenas ser precisamente duplicada um feito notável por si só -, mas empacotamento das proteínas que cercam cada região daquele DNA também deve ser reproduzido, assegu- rando que as células-filhas herdem todas as características da estrutura cromossômica. evento central da duplicação do cromossomo replicação do DNA cria dois pro- blemas para a célula. Em primeiro lugar, a replicação deve ocorrer com extrema precisão, a fim de minimizar risco de mutações na próxima geração de células. Em segundo lugar, cada nucleotídeo do genoma deve ser copiado uma vez, e somente uma única vez, a fim de evitar os efeitos danosos da amplificação gênica. No Capítulo 5, discutimos a sofisticada maquinaria proteica que executa a replicação do DNA com incrível velocidade e precisão. Nesta seção, consideraremos os elegantes mecanismos pelos quais sistema de controle do ciclo celular inicia processo de replicação e, ao mesmo tempo, impede que ele ocorra mais de uma vez por ciclo. A S-Cdk inicia a replicação do DNA uma vez por ciclo A replicação do DNA inicia nas origens de replicação, que estão espalhadas por numero- sos locais em cada cromossomo. Durante a fase S, a replicação do DNA é iniciada nessas origens quando a helicase de DNA desenrola a dupla-hélice e as enzimas da replicação de DNA se ligam às duas fitas-molde simples. Isso leva à fase de alongamento da repli- cação, quando a maquinaria de replicação se distancia da origem em duas forquilhas de replicação (discutido no Capítulo 5). A fim de garantir que a duplicação dos cromossomos ocorra somente uma vez por ciclo celular, a fase de iniciação da replicação do DNA é dividida em duas etapas distin- tas, que ocorrem em etapas diferentes do ciclo celular (Figura 17-17). primeiro pas- so ocorre na mitose tardia e inicial, quando um par de helicases de DNA inativas se ligam à origem de replicação, formando um grande complexo, chamado de complexo pré-replicativo ou pré-RC. Essa etapa é ocasionalmente chamada de licenciamento das origens de replicação, pois a iniciação da síntese de DNA ocorre somente em origens que contêm um pré-RC. segundo passo ocorre na fase S, quando helicases de DNA são ativadas, resultando no desenrolamento do DNA e no início da síntese de DNA. Uma vez que a origem de replicação tenha sido iniciada nessa via, as duas helicases se movem para fora da origem na forquilha de replicação, e a origem não pode ser reutilizada até que uma nova pré-RC seja adicionada no final da mitose. resultado é que as origens podem ser ativadas somente uma vez por ciclo celular. A Figura 17-18 ilustra alguns detalhes moleculares responsáveis pelo controle das duas etapas no início da replicação do DNA. Um fator fundamental é um grande com-CAPÍTULO 17 Ciclo celular 975 Complexos pré-replicativos nas origens de replicação Figura 17-17 Controle da duplicação G1 dos cromossomos. As preparações para a replicação de DNA começam na mitose tardia e quando as helicases de DNA se ligam a múltiplas proteínas na origem Ativação de S-Cdk INÍCIO de replicação, formando complexo pré- -replicativo (pré-RC). A ativação de S-Cdk leva à ativação de helicases de DNA, que desenrolam DNA nas origens para ini- ciar a sua replicação. Duas forquilhas de S Forquilha replicação partem e se afastam de cada de replicação origem, até que cromossomo inteiro seja ALONGAMENTO duplicado. Os cromossomos duplicados são, então, segregados na fase M. A ati- vação de S-Cdk na fase S também previne o agrupamento de novos pré-RCs em qualquer origem até seguinte asse- gurando, dessa forma, que cada origem Ativação de M-Cdk SEGREGAÇÃO CROMOSSÔMICA seja ativada apenas uma vez em cada ciclo M celular. Ativação de APC/C FORMAÇÃO DE NOVOS COMPLEXOS PRÉ-REPLICATIVOS G1 Inativação de Cdk NAS ORIGENS plexo multiproteico denominado complexo de reconhecimento da origem (ORC; do inglês, origin recognition complex), que se liga às origens de replicação no decorrer do ciclo celular. Na mitose tardia e em G₁ precoce, as proteínas Cdc6 e Cdtl colaboram com ORC para ligar as helicases inativas ao DNA, perto da origem. grande complexo resul- tante é o pré-RC, estando, então, a origem pronta para a replicação. No início da fase S, S-Cdk desencadeia a ativação da origem pela fosforilação espe- cífica de proteínas iniciadoras, as quais promovem a formação de um grande complexo proteico que ativa a helicase de DNA e recruta a maquinaria para síntese de DNA. Outra proteína-cinase chamada DDK também é ativada na fase S e ajuda a desencadear a ati- vação da origem pela fosforilação específica de subunidades da helicase de DNA. Ao mesmo tempo que S-Cdk inicia a replicação de DNA, muitos mecanismos pre- vinem a ligação de novas pré-RCs. S-Cdk fosforila e dessa forma inibe proteínas ORC e Cdc6. A inativação do APC/C no final de G₁ também ajuda a evitar a formação do pré- -RC. Na mitose tardia e G₁ precoce, APC/C desencadeia a degradação de um inibidor chamado geminina, permitindo, assim, que Cdtl se torne ativa. Quando APC/C é inativada em tardia, ocorre o acúmulo de geminina e a inibição de Cdtl que não está associada ao DNA. Também, a associação de com uma proteína na forquilha de re- plicação ativa, estimula a degradação de Cdtl. Nessas várias vias, a formação de pré-RC é impedida da fase S à mitose, assegurando, dessa forma, que cada origem seja ativada apenas uma vez por ciclo celular. Como, então, sistema de controle do ciclo celular se recompõe, permitindo a replicação no próximo ciclo celular? No final da mitose, a ativa- ção do APC/C leva à inativação das Cdks e à degradação da geminina. ORC e Cdc6 são desfosforiladas e é ativada, permitindo a formação do pré-RC para preparar a célula para a próxima fase S. A duplicação cromossômica requer a duplicação da estrutura da cromatina DNA dos cromossomos é extensivamente empacotado em uma ampla variedade de componentes proteicos, incluindo histonas e várias proteínas reguladoras envolvidas no controle da expressão gênica (discutido no Capítulo 4). Assim, a duplicação de um cromossomo não é simplesmente uma questão de duplicar a sequência de DNA, mas976 PARTE IV Organização interna da célula também requer a duplicação dessas proteínas da cromatina e sua ligação adequada ao DNA. A produção de proteínas da cromatina aumenta durante a fase S, a fim de que se- jam fornecidas as matérias-primas necessárias para empacotar DNA recém-sintetiza- do. Mais do que isso: as S-Cdks estimulam um grande aumento da síntese das quatro subunidades de histonas que formam os octâmeros de histonas no núcleo de cada nu- cleossomo. Essas subunidades são agrupadas em nucleossomos no DNA por fatores de associação de nucleossomos, que normalmente se associam à forquilha de replicação e distribuem nucleossomos para ambas as fitas do DNA à medida que emergem da ma- quinaria de síntese de DNA. empacotamento da cromatina ajuda a controlar a expressão gênica. Em algu- mas partes do cromossomo, a cromatina está altamente condensada e é chamada de heterocromatina, enquanto em outras regiões existem estruturas mais abertas chama- das eucromatina (discutido no Capítulo 4). Essas diferenças na estrutura da cromatina dependem de uma variedade de mecanismos, incluindo modificações de caudas de his- tona e a presença de proteínas não histonas. Visto que essas diferenças são importantes na regulação gênica, é crucial que a estrutura da cromatina, como o DNA dentro dela, seja reproduzida de forma exata durante a fase S. Contudo, ainda não se compreende Cdc6 ORC (Complexo de reconhecimento da origem) DNA Cdt1 Origem + Helicase Mcm Complexo pré-replicativo (pré-RC) Figura 17-18 Controle da iniciação da replicação do DNA. A origem de replicação está ligada à ORC durante Proteínas iniciadoras INATIVAÇÃO DE ORC, Cdc6, Cdt1 ciclo celular. No início da fase Cdc6 se associa à ORC e essas proteínas ligam a S-Cdk helicase de DNA, a qual contém seis subu- nidades fortemente relacionadas, chama- ATIVAÇÃO DA das proteínas Mcm. A helicase também se DDK HELICASE DE DNA associa com uma proteína chamada Cdt1. Usando a energia resultante da hidrólise RECRUTAMENTO DA DNA POLIMERASE de ATP, as proteínas ORC e Cdc6 se ligam S E PROTEÍNAS DA REPLICAÇÃO a duas cópias de helicase de DNA, na sua forma inativa, ao redor do DNA próximo à origem, formando, assim, um complexo pré-replicativo (pré-RC). Durante a fase S, S-Cdk estimula a associação de muitas proteínas iniciadoras em cada helicase de DNA, enquanto outra proteína-cinase, DDK, fosforila subunidades de helicase. Como resultado, as helicases de DNA são ativadas e desenrolam DNA. A DNA polimerase e outras proteínas de repli- CONCLUSÃO DA cação são recrutadas para a origem e a REPLICAÇÃO DO DNA replicação do DNA inicia. A proteína ORC é dissociada pela maquinaria de replicação e, então, religa-se. S-Cdk e outros meca- nismos também inativam componentes de pré-RC, ORC, Cdc6 e Cdt1, prevenin- do, dessa maneira, a formação de novos pré-RC nas origens até final da mitose (ver texto). PCAPÍTULO 17 Ciclo celular 977 Figura 17-19 Coesina. A coesina é um complexo proteico com quatro subuni- Molécula Smc Smc3 Scc3 dades. (A) Duas subunidades, Smc1 e Smc3 são proteínas super-hélice com um domínio ATPase em uma extremidade; (B) duas subunidades adicionais, Scc1 e N Dobradiça Scc3 se conectam à cabeça do domínio da Dobradiça Domínio ATPase, formando uma estrutura em anel ATPase Scc1 que pode circundar as cromátides-irmãs, (B) Smc1 como mostrado em (C). Os domínios de (A) ATPase são necessários para a ligação da 20 nm coesina ao DNA. (C) Cromátides-irmãs bem como a estrutura da cromatina é duplicada. Durante a síntese de DNA, enzimas de modificação de histonas e várias proteínas não histonas provavelmente se ligam às duas novas fitas de DNA à medida que emergem da forquilha de replicação, e acredita-se que tais proteínas reproduzam a estrutura local da cromatina do cromossomo parental (ver Figura 4-45). As coesinas mantêm as cromátides-irmãs unidas No final da fase S, cada cromossomo replicado consiste em um par de cromátides-irmãs idênticas, ligadas uma à outra ao longo de sua extensão. Essa coesão de cromátides-irmãs monta o palco para uma mitose bem-sucedida, pois facilita bastante a ligação das duas cromátides-irmãs a polos opostos do fuso mitótico. Imagine quão difícil seria alcançar essa conexão bipolar se as cromátides-irmãs se separassem independentemente depois da fase S. Além disso, defeitos na coesão de cromátides-irmãs em leveduras mutantes, por exemplo causam inevitavelmente grandes erros na segregação dos cromossomos. A coesão de cromátides-irmãs depende de um grande complexo de proteínas cha- mado coesina, que se liga a diversos locais ao longo do comprimento de cada cromáti- de-irmã assim que DNA é replicado na fase S. Duas das subunidades da coesina são membros de uma grande família de proteínas chamada proteínas SMC (Manutenção Es- trutural de Cromossomos; do inglês, Structural Maintenance of Chromosomes). A coesi- na forma gigantescas estruturas similares a anéis, e tem-se proposto que elas circundam as duas cromátides-irmãs (Figura 17-19). A coesão de cromátides-irmãs também resulta, ao menos em parte, do encadea- mento de DNA, o entrelaçamento de moléculas de DNA irmãs que ocorre quando duas forquilhas de replicação se encontram durante a síntese de DNA. A enzima topoisome- rase II gradativamente desembaraça as moléculas-irmãs de DNA concatenadas entre a fase S e o início da mitose, cortando uma molécula de DNA, passando a outra através da quebra, e então resselando o DNA cortado (ver Figura 5-22). Uma vez removido encadeamento, a coesão de cromátides-irmãs depende primariamente dos complexos de coesina. A súbita e sincronizada perda da coesão das irmãs na transição metáfase- -anáfase, portanto, depende inicialmente da disrupção desses complexos, como descre- veremos mais tarde. Resumo A duplicação dos cromossomos na fase envolve a replicação exata de toda a molécula de DNA em cada cromossomo, assim como a duplicação das proteínas da cromatina que se associam ao DNA e controlam vários aspectos da função dos cromossomos. A dupli- cação dos cromossomos é desencadeada pela ativação da S-Cdk, que ativa as proteínas que desenrolam DNA e iniciam sua replicação em origens de replicação. Uma vez ati- vada uma origem de replicação, a S-Cdk também inibe proteínas necessárias para que a origem inicie novamente a replicação do DNA. Assim, cada origem de replicação é ativada uma vez e somente uma vez em cada fase S, não podendo ser reutilizada até próximo ciclo celular.978 PARTE IV Organização interna da célula MITOSE Seguindo a conclusão da fase S e a transição através de a célula sofre uma grande perturbação da fase M. início da mitose, durante a qual as cromátides-irmãs são se- paradas e distribuídas (segregadas) para par de núcleos-filhos idênticos, cada um com sua própria cópia do genoma. A mitose é tradicionalmente dividida em cinco etapas prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase inicialmente definidas com base no comportamento do cromossomo como visto em microscópio. Uma vez concluída a mi- tose, segundo principal evento da fase M citocinese divide a célula em duas meta- des, cada uma com um núcleo idêntico. Painel 17-1 resume os principais eventos da fase M (Animações 17.2, 17.3, 17.4 e 17.5). De um ponto de vista de regulação, a mitose pode ser dividida em duas partes principais, cada uma influenciada por componentes distintos do sistema de controle do ciclo celular. Primeiro, um aumento abrupto na atividade de M-Cdk na transição G₂/M desencadeia eventos no início da mitose (prófase, prometáfase e metáfase). Durante esse período, a M-Cdk e várias outras cinases mitóticas fosforilam uma série de proteí- nas, levando à formação do fuso mitótico e à ligação deste aos pares de cromátides-ir- mãs. A segunda parte principal da mitose começa na transição entre metáfase e anáfase, quando o APC/C provoca a degradação da securina, liberando uma protease que cliva a coesina e, com isso, inicia a separação das cromátides-irmãs. APC/C também promove a degradação de ciclinas, levando à inativação das Cdks e à desfosforilação de alvos das Cdks, o que é necessário a todos os eventos do final da fase M, inclusive a conclusão da anáfase, a dissociação do fuso mitótico e a divisão da célula por citocinese. Nesta seção, descreveremos os principais eventos mecânicos da mitose e como a M-Cdk e o APC/C os orquestram. A M-Cdk promove início da mitose Uma das características mais notáveis do controle do ciclo celular é que uma única pro- teína-cinase, a M-Cdk, ocasiona todos os diversos e complexos rearranjos celulares que ocorrem nos estágios iniciais da mitose. A M-Cdk deve, no mínimo, induzir a formação do fuso mitótico e assegurar que cada cromátide-irmã de um par esteja ligada ao polo oposto do fuso. Ela também desencadeia a condensação dos cromossomos a reorgani- zação em grande escala das cromátides-irmãs entrelaçadas em estruturas compactas, si- milares a um bastão. Em células animais, a M-Cdk também promove a desintegração do envelope nuclear e rearranjos do citoesqueleto de actina e do aparelho de Golgi. Acre- dita-se que cada um desses processos seja iniciado quando a M-Cdk fosforila proteínas específicas envolvidas no processo, embora a maioria dessas proteínas ainda não tenha sido identificada. A M-Cdk não atua sozinha na fosforilação de proteínas-chave envolvidas no início da mitose. Duas famílias adicionais de cinases, as cinases similares a Polo e as cinases Aurora, também dão importantes contribuições ao controle dos eventos mitóticos ini- ciais. A cinase Plk similar a Polo, por exemplo, é necessária à formação normal de um fuso mitótico bipolar, em parte porque fosforila proteínas envolvidas na separação dos polos do fuso no início da mitose. A cinase Aurora A também ajuda a controlar proteínas que promovem a formação e a estabilidade do fuso, ao passo que a Aurora controla a ligação das cromátides-irmãs ao fuso, como discutiremos a seguir. A desfosforilação ativa a M-Cdk no início da mitose A ativação da M-Cdk começa com o acúmulo de M-ciclina (ciclina em células de ver- tebrados; ver Tabela 17-1). Em ciclos celulares embrionários, a síntese de M-ciclina é constante ao longo do ciclo celular, e o acúmulo de M-ciclina resulta da alta estabilidade da proteína na interfase. Contudo, na maioria dos tipos celulares, a síntese de M-ciclina aumenta durante e M, devido principalmente ao aumento da transcrição do gene M- -ciclina. aumento da proteína M-ciclina leva a um correspondente acúmulo da M-Cdk (o complexo de Cdk1 e M-ciclina) à medida que a célula se aproxima da mitose. Embo- ra nesses complexos a Cdk seja fosforilada em um sítio ativador pela cinase ativadoraCAPÍTULO 17 Ciclo celular 979 Fosfatase Figura 17-20 A ativação da M-Cdk. A inativada Cdk1 se associa à M-ciclina conforme Cdc25 os níveis de M-ciclina gradativamente se elevam. complexo de M-Cdk resultante Fosfatase RETROA- inibitória é fosforilado em um sítio ativador pela LIMEN- Cinase ativadora TAÇÃO cinase ativadora de Cdk (CAK) e em um de Cdk POSITIVA par de sítios inibidores pela cinase Wee1 P complexo M-Cdk inativo resultante é, CAK Cdc25 então, ativado ao fim de pela fosfatase P Cdc25. A Cdc25 é ainda mais estimulada P pela M-Cdk ativa, resultando em retroali- Fosfatase mentação positiva. A retroalimentação é Wee1 ativadora aumentada pela capacidade da M-Cdk de Cdk1 M-Cdk Cinase inibidora M-Cdk M-Cdk ativada inibir Wee1. inativada de Cdk inativada RETROALIMENTAÇÃO POSITIVA de Cdk (CAK), como anteriormente discutido, a cinase Weel a mantém em um estado inativo, por meio de fosforilação inibidora em dois sítios adjacentes (ver Figura 17-13). Assim, no momento em que a célula chega o fim de ela contém um estoque abun- dante de M-Cdk, que está preparada e pronta para agir, mas está inibida por fosfatos que bloqueiam sítio ativo da cinase. que então desencadeia a ativação do estoque de M-Cdk? evento crucial é a ativação da proteína-fosfatase Cdc25, que remove os fosfatos inibidores que restrin- gem a M-Cdk (Figura 17-20). Ao mesmo tempo, a atividade inibidora da cinase Weel é suprimida, assegurando ainda mais que a atividade da M-Cdk aumente. Os mecanis- mos que desencadeiam a atividade da Cdc25 no início da mitose não são bem enten- didos. Uma possibilidade é que as S-Cdks que estão ativas em e no início da prófase estimulem a Cdc25. Curiosamente, a Cdc25 também pode ser ativada, ao menos em parte, pelo seu alvo, a M-Cdk. A M-Cdk também pode inibir a cinase inibidora Weel. A capacidade da M-Cdk de ativar seu próprio ativador (Cdc25) e inibir seu próprio inibidor (Weel) suge- re que a ativação da M-Cdk na mitose envolve ciclos de retroalimentação positiva (ver Figura 17-20). De acordo com esse modelo, a ativação parcial da Cdc25 (talvez pela S- -Cdk) leva à ativação parcial de uma subpopulação de complexos de M-Cdk, que, então, fosforilam mais moléculas de Cdc25 e Weel. Isso leva a uma maior ativação da M-Cdk, e assim por diante. Tal mecanismo rapidamente promoveria a ativação de todos os com- plexos de M-Cdk na célula. Como anteriormente mencionado, interruptores molecula- res semelhantes operam em vários pontos do ciclo celular, a fim de promover a transição abrupta e completa de um estado do ciclo celular ao próximo. A condensina ajuda a configurar os cromossomos duplicados para a separação Ao fim da fase S, as moléculas de DNA extremamente longas das cromátides-irmãs es- tão emaranhadas em uma massa de DNA parcialmente concatenado e proteínas. Nesse estado, qualquer tentativa de separar bruscamente as irmãs levaria, indubitavelmen- te, a quebras nos cromossomos. Para evitar esse desastre, a célula dedica uma grande quantidade de energia no início da mitose a fim de gradativamente reorganizar as cro- mátides-irmãs em estruturas relativamente curtas e distintas, que podem ser separadas mais facilmente na anáfase. Essas mudanças cromossômicas envolvem dois processos: a condensação dos cromossomos, na qual as cromátides são dramaticamente compac- tadas; e a resolução das cromátides-irmãs, por meio da qual as duas irmãs são separa- 1 µm das em unidades distintas (Figura 17-21). A resolução é resultado da separação das Figura 17-21 o cromossomo mitótico. cromátides-irmãs, acompanhado pela remoção parcial de moléculas de coesina ao lon- Micrografia eletrônica de varredura de um go dos braços cromossômicos. Como resultado, quando a célula atinge a metáfase, as cromossomo mitótico humano, consistin- cromátides-irmãs aparecem no microscópio como estruturas compactas, semelhantes a do em duas cromátides-irmãs unidas ao um bastão e que estão fortemente unidas em suas regiões centroméricas e apenas frou- longo de sua extensão. As regiões com- primidas são os centrômeros. (Cortesia de xamente ao longo dos braços. Terry D. Allen.)1 PRÓFASE Centrossomo Na prófase, os cromossomos replicados, cada um deles Envelope composto por duas Formação nuclear cromátides-irmãs do fuso intacto mitótico condensadas. Fora do núcleo, a formação do fuso mitótico entre dois centrossomos que se replicaram e se separam. Para simplificar, apenas três cromossomos são mostrados. Em células diploides, haveria Cinetocoro duas cópias de cada cromossomo presente. Na Cromossomos replicados condensados, compostos por micrografia de fluorescência, duas cromátides-irmãs mantidas unidas ao longo do os cromossomos são corados seu comprimento com laranja e microtúbulos com verde. 2 PROMETÁFASE A prometáfase inicia de forma abrupta com a Centrossomo Fragmentos do no polo envelope nuclear fragmentação do envelope do fuso nuclear. Os cromossomos podem, então, ligarem-se aos microtúbulos do fuso via seus cinetocoros e entrar em movimento ativo. Microtúbulo Cromossomo em movimento ativo do cinetocoro 3 METÁFASE Cromossomo no polo do fuso Na metáfase, os cromossomos são alinhados na placa equatorial do fuso, entre os polos do fuso. Os microtúbulos do cinetocoro ligam-se às cromátides-irmãs em polos opostos ao fuso. Microtúbulo do cinetocoro981 4 ANÁFASE Cromossomos-filhos Na anáfase, as cromátides-irmãs separam-se de forma sincronizada para formar dois cromossomos-filhos, e cada um é puxado lentamente em direção ao polo do fuso. Os microtúbulos do cinetocoro ficam menores e os polos do fuso também se afastam; ambos os processos contribuem para a Encurtamento segregação cromossômica. dos microtúbulos Polo do fuso do cinetocoro se movendo para fora 5 TELÓFASE Durante a telófase, os dois conjuntos de Conjunto de no polo do fuso cromossomos-filhos chegam aos polos do fuso e Anel contrátil descondensam. Um novo começando a se contrair envelope nuclear se forma ao redor de cada conjunto, completando a formação de dois núcleos e marcando o fim da mitose. A divisão do citoplasma começa com a contração do anel contrátil. Microtúbulos Centrossomo interpolares Formação do envelope nuclear ao redor de cromossomos individuais 6 CITOCINESE Durante a citocinese, o Envelope nuclear completo citoplasma é dividido em ao redor de cromossomos dois por um anel contrátil descondensados de actina e filamentos de miosina, que comprime a célula em duas partes para criar duas células-filhas, cada uma com um núcleo. Anel contrátil criando um sulco Reformação da matriz de de clivagem interfase de microtúbulos nucleados por centrossomo (Micrografias cortesia de Julie Canman e Ted Salmon.)982 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-22 Condensina. (A) A condensina é um complexo Domínio ATPase proteico de cinco subunidades que se assemelha à coesina (ver Smc2 Figura 17-19). Os domínios da cabeça de ATPase de suas duas CAP-G subunidades principais, Smc2 e Smc4, são unidos por três subuni- dades adicionais. (B) Não está claro como a condensina catalisa a CAP-H restruturação e compactação do DNA do cromossomo, mas ela deria formar uma estrutura em anel que circunda as alças de DNA de cada cromátide-irmã. Dobradiça CAP-D2 Smc4 (A) A condensação e a resolução das cromátides-irmãs dependem, ao menos em parte, de um complexo proteico de cinco subunidades chamado de condensina. A estrutura da condensina é relacionada àquela do complexo de coesina que mantém as cromátides-ir- mãs unidas (ver Figura 17-19). Ela contém duas subunidades de SMC, semelhantes às da coesina, mais três subunidades de não SMC (Figura 17-22). A condensina pode formar uma estrutura similar a um anel que, de alguma forma, usa a energia fornecida pela hi- drólise de ATP para promover a compactação e a resolução das cromátides-irmãs. A con- densina é capaz de modificar enrolamento de moléculas de DNA em um tubo de ensaio, e acredita-se que essa atividade de enrolamento seja importante à condensação dos cro- mossomos durante a mitose. Curiosamente, a fosforilação de subunidades da condensina pela M-Cdk estimula essa atividade de enrolamento, propiciando um mecanismo pelo qual a M-Cdk pode promover a reestruturação dos cromossomos no início da mitose. O fuso mitótico é uma máquina com base em microtúbulos Em todos os eucariotos, o evento central da mitose a segregação dos cromossomos depende de uma máquina complexa e bela denominada fuso mitótico (ver Painel 17-1). fuso é um arranjo bipolar de microtúbulos, que separa as cromátides-irmãs na anáfa- se, segregando, com isso, os dois conjuntos de cromossomos a extremidades opostas da célula, onde eles são empacotados em dois núcleos-filhos (Animação 17.6). A M-Cdk promove a formação do fuso no início da mitose, em paralelo à reestruturação dos cro- mossomos recém-descrita. Antes de considerarmos como o fuso é formado e como seus microtúbulos se ligam às cromátides-irmãs, revisaremos brevemente as características básicas da estrutura do fuso. (B) núcleo do fuso mitótico é um arranjo bipolar de microtúbulos, no qual as extre- midades menos (-) estão orientadas aos dois polos do fuso, e as extremidades mais (+) se irradiam para fora dos polos (Figura 17-23). As extremidades mais (+) de alguns mi- crotúbulos chamados microtúbulos interpolares sobrepõem-se com as extremidades mais (+) de microtúbulos de outro polo, resultando em uma rede antiparalela na região média do fuso. As extremidades mais (+) de outros microtúbulos os microtúbulos do cinetocoro são ligadas aos pares de cromátides-irmãs em grandes estruturas proteicas chamadas de cinetocoros, que estão localizados no centrômero de cada cromátide-irmã. Por fim, muitos fusos também contêm microtúbulos astrais que se irradiam a partir dos polos e contatam 0 córtex da célula, ajudando no posicionamento do fuso na célula. Na maioria das células somáticas animais, cada polo do fuso é orientado em uma organela proteica denominada centrossomo (ver Figuras 16-47 e 16-48). Cada centros- somo consiste em uma matriz de material amorfo (chamada de matriz pericentriolar) que cerca um par de centríolos (Figura 17-24). A matriz pericentriolar nucleia um ar- ranjo radial de microtúbulos, com suas extremidades mais (+) de crescimento rápido projetando-se para fora e suas extremidades menos (-) associadas ao centrossomo. A matriz contém uma série de proteínas, incluindo proteínas motoras dependentes de mi- crotúbulos, proteínas com estrutura em super-hélice que ligam os motores ao centros- somo, proteínas estruturais e componentes do sistema de controle do ciclo celular. Mais importante, ela contém complexos em anel de y-tubulina, os quais são os componentes principais responsáveis pela nucleação dos microtúbulos (ver Figura 16-46). Algumas células especialmente as células de plantas superiores e os ovócitos de muitos vertebrados não possuem centrossomos, e proteínas motoras dependentes de microtúbulos e outras proteínas associadas às extremidades menos (-) dos microtúbu- los organizam e orientam os polos do fuso.CAPÍTULO 17 Ciclo celular 983 Polo do fuso Cromossomo Cinetocoro Proteína Figura 17-23 o fuso na metáfase mitó- replicado motora tica em célula animal. As extremidades Centrossomo (cromátides-irmãs) mais (+) dos microtúbulos se projetam do polo do fuso, enquanto as extremidades + + menos (-) estão ancoradas aos polos do fuso, as quais, neste exemplo, estão orga- nizadas por centrossomos. Os microtúbu- los do cinetocoro conectam os polos do + fuso aos cinetocoros das cromátides-irmãs, + enquanto os microtúbulos interpolares dos dois polos se interdigitam na placa + equatorial do fuso. Os microtúbulos astrais irradiam-se dos polos para citoplasma. + + Microtúbulos astrais Microtúbulos do cinetocoro Microtúbulos interpolares As proteínas motoras dependentes de microtúbulos controlam a formação e a função do fuso A função do fuso mitótico depende de um grande número de proteínas motoras depen- dentes de microtúbulos. Como discutido no Capítulo 16, essas proteínas pertencem a duas famílias as proteínas relacionadas à cinesina, que normalmente se movem em di- reção à extremidade mais (+) dos microtúbulos, e as dineínas, que se movem em direção à extremidade menos (-). No fuso mitótico, essas proteínas motoras geralmente operam nas extremidades dos microtúbulos ou perto delas. Quatro principais tipos de proteínas motoras cinesina-5, cinesina-1,4, cinesina-4/10 e dineína são particularmente impor- tantes para a formação e função do fuso (Figura 17-25). As proteínas cinesina-5 contêm dois domínios motores que interagem com as ex- tremidades mais (+) de microtúbulos antiparalelos na zona média do fuso. Como os dois domínios motores se movem em direção às extremidades mais (+) dos microtúbulos, eles fazem os dois microtúbulos antiparalelos, ao passarem um sobre o outro, deslizarem em direção aos fusos mitóticos, forçando afastamento dos polos. As proteínas cinesina-14, ao contrário, são motores orientados para extremidades menos (-) com um único domí- nio motor e outros domínios que podem interagir com um microtúbulo adjacente. Elas podem formar ligações cruzadas com microtúbulos interpolares antiparalelos na zona média do fuso e tendem a tracionar os polos conjuntamente. As proteínas cinesina-4 e cinesina-10, também chamadas de cromocinesinas, são motores orientados para a extre- midade mais (+) que se associam aos braços cromossômicos e afastam o cromossomo (A) (B) Microtúbulo Matriz pericentriolar Par de centríolos 1 µm Figura 17-24 centrossomo. (A) Micrografia eletrônica de uma célula cultivada de mamífero na fase S, mostrando um centrossomo duplicado. Cada centros- somo contém um par de centríolos; embora os centríolos tenham se duplicado, eles permanecem juntos em um único complexo, como mostrado na ilustração da micrografia em (B). Um centríolo de cada par de centríolos foi cortado em corte transversal, enquanto outro foi cortado em corte longitudinal, indicando que dois membros de cada par estão alinhados em ângulos retos um ao outro. As duas metades do centrossomo replicado, cada uma composta por um par de centríolos cercado por matriz pericentriolar, irão se dividir e migrar em separado a fim de iniciar a formação dos dois polos do fuso mitótico quando a célula entra na fase M. de M. McGill, D.P. Highfield, T.M. Monahan, e B.R. Brinkley, J. Ultrastruct. Res. 57:43-53, 1976. Com permissão de Academic Press.)984 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-25 Principais proteínas motoras do fuso. Quatro classes princi- Cinesina-14 pais de proteínas motoras dependentes Microtúbulo do fuso Cinesina-5 de microtúbulos (retângulos amarelos) + contribuem para a formação e para fun- Dineína Dineína cionamento do fuso (ver texto). As setas coloridas indicam a direção do movimento + da proteína motora ao longo de um micro- Centrossomo túbulo azul na direção da extremidade + menos (-) e vermelho na direção da extre- Membrana Cromátides-irmãs midade mais (+). plasmática Cinesina-4,10 ligado do polo (ou polo do cromossomo). Finalmente, dineínas são motores orientados para extremidades menos (-) que, junto com proteínas associadas, organizam microtú- bulos em vários locais na célula. Elas ligam as extremidades mais (+) de microtúbulos astrais a componentes do citoesqueleto de actina no córtex celular, por exemplo; mo- vendo-se em direção à extremidade menos (-) dos microtúbulos, os motores de dineína puxam fuso mitótico em direção ao córtex celular e se afastam um do outro. Múltiplos mecanismos colaboram para a formação do fuso mitótico bipolar fuso mitótico deve possuir dois polos a fim de segregar os dois conjuntos de cromá- tides-irmãs a polos opostos da célula em anáfase. Em muitas células animais, vários mecanismos asseguram a bipolaridade do fuso. Um deles depende de centrossomos. Uma célula animal típica entra em mitose com um par de centrossomos, cada um dos quais nucleia um arranjo radial de microtúbulos. Os dois centrossomos sustentam polos de fusos pré-formados que facilitam grandemente a formação do fuso bipolar. outro mecanismo depende da habilidade de cromossomos mitóticos em nuclear e estabilizar microtúbulos e na habilidade de proteínas motoras de organizar microtúbulos em uma rede bipolar. Esses mecanismos de "auto-organização" podem produzir um fuso bipolar mesmo em células sem centrossomos. Agora descreveremos as etapas de formação do fuso, começando com a formação dependente de centrossomos no início da mitose. Consideramos, então, os mecanismos de auto-organização que não requerem centrossomos e que são particularmente impor- tantes após a fragmentação do envelope nuclear. A duplicação do centrossomo ocorre no início do ciclo celular A maioria das células animais contém um único centrossomo que nucleia a maioria dos microtúbulos citoplasmáticos da célula. centrossomo se duplica quando a cé- lula entra no ciclo celular, de forma que no momento em que a célula atinge a mitose existem dois centrossomos. A duplicação dos centrossomos começa aproximadamente ao mesmo tempo em que a célula entra em fase S. (um complexo de ciclina E e Cdk2 em células animais; ver Tabela 17-1) que desencadeia início do ciclo celu- lar, também inicia a duplicação dos centrossomos. Os dois centríolos do centrosso- mo se separam, e cada um nucleia a formação de um único centríolo novo, resultando em dois pares de centríolos dentro de uma matriz pericentriolar expandida (Figura 17-26). Esse par de centrossomos permanece unido em um lado do núcleo até a célula entrar em mitose. Existem paralelos interessantes entre a duplicação do centrossomo e a duplicação dos cromossomos. Ambas usam um mecanismo semiconservativo de duplicação, no qual as duas metades se separam e servem de molde à construção de uma nova metade. Os centrossomos, como os cromossomos, devem se replicar uma e somente uma vez por ciclo celular, a fim de garantir que a célula entre em mitose com somente duas cópias: um número incorreto de centrossomos poderia levar a defeitos na formação do fuso e, como consequência, a erros na segregação dos cromossomos.CAPÍTULO 17 Ciclo celular 985 Figura 17-26 Replicação de centríolos. centrossomo consiste em um par de centríolos e matriz pericentriolar associa- da (verde). Em um certo ponto em os dois centríolos do par se separam em alguns micrômetros. Durante a fase S, um centríolo-filho começa a crescer próximo à base de cada centríolo parental e em ângulo reto a ele. alongamento do centríolo-filho normalmente é completado em Os dois pares de centríolos per- manecem juntos em um único complexo centrossômico até início da fase M, quando complexo se divide em dois, e G1 S G2 M dois centrossomos-filhos começam a se separar. Agora, cada centrossomo nucleia sua própria matriz radial de microtúbulos (chamada de áster), principalmente a par- Os mecanismos que limitam a duplicação do centrossomo a uma vez por ciclo tir do centríolo parental. celular são incertos. Em muitos tipos celulares, a inibição experimental da síntese de DNA bloqueia a duplicação do centrossomo, estabelecendo um mecanismo pelo qual o número de centrossomos é mantido sob controle. Contudo, outros tipos celulares, in- cluindo aqueles de embriões jovens de moscas, ouriços-do-mar e rãs, não contêm tal mecanismo, e a duplicação do centrossomo continua se a duplicação dos cromossomos for bloqueada. Não se sabe como tais células limitam a duplicação do centrossomo a uma vez por ciclo celular. A M-Cdk inicia a formação do fuso na prófase A formação do fuso começa no início da mitose, quando os dois centrossomos se sepa- ram ao longo do envelope nuclear, puxados por proteínas motoras dineínas que ligam microtúbulos astrais ao córtex celular (ver Figura 17-25). As extremidades mais (+) dos microtúbulos entre os centrossomos interdigitam para formar microtúbulos interpola- res, e proteínas motoras cinesina-5 associam-se a esses microtúbulos separando-os (ver Figura 17-25). Também no início da mitose, o número de complexos de y-tubulina em anel em cada centrossomo aumenta enormemente, ampliando assim a habilidade dos centrossomos em nuclear novos microtúbulos, um processo denominado maturação do centrossomo. equilíbrio de forças opostas geradas por diferentes tipos de proteínas motoras determina o comprimento final do fuso. Os motores de dineína e cinesina-5 geralmente promovem a separação dos centrossomos e aumentam o comprimento do fuso. As pro- teínas cinesina-14 fazem o oposto: elas tendem a puxar os polos para um mesmo ponto (ver Figura 17-25). Não está claro como a célula regula o equilíbrio de forças opostas para gerar o comprimento apropriado do fuso. A M-Cdk e outras cinases mitóticas são necessárias à separação e maturação dos centrossomos. A M-Cdk e a Aurora-A fosforilam motores de cinesina-5 e nos estimulam a conduzir a separação dos centrossomos. A Aurora-A e a Plk também fosforilam compo- nentes do centrossomo, promovendo, com isso, sua maturação. A conclusão da formação do fuso em células animais requer a fragmentação do envelope nuclear Os centrossomos e os microtúbulos das células animais estão localizados no citoplas- ma, separados dos cromossomos pela dupla barreira de membrana do envelope nuclear (discutido no Capítulo 12). Claramente, a ligação das cromátides-irmãs ao fuso requer a remoção dessa barreira. Além disso, muitas proteínas motoras e reguladores de micro- túbulos que promovem a formação do fuso são associadas com cromossomos dentro do núcleo, e elas requerem a fragmentação do envelope nuclear para desempenharem suas funções. A fragmentação do envelope nuclear é um processo complexo e de múltiplas eta- pas, que aparentemente inicia quando M-Cdk fosforila várias subunidades dos comple- XOS de poros nucleares no envelope nuclear. A fosforilação inicia a dissociação dos com-986 PARTE IV Organização interna da célula plexos de poros nucleares e sua dissociação do envelope. A M-Cdk também fosforila os componentes da lâmina nuclear, revestimento estrutural sob envelope. A fosforilação desses componentes da lâmina e de várias proteínas internas do envelope nuclear leva à da lâmina nuclear e à fragmentação das membranas do envelope em pequenas vesículas. A instabilidade dos microtúbulos aumenta muito na mitose A maioria das células animais em interfase contém um arranjo citoplasmático de micro- túbulos que se irradia a partir de um único centrossomo. Como discutido no Capítulo 16, os microtúbulos desse arranjo interfásico estão em um estado de instabilidade dinâmica, em que os microtúbulos individuais estão se polimerizando ou dissociando e estocasti- camente alternam entre os dois estados. A alternância entre polimerização e dissociação é chamada de catástrofe, e a alternância entre dissociação e polimerização é denomina- da salvamento. Os microtúbulos novos estão sendo continuamente polimerizados para compensar a perda daqueles que desaparecem completamente por despolimerização. A entrada na mitose sinaliza uma mudança brusca nos microtúbulos da célula. A matriz de interfase, onde alguns longos microtúbulos irradiam a partir do centrossomo único, é convertida a um maior número de microtúbulos mais curtos e mais dinâmicos que emanam a partir de ambos os centrossomos. Durante a prófase, e particularmente na prometáfase e na anáfase (ver Painel 17-1), a meia-vida dos microtúbulos diminui dramaticamente. Esse aumento na instabilidade dos microtúbulos, acoplado com o au- mento da capacidade dos centrossomos de nuclear microtúbulos, como anteriormente mencionado, resulta em arranjos notavelmente densos e dinâmicos de microtúbulos do fuso que são ideais para a ligação de cromátides-irmãs. Os microtúbulos dinâmicos são controlados na célula por uma variedade de pro- teínas reguladoras, incluindo proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) que promo- vem a estabilidade, e fatores catástrofe que desestabilizam as extremidades mais (+) dos microtúbulos. As modificações nas atividades dessas proteínas reguladoras são respon- sáveis pelas modificações na dinâmica dos microtúbulos que ocorrem durante a mitose. Muitas dessas modificações são resultado da fosforilação de proteínas específicas por M-Cdk e outras proteínas cinases mitóticas. Os cromossomos mitóticos promovem a formação do fuso bipolar Os cromossomos não são simples passageiros passivos no processo de formação do fuso. Ao criarem um ambiente local que favorece tanto a nucleação dos microtúbulos como a estabilização dos microtúbulos, eles desempenham um papel ativo na formação do fuso. A influência dos cromossomos pode ser demonstrada pelo uso de uma fina agulha de vi- dro que os reposiciona após fuso ter se formado. Para algumas células em metáfase, se um único cromossomo é arrastado para fora do alinhamento, uma massa de novos mi- crotúbulos do fuso rapidamente aparece ao redor do cromossomo recém-posicionado, ao passo que os microtúbulos do fuso na posição anterior do cromossomo se despolime- rizam. Essa propriedade dos cromossomos parece depender, ao menos em parte, de um fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF; do inglês, guanine-nucleotide exchange factor) que está ligado à cromatina; GEF estimula uma pequena GTPase no citosol cha- mada de Ran a ligar GTP em lugar de GDP. A Ran-GTP ativada, que também está envolvi- da em transporte nuclear (discutido no Capítulo 12), libera proteínas estabilizadoras de microtúbulos de complexos proteicos no citosol, estimulando, assim, tanto a nucleação como a estabilização local de microtúbulos em torno dos cromossomos (Figura 17-27). A estabilização do microtúbulo local também é promovida pela Aurora- -B, a qual se associa aos cromossomos mitóticos. Figura 17-27 Ativação de GTPase Ran ao redor de cromossomos mitóticos. A proteína Ran, como outros membros da pequena família GTPase (discutido no Capítulo 15), pode existir em duas conformações depen- dendo se está ligada a GDP (estado inativo) ou GTP (estado ativo). A localização de Ran ativa na mitose foi de- terminada usando uma proteína que emite fluorescência em um comprimento de onda específico quando está ativada por Ran-GTP. Na metáfase da célula humana mostrada aqui, a atividade de Ran (amarelo e vermelho) é mais alta ao redor dos cromossomos, entre os polos do eixo mitótico (indicada por asteriscos). (De P. Kaláb et al., Nature 440:697-701, 2006. Com permissão de Macmillan Publishers Ltd.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 987 Nucleação Ligação cruzada antiparalela Movimento para fora Concentração nos polos mediada mediada por cinesina-5 mediado por cinesina-4,10 por dineína e cinesina-14 + Figura 17-28 Auto-organização do fuso por proteínas motoras. Os cromossomos mitóticos estimulam a ativação local de proteínas que nucleiam e promovem a formação de microtúbulos na vizinhança dos cromosso- mos. As proteínas motoras cinesina-5 (ver Figura 17-25) organizam esses microtúbulos em feixes antiparalelos, enquanto as cinesinas-4 e 10 orientadas para as extremidades mais (+) ligam os microtúbulos aos braços cro- mossômicos e afastam as extremidades menos (-) dos cromossomos. Os motores de dineína e cinesina-14, jun- tamente com numerosas outras proteínas, orientam essas extremidades menos (-) em um par de polos do fuso. A capacidade dos cromossomos de estabilizar e organizar microtúbulos permite às células formar fusos bipolares na ausência de centrossomos. Acredita-se que conjunto do eixo acentrossômico começa com a formação de microtúbulos ao redor dos cromos- somos. Várias proteínas motoras organizam os microtúbulos em um eixo bipolar, como ilustrado na Figura 17-28. As células que normalmente não possuem centrossomos, como aquelas de plantas superiores e de vários ovócitos de animais, usam esse processo de auto-organização com base nos cromossomos para formar fusos. É também 0 processo usado para formar fusos em certos embriões de animais que foram induzidos a desenvolver óvulos sem fertiliza- ção (i.e., partenogeneticamente); uma vez que 0 espermatozoide normalmente fornece centrossomo quando fertiliza um óvulo, os fusos mitóticos nesses embriões partenoge- néticos se desenvolvem sem centrossomos (Figura 17-29). Mesmo em células que nor- malmente contêm centrossomos, os cromossomos ajudam a organizar os microtúbulos do fuso e, com auxílio de várias proteínas motoras, podem promover a formação de um fuso mitótico bipolar se os centrossomos forem removidos. Embora fuso acentrossô- Polos do fuso mico resultante possa segregar cromossomos normalmente, ele carece de microtúbulos astrais, que são responsáveis pelo posicionamento do fuso em células animais; como resultado, com frequência fuso é mal posicionado na célula. Áster Os cinetocoros ligam as cromátides-irmãs ao fuso Após a formação de um arranjo bipolar de microtúbulos, a segunda etapa importante na formação do fuso é a sua ligação aos pares de cromátides-irmãs. Os microtúbulos do eixo se ligam a cada cromátide no seu cinetocoro, uma estrutura proteica gigan- te, de múltiplas camadas que é formada na região centromérica da cromátide (Figura 10 µm 17-30; ver também Capítulo 4). Na metáfase, as extremidades mais (+) do cinetocoro dos microtúbulos são incorporadas aos sítios de ligação a microtúbulos especializados Figura 17-29 Formação de fuso bipolar sem centrossomos em embriões parte- na região externa do cinetocoro, mais afastada do DNA. cinetocoro de uma célula nogenéticos do inseto Sciara (mosca- animal pode ligar de 10 a 40 microtúbulos, enquanto um cinetocoro de brotamento de -dos-fungos). Os microtúbulos estão levedura pode ligar apenas um microtúbulo. A fixação de cada microtúbulo depende de corados em verde, e os cromossomos em múltiplas cópias de um complexo proteico em forma de haste chamado de complexo vermelho. A micrografia de fluorescência Ndc80, que está ancorado no cinetocoro em uma extremidade e interage com as late- superior mostra um fuso normal formado com centrossomos em um embrião de rais de outro microtúbulo, ligando assim microtúbulo ao cinetócoro, enquanto ainda Sciara fertilizado normalmente. A micro- permite a adição ou remoção de subunidades de tubulina nessa extremidade (Figura grafia inferior mostra um fuso formado 17-31). A regulação da polimerização e da despolimerização da extremidade mais (+) sem centrossomos em um embrião que no cinetocoro é crítica ao controle do movimento do cromossomo sobre fuso, como iniciou desenvolvimento sem fertilização. Observe que fuso com centrossomos discutiremos posteriormente. tem um áster em cada polo, ao passo que A fixação do cinetocoro ao eixo ocorre por uma sequência complexa de eventos. o fuso formado sem centrossomos não. No fim da prófase em células animais, os centrossomos do crescimento do eixo geral- Os dois tipos de fusos são capazes de mente permanecem em lados opostos do envelope nuclear. Assim, quando envelope segregar os cromossomos replicados. (De B. de Saint Phalle e W. Sullivan, J. Cell Biol. se fragmenta, os pares de cromátides-irmãs são bombardeados por extremidades mais 141:1383-1391, 1998. Com permissão de (+) de microtúbulos provenientes de duas direções. Porém, os cinetocoros não conse- The Rockefeller University Press.)988 PARTE IV Organização interna da célula Cromossomo replicado Cinetocoro Cromátide anáfase Movimento da direção da cromátide Região centromérica do cromossomo Cinetocoro Microtúbulos embebidos no cinetocoro Microtúbulos do cinetocoro (C) 1 µm (A) (B) Cromátide Figura 17-30 o cinetocoro. (A) Micro- guem de imediato a correta fixação do microtúbulo a ambos os polos do eixo. Em vez grafia de fluorescência de um cromosso- disso, estudos detalhados com microscopia de luz e eletrônica mostram que muitas fi- mo metafásico corado com um corante fluorescente que se liga ao DNA e com xações iniciais são fixações laterais instáveis, nas quais um cinetocoro se fixa ao lado de autoanticorpos humanos que reagem um dos microtúbulos, com a ajuda de uma proteína motora cinesina fora do cinetocoro. com proteínas específicas do cinetocoro. Rapidamente, entretanto, a extremidade mais (+) do microtúbulo dinâmico captura o Os dois cinetocoros, um associado a cinetocoro na orientação correta (Figura 17-32). cada cromátide-irmã, estão corados em Outro mecanismo de fixação também ocorre, particularmente na ausência de vermelho. (B) de um cromos- somo metafásico mostrando suas duas centrossomos. A análise microscópica cuidadosa sugere que microtúbulos pequenos cromátides-irmãs ligadas às extremidades na vizinhança dos cromossomos tornam-se incorporados nas extremidades mais (+) mais (+) dos microtúbulos do cinetocoro. do cinetocoro. A polimerização nessas extremidades resulta, então, no crescimento dos Cada cinetocoro forma uma placa sobre a microtúbulos a partir do cinetocoro. As extremidades menos (-) desses microtúbulos superfície do centrômero. (C) Micrografia eletrônica de uma cromátide anafásica do cinetocoro são eventualmente ligadas em sentido transversal a outras extremidades com microtúbulos ligados a seu cineto- menos (-) e orientadas por proteínas motoras no polo do fuso (ver Figura 17-28). coro. Embora a maioria dos cinetocoros tenha uma estrutura trilaminar, aqui mostrado (de uma alga verde) tem uma A biorientação é obtida por tentativa e erro estrutura surpreendentemente complexa, sucesso da mitose demanda que as cromátides-irmãs de um par se liguem a polos com camadas adicionais. (A, cortesia de B.R. Brinkley; C, de J.D. Pickett-Heaps e opostos do fuso mitótico, de forma que se movam a extremidades opostas da célula L.C. Fowke, Aust. J. Biol. Sci. 23:71-92, quando se separam na anáfase. Como esse modo de ligação, denominado biorientação, 1970. Com permissão de CSIRO.) é obtido? que impede a ligação de ambos os cinetocoros ao mesmo polo do fuso ou a Extremidade mais (+) do microtúbulo Complexo Ndc80 (A) (B) (C) Cinetocoro 100 nm Figura 17-31 Locais de ligação de microtúbulos no cinetocoro. (A) Nessa micrografia eletrônica de um cinetocoro de mamífero, cromossomo está à direita e as extremidades mais (+) de múltiplos microtúbulos estão incorporadas no exterior do cinetocoro à esquerda. (B) A tomografia eletrônica (discutida no Capítulo 9) foi usada para construir uma imagem tridimensional de baixa resolução no exterior do cinetocoro em (A). Vários microtúbulos (em múltiplas cores) são incorporadas em material fibroso do cinetocoro, que pensa-se ser composto do complexo Ndc80 e outras proteínas. (C) Cada microtúbulo está ligado ao cinetocoro por interações com múltiplas cópias do complexo Ndc80 (azul). Esse complexo liga-se nas laterais do microtúbulo perto da extremidade mais (+), permitindo que a polimerização e despolimerização ocorra enquanto o microtúbulo permanece ligado ao cinetocoro. (A e de T.Y. Dong et al., Nature Cell Biol. 9:516-522, 2007. Com permissão de Macmillan Publishers Ltd.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 989 + (A) (B) (C) (D) (E) Envelope nuclear Polo do fuso Prometáfase precoce: ligações do cinetocoro lateral, Prometáfase mediana: Metáfase: Prófase tardia braços do cromossomo empurrados para fora ligações terminais biorientação Figura 17-32 Ligação do cromossomo ao eixo mitótico em células animais. (A) Na prófase tardia de mui- tas células animais, os polos do eixo mitótico se movimentam para lados opostos do envelope nuclear, com uma matriz de sobreposição de microtúbulos entre eles. (B) Após a fragmentação do envelope nuclear, os pares de cromátides-irmãs são expostos a um grande número de extremidades mais (+) dinâmicas de microtúbulos que irradiam a partir dos polos do fuso. Em muitos casos, os cinetocoros são inicialmente ligados às laterais desses microtúbulos, enquanto ao mesmo tempo, os braços dos cromossomos são empurrados para fora a partir do interior do fuso, impedindo que os braços bloqueiem acesso aos cinetocoros dos microtúbulos. (C) Por fim, as cromátides-irmãs lateralmente ligadas, estão arranjadas em um anel em torno do exterior do fuso. Muitos microtúbulos estão concentrados nesse anel, de modo que eixo é relativamente por dentro. (D) Extremi- dades mais (+) de microtúbulos dinâmicos eventualmente encontram os cinetocoros em uma orientação final e são capturadas e estabilizadas. (E) Ligações finais estáveis em ambos polos resultam em biorientação. Os microtúbulos adicionais são ligados ao cinetocoro, resultando em uma fibra de cinetocoro contendo de 10 a 40 microtúbulos. ligação de um cinetocoro a ambos os polos do fuso? Parte da resposta é que os cineto- coros-irmãos são dispostos em uma orientação de costas um para outro, que reduz a probabilidade de ambos os cinetocoros estarem voltados para mesmo polo do fuso. Entretanto, ligações incorretas de fato ocorrem, e apurados mecanismos reguladores fo- ram desenvolvidos para corrigi-las. As ligações incorretas são corrigidas por um sistema de tentativa e erro que se ba- seia em um princípio simples: as ligações incorretas são altamente instáveis e de curta duração, ao passo que as ligações corretas são estabilizadas em seu devido lugar. Como o cinetocoro detecta uma ligação correta? A resposta parece ser a tensão (Figura 17-33). Quando um par de cromátides-irmãs está propriamente biorientado no fuso, os dois ci- netocoros são puxados para direções opostas por forças fortes em direção aos polos. A coesão de cromátides-irmãs resiste a essas forças em direção aos polos, criando altos ní- veis de tensão dentro dos cinetocoros. Quando os cromossomos estão ligados de forma incorreta quando ambas as cromátides-irmãs estão ligadas ao mesmo polo do fuso, por exemplo a tensão é baixa, e o cinetocoro envia um sinal inibitório que relaxa controle Figura 17-33 Formas alternativas de ligação do cinetocoro ao fuso dos polos. (A) Inicialmente, um único micro- túbulo de um polo do fuso se liga a um ci- netocoro em um par de cromátides-irmãs. Microtúbulos adicionais podem, então, ligar-se ao cromossomo de várias manei- ras. (B) Um microtúbulo do mesmo polo (A) INSTÁVEL do fuso pode se ligar ao outro cinetocoro- -irmão, ou (C) microtúbulos de ambos os polos do fuso podem se ligar ao mesmo cinetocoro. Contudo, essas ligações incor- retas são instáveis, de forma que um dos dois microtúbulos tende a se dissociar. (D) Quando um segundo microtúbulo do polo oposto se liga ao segundo cinetocoro, acredita-se que os cinetocoros-irmãos de- tectem a tensão através de seus sítios de ligação a microtúbulos. Isso desencadeia um aumento na afinidade de ligação no microtúbulo, estabilizado, dessa forma, a (B) INSTÁVEL (C) INSTÁVEL (D) ESTÁVEL ligação correta.990 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-34 Como a tensão pode Cromátide-irmã aumentar a fixação do microtúbulo Complexo Ndc-80 ao cinetocoro. Esses diagramas ilustram Cinase Aurora-B 00000 um mecanismo especulativo pelo qual a biorientação poderia aumentar a ligação do microtúbulo ao cinetocoro. Um único II II cinetocoro é mostrado para maior clareza; BIORIENTAÇÃO FORÇA EM polo do fuso está à direita. (A) Quando DIREÇÃO um par de cromátides-irmãs não está liga- AOS POLOS II do ao fuso ou ligado a um único polo do fuso, há pouca tensão entre exterior e 00000 Extremidade mais interior dos cinetocoros. A proteína-cinase (+) do microtúbulo Aurora-B está presa ao interior do cine- Cinetocoro Cinetocoro interno externo tocoro e fosforila os sítios de ligação do microtúbulo, incluindo complexo Ndc80 (A) BAIXA TENSÃO (B) ALTA TENSÃO (azul), no exterior do cinetocoro, como mostrado, reduzindo, assim, a afinidade de ligação do microtúbulo. Por conseguin- de seu sítio de ligação ao microtúbulo, permitindo que a dissociação ocorra. Quando a te, os microtúbulos associam e dissociam biorientação ocorre, a alta tensão no cinetocoro bloqueia o sinal inibidor, fortalecendo a rapidamente, e a ligação é instável. (B) Quando a biorientação é obtida, as forças ligação do microtúbulo. Em células animais, a tensão não somente aumenta a afinidade de tração do cinetocoro em direção ao do sítio de ligação, mas também leva à ligação de microtúbulos adicionais ao cinetocoro. polo do fuso são repelidas por forças de Isso resulta na formação de uma espessa fibra de cinetocoro, composta por múltiplos tração de outro cinetocoro-irmão em dire- microtúbulos. ção ao polo oposto, e a tensão resultante mecanismo de tensão-detecção depende da proteína-cinase Aurora-B, que está puxa cinetocoro exterior para longe do cinetocoro interior. Como resultado, associada ao cinetocoro e pensa-se gerar sinal inibitório que reduz a força de ligação Aurora-B não é capaz de chegar ao cine- do microtúbulo na ausência de tensão. Ela fosforila vários componentes do sítio de li- tocoro exterior, e os sítios de ligação do gação do microtúbulo, incluindo complexo Ndc80, diminuindo a afinidade dos sítios microtúbulo não são fosforilados. A afini- para a extremidade mais (+) do microtúbulo. Quando a biorientação ocorre, a tensão dade de ligação do microtúbulo é, então, aumentada, resultando na ligação estável resultante de alguma maneira reduz a fosforilação por Aurora-B, aumentando assim a de múltiplos microtúbulos a ambos os afinidade do sítio de ligação (Figura 17-34). cinetocoros. A desfoforilação de proteínas Em seguida a sua ligação aos dois polos do fuso, os cromossomos são arrastados do cinetocoro exterior depende de uma para trás e para frente, assumindo, por fim, uma posição equidistante entre os dois polos, fosfatase que não é mostrada aqui. uma posição chamada de placa metafásica. Em células de vertebrados, os cromossomos oscilam gentilmente na placa metafásica, aguardando o sinal para que as cromátides-ir- mãs se separem. sinal é produzido com um tempo previsível de atraso, após a ligação biorientada do último cromossomo. Múltiplas forças atuam em cromosomos no fuso Múltiplos mecanismos geram forças que movem os cromossomos para frente e para trás após serem ligados ao fuso, e produzem a tensão que é tão importante para a estabiliza- ção da ligação correta. Na anáfase, forças similares puxam cromátides separadas para lados opostos do fuso. As três forças principais do fuso são particularmente críticas, em- bora sua força e importância varie em diferentes estágios da mitose. A primeira força principal puxa o cinetocoro e sua cromátide associada ao longo do microtúbulo do cinetocoro em direção ao polo do fuso. Ela é produzida por proteínas do próprio cinetocoro. Por um mecanismo incerto, a despolimerização na extremidade mais (+) do microtúbulo gera uma força que puxa o cinetocoro em direção aos polos. Essa força traciona os cromossomos durante a prometáfase e a metáfase, mas é particu- larmente importante para mover as cromátides-irmãs em direção aos polos, após elas se separarem na anáfase. Interessantemente, essa força em direção aos polos gerada pelo cinetocoro não requer ATP ou proteínas motoras. Isso poderia, em princípio, parecer pouco plausível, mas mostrou-se que cinetocoros purificados em um tubo de ensaio, sem ATP presente, podem permanecer ligados a microtúbulos em despolimerização e, assim, mover-se. A energia que promove movimento é armazenada no microtúbulo, sendo liberada quando microtúbulo se despolimeriza; ela na verdade vem da hidrólise de GTP que ocorre após uma subunidade de tubulina ser adicionada à extremidade de um microtúbulo (discutido no Capítulo 16). Como a despolimerização das extremidades mais (+) orienta cinetocoro em di- reção ao polo? Como discutido anteriormente (ver Figura 17-31C), complexos Ndc80 noCAPÍTULO 17 Ciclo celular 991 cinetocoro fazem múltiplas ligações de baixa afinidade ao longo da lateral do microtú- bulo. Devido às ligações serem constantemente quebradas e refeitas em novos locais, cinetocoro permanece ligado ao microtúbulo mesmo quando microtúbulo despolime- riza. Em princípio, isso poderia movimentar o cinetocoro em direção ao polo do fuso. Uma segunda força em direção aos polos é proporcionada, em alguns tipos celula- res, pelo fluxo de microtúbulos, de tal modo que os próprios microtúbulos são puxados em direção aos polos do fuso e dissociados em suas extremidades menos (-). meca- nismo subjacente a esse movimento em direção aos polos não é claro, embora possa depender de forças geradas por proteínas motoras e despolimerização de extremidades menos (-) no polo do fuso. Na metáfase, a adição de tubulina nova à extremidade mais (+) de um microtúbulo contrabalança a perda de tubulina na extremidade menos (-), de forma que comprimento do microtúbulo permanece constante, a despeito do movi- mento de microtúbulos em direção ao polo do fuso (Figura 17-35). Qualquer cinetocoro que esteja ligado a um microtúbulo sofrendo tal fluxo experimenta uma força em direção ao polo, que contribui à geração de tensão no cinetocoro na metáfase. Juntamente com as forças baseadas em cinetocoro descritas anteriormente, o fluxo também contribui para a força em direção aos polos que promove o deslocamento das cromátides-irmãs após a sua separação na anáfase. A terceira força de ação dos cromossomos é a força de ejeção polar, ou vento polar. Os motores de cinesina-4 e 10 orientados para a extremidade mais (+) nos braços cro- mossômicos interagem com microtúbulos interpolares e transportam os cromossomos para longe dos polos do fuso (ver Figura 17-25). Essa força é particularmente importante na prometáfase e metáfase, quando ajuda a empurrar os braços dos cromossomos para fora do fuso. Essa força poderia também ajudar a alinhar os pares de cromátides-irmãs na metáfase (Figura 17-36). Um dos aspectos mais extraordinários da mitose em células de vertebrados é contínuo movimento oscilatório dos cromossomos em prometáfase e metáfase. Quando estudados por videomicroscopia em células pulmonares de tritão, observa-se a alter- nância dos movimentos entre dois estados um estado em direção aos polos, quando os cromossomos são puxados em direção ao polo, e um estado em direção oposta aos polos, ou neutro, quando forças em direção ao polo são interrompidas e a força de ejeção Polo do fuso REMOÇÃO DA TUBULINA Distância ADIÇÃO DA TUBULINA ADIÇÃO DA TUBULINA Subunidades Subunidades marcadas (A) marcadas (B) (C) Tempo que se deslocam em direção aos polos REMOÇÃO DA TUBULINA (D) Figura 17-35 Fluxo de microtúbulos no fuso metafásico. (A) A fim de observar fluxo de microtúbulos, uma quantidade muito pequena de tubulina fluo- rescente é injetada em células vivas, de modo que microtúbulos individuais se formam com uma proporção muito pequena de tubulina fluorescente. Tais micro- túbulos podem ser visualizados por microscopia de fluorescência. (B) As micrografias de fluorescência de um fuso mitótico em uma célula epitelial pulmonar de tritão vivo. Os cromossomos são coloridos de marrom e a tubulina marcada em vermelho. (C) movimento de subunidades individuais pode ser acompanhado por videomicroscopia em diferentes intervalos de tempo. As imagens da região fina vertical (seta) em (B), obtidas em tempos sequenciais, mostram que subuni- dades individuais se movem em direção aos polos em uma taxa de cerca de indicando que os microtúbulos se deslocam em direção aos polos. (D) comprimento dos microtúbulos no fuso metafásico não se altera de forma significativa, porque novas subunidades de tubulina são adicionadas à extremidade mais (+) do microtúbulo à mesma taxa que subunidades de tubulina são removidas da extremidade menos (-). e de T.J. Mitchison e E.D. Salmon, Nat. Cell Biol. 3:E17-21, 2001. Com permissão de Macmillan Publishers Ltd.)992 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-36 Como forças opostas podem deslocar os cromossomos para a placa metafásica. (A) Evidência de uma força de ejeção polar que afasta cro- CORTE COM LASER mossomos dos polos do fuso em direção à Microtúbulo Extremidades mais (+) placa equatorial do fuso. Neste experimen- interpolar controladas por proteínas to, um feixe de laser corta um cromosso- ou astral motoras cinesina-4,1 mo em prometáfase que está ligado a um único polo por um microtúbulo do cineto- Polo do fuso coro. A parte do cromossomo cortado sem EMPURRA um cinetocoro rapidamente se afasta do polo, ao passo que a parte com cineto- Braço sem cinetocoro coro se move em direção ao polo, refletin- se move para longe do uma diminuição de repulsão. (B) Mo- do polo PUXA delo de como duas forças opostas podem cooperar para mover os cromossomos Microtúbulo para a placa metafásica. Acredita-se que (A) Braço com (B) do cinetocoro proteínas motoras orientadas para a extre- cinetocoro se move em midade mais (+) (cinesina-4 e cinesina-10) direção ao polo nos braços cromossômicos interajam com microtúbulos e gerem a força de ejeção polar, que empurra os cromossomos em polar afasta os cromossomos do polo. A alternância entre os dois estados pode depender direção ao equador do fuso (ver Figura do grau de tensão presente no cinetocoro. Tem-se proposto, por exemplo, que à medida 17-25). Acredita-se que forças em direção aos polos geradas por despolimerização que os cromossomos se movem em direção ao polo do fuso, uma força de ejeção polar no cinetocoro, juntamente com fluxo de crescente gera tensão no cinetocoro mais próximo ao polo, provocando uma alternância microtúbulos, puxem os cromossomos em ao estado em direção oposta aos polos e resultando, gradativamente, no acúmulo de cro- direção ao polo. mossomos na placa equatorial do fuso. O APC/C provoca a separação da cromátide-irmã e a conclusão da mitose Após M-Cdk desencadearem um complexo processo que leva à metáfase, o ciclo celular chega ao clímax com a separação das cromátides-irmãs na transição metáfase-anáfase (Figura 17-37). Ainda que a atividade da M-Cdk monte o palco para esse evento, o com- plexo promotor da anáfase (APC/C) anteriormente discutido desencadeia o processo que inicia a separação das cromátides-irmãs, ao ubiquitinar várias proteínas reguladoras mitóticas e, com isso, promovendo sua degradação (ver Figura 17-15A). Durante a metáfase, coesinas que mantêm as cromátides-irmãs unidas resistem às forças em direção aos polos que separam as cromátides-irmãs. A anáfase começa com a perda súbita da coesão de cromátides-irmãs, que permite às irmãs se separarem e se moverem a polos opostos do fuso. APC/C inicia o processo ao marcar a proteína inibi- dora securina para a degradação. Antes da anáfase, a securina se liga e inibe a atividade (A) (B) 20 µm Figura 17-37 Separação de cromátides-irmãs na anáfase. Na transição da metáfase (A) para anáfase (B), as cromátides-irmãs se separam súbita e sincro- nicamente e se movem em direção a polos opostos do fuso mitótico como mostrado nessas micrografias ópticas de células do endosperma de Haemanthus (lírio) que foram coradas com anticorpos marcados com ouro contra a tubulina. (Cortesia de Andrew Bajer.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 993 Figura 17-38 início da separação das Securina pelo APC/C. A ativação do APC/C pela Cdc20 leva à ubiquitinação e à destruição da securina, Separase que normalmente mantém a separase Cdc20 inativa em um estado inativo. A destruição da securina permite à separase clivar Scc1, uma subunidade do complexo de coesina UBIQUITINAÇÃO E DEGRADAÇÃO que mantém as cromátides-irmãs unidas DE SECURINA (ver Figura 17-19). As forças que tracio- APC/C inativa nam fuso mitótico separam, então, as APC/C ativa cromátides-irmãs. Em células animais, a fosforilação por Cdks também inibe a separase (não mostrado). Assim, a inati- M-Cdk Separase vação das Cdks na anáfase (resultante da ativa Coesinas clivadas degradação de ciclinas) também promove Coesina Fuso e dissociadas a ativação da separase, ao propiciar sua mitótico desfosforilação. G2 Metáfase Anáfase de uma protease chamada de separase. A destruição da securina, no final da metáfase, libera a separase, que então fica livre para clivar uma das subunidades de coesina. As coesinas perdem força, e as cromátides-irmãs se separam (Figura 17-38). Além da securina, o APC/C também direciona as S-ciclinas e as M-ciclinas à des- truição, levando à perda da maioria das atividades das Cdks na anáfase. A inativação das Cdks permite que fosfatases desfosforilem muitos dos substratos-alvo de Cdks na célula, como requerido à conclusão da mitose e da citocinese. Se o APC/C desencadeia a anáfase, o que ativa o APC/C? Sabe-se apenas parte da resposta. Como mencionado anteriormente, a ativação de APC/C requer a ligação da proteína Cdc20 (ver Figura 17-15A). Ao menos dois processos regulam a Cdc20 e sua associação ao APC/C. Primeiro, a síntese de Cdc20 aumenta à medida que a célula se aproxima da mitose, devido a um aumento da transcrição de seu gene. Segundo, a fos- forilação do APC/C auxilia a Cdc20 a se ligar ao APC/C, ajudando, com isso, a criar um complexo ativo. Entre as cinases que fosforilam e consequentemente ativam APC/C está a M-Cdk. Portanto, a M-Cdk não somente desencadeia os eventos mitóticos iniciais que levam à metáfase, mas também monta o palco para a progressão à anáfase. A habili- dade de M-Cdk promover a atividade de Cdc20-APC/C cria um ciclo de retroalimentação negativa: M-Cdk põe em movimento um processo regulador que leva à degradação da ciclina e assim à sua inativação. Cromossomos não ligados bloqueiam a separação das cromátides-irmãs: ponto de verificação da formação do fuso As substâncias que desestabilizam os microtúbulos, como a colchicina ou a vimblastina (discutido no Capítulo 16), sequestram as células em mitose por horas ou mesmo por dias. Essa observação levou à identificação de um mecanismo chamado ponto de verifi- cação da formação do fuso, que é ativado pelo tratamento com substâncias e bloqueia a progressão à transição entre metáfase e anáfase. mecanismo do ponto de verificação assegura que a célula não entre na anáfase até que todos os cromossomos estejam corre- tamente biorientados no fuso mitótico. ponto de verificação da formação do fuso depende de um mecanismo sensor que monitora a força de ligação do microtúbulo ao cinetocoro, possivelmente através da detecção de tensão como descrito anteriormente (ver Figura 17-34). Todo cinetocoro que não está propriamente ligado ao fuso envia um sinal negativo que se difunde e im-994 PARTE IV Organização interna da célula pede a ativação de Cdc20-APC/C através da célula e assim impede a transição metáfase- -anáfase. Quando o último par de cromátides-irmãs está apropriadamente biorientado, bloqueio é removido permitindo que ocorra a separação das cromátides-irmãs. sinal negativo do ponto de verificação depende de várias proteínas, incluindo Mad2, que são recrutadas por cinetocoros não ligados (Figura 17-39). As análises estru- turais detalhadas de Mad2 sugerem que cinetocoros não ligados agem como uma enzi- ma que catalisa a modificação conformacional de Mad2, de modo que Mad2 junto com outras proteínas, pode ligar e inibir Cdc20-APC/C. Em células somáticas de mamíferos, ponto de verificação da formação do fuso determina momento normal da anáfase. A destruição da securina nessas células co- meça momentos após último par de cromátides-irmãs ficar biorientado no fuso, e a anáfase começa cerca de 20 minutos mais tarde. A inibição experimental do mecanismo do ponto de verificação causa a separação prematura das cromátides-irmãs e a anáfase. Figura 17-39 A proteína Mad2 em ci- Surpreendentemente, momento normal da anáfase não depende do ponto de verifica- netocoros não ligados. Esta micrografia de fluorescência mostra uma célula de ção da formação do fuso em algumas células, como leveduras e as células de embriões mamífero em prometáfase, com fuso jovens de rãs e moscas. Outros mecanismos, ainda desconhecidos, devem determinar mitótico em verde e as cromátides-irmãs momento de início da anáfase nessas células. em azul. Um par de cromátides-irmãs está ligado a um único polo do fuso. A mar- cação colorida com anticorpos anti-Mad2 Os cromossomos são segregados na anáfase A e B indica que a Mad2 está ligada ao cineto- coro da cromátide-irmã não ligada (ponto A perda repentina da coesão de cromátides-irmãs no início da anáfase leva à separação vermelho, indicado pela seta vermelha). das cromátides-irmãs, o que possibilita que as forças do fuso mitótico puxem as cromáti- Uma pequena quantidade de Mad2 se as- des a polos opostos da célula chamada de segregação cromossômica. Os cromossomos socia ao cinetocoro da cromátide-irmã que se movem por meio de dois processos independentes e que se sobrepõem. primeiro, está ligada ao polo do fuso (ponto claro, indicado pela seta branca). (De J.C. Waters anáfase A, é o movimento inicial dos cromossomos em direção aos polos, que é acom- et al., J. Cell Biol. 141:1181-1191, 1998. panhado pelo encurtamento dos microtúbulos do cinetocoro. segundo, anáfase B, é Com permissão dos autores.) a separação dos próprios polos do fuso, que começa após as cromátides-irmãs terem se separado e os cromossomos terem se distanciado (Figura 17-40). movimento dos cromossomos na anáfase A depende de uma combinação das duas principais forças em direção aos polos anteriormente descritas. A primeira é a força gerada pela despolimerização dos microtúbulos no cinetocoro, que resulta na perda de subunidades de tubulina na extremidade mais (+) à medida que cinetocoro se move em direção ao polo. A segunda é propiciada pelo fluxo de microtúbulos, que é movi- mento dos microtúbulos em direção ao polo do fuso, onde ocorre a despolimerização da extremidade menos (-). A importância relativa dessas duas forças durante a anáfase varia em diferentes tipos celulares: em células embrionárias, por exemplo, o movimento dos cromossomos depende principalmente do fluxo de microtúbulos, ao passo que o movimento em células de leveduras e células somáticas de vertebrados resulta primaria- mente de forças geradas no cinetocoro. A separação do polo do fuso durante a anáfase depende de mecanismos contro- lados por motores, similares àqueles que separam os dois centrossomos no início da mi- tose. As proteínas motoras cinesina-5 orientadas para a extremidade mais (+), que ligam transversalmente as extremidades mais (+) sobrepostas dos microtúbulos interpolares, afastam os polos. Além disso, dineínas motoras que ancoram extremidades mais (+) de microtúbulos astrais às células do córtex puxam os polos opostos (ver Figura 17-25). Embora a separação das cromátides-irmãs inicie os movimentos cromossômi- cos da anáfase A, outros mecanismos também asseguram movimentos corretos dos cromossomos na anáfase A e alongamento do fuso na anáfase B. Mais do que isso, a conclusão de uma anáfase normal depende da desfosforilação de substratos das Cdks, que na maioria das células resulta da destruição, dependente de APC/C, de ciclinas. Se a destruição da M-ciclina é impedida pela produção de uma forma mutante que não é reconhecida pelo APC/C, por exemplo a separação das cromátides-irmãs geralmente ocorre, mas os movimentos cromossômicos e o comportamento dos microtúbulos da anáfase são anormais. As contribuições relativas da anáfase A e da anáfase à segregação cromossômica variam muito, dependendo do tipo celular. Em células de mamíferos, a anáfase começa pouco depois da anáfase A e para quando 0 fuso tem aproximadamente dobro de seu comprimento na metáfase; por outro lado, os fusos de leveduras e de certos protozoáriosCAPÍTULO 17 Ciclo celular 995 ANÁFASE A ANÁFASE B usam a anáfase primariamente para separar os cromossomos em anáfase, e seus fusos Figura 17-40 Os dois processos de se alongam até 15 vezes o comprimento da metáfase. anáfase em células de mamíferos. As cromátides-irmãs separadas se movem em direção aos polos na anáfase A. Na anáfa- Os cromossomos segregados são empacotados em núcleos-filhos se B, os dois polos dos fusos se afastam. na telófase No final da anáfase, os cromossomos-filhos se segregaram em dois grupos iguais em ex- tremidades opostas da célula. Na telófase, o estágio final da mitose, os dois conjuntos de cromossomos são empacotados em um par de núcleos-filhos. primeiro evento prin- cipal da telófase é a despolimerização do fuso mitótico, seguida pela formação do enve- lope nuclear. Inicialmente, fragmentos da membrana nuclear se associam à superfície de cromossomos individuais. Esses fragmentos de membrana se fundem para envolver parcialmente grupos de cromossomos, e depois coalescem para formar novamente o en- velope nuclear completo. Os complexos de poros nucleares são incorporados ao envelo- pe, a lâmina nuclear se forma novamente, e o envelope mais uma vez se torna contínuo com o retículo endoplasmático. Uma vez reformado envelope nuclear, os complexos de poros bombeiam as proteínas nucleares para interior, núcleo se expande, e os cromossomos mitóticos são reorganizados em seu estado interfásico, possibilitando a retomada da transcrição gênica. Um novo núcleo foi criado, e a mitose está completa. Tudo o que resta à célula é concluir sua divisão em duas. Vimos anteriormente que a fosforilação de várias proteínas pela M-Cdk promo- ve a formação do fuso, a condensação dos cromossomos e a fragmentação do envelope nuclear no início da mitose. Portanto, não é surpreendente que a desfosforilação dessas mesmas proteínas seja necessária à despolimerização e à formação de núcleos-filhos na telófase. Em princípio, essas desfosforilações e a conclusão da mitose poderiam ser provocadas pela inativação de Cdks, pela ativação de fosfatases, ou por ambas. Embora a inativação de Cdks resultante primariamente da degradação de ciclinas seja a princi- pal responsável na maioria das células, algumas células também dependem da ativação de fosfatases. Na levedura de brotamento, por exemplo, a conclusão da mitose depende da ativação de uma fosfatase chamada de Cdc14, que desfosforila um subconjunto de substratos de Cdks envolvido na anáfase e na telófase. Resumo A M-Cdk desencadeia os eventos do início da mitose, incluindo a condensação dos cromos- somos, a formação do fuso mitótico e a ligação bipolar dos pares de cromátides-irmãs aos microtúbulos do fuso. Em células animais, a formação do fuso depende em grande parte da capacidade dos cromossomos mitóticos de estimular a nucleação local e a estabilidade de microtúbulos, assim como da capacidade de proteínas motoras de organizar os micro-996 PARTE IV Organização interna da célula túbulos em um arranjo bipolar. Muitas células também usam centrossomos para facilitar a formação do fuso. A anáfase é desencadeada pelo APC/C, que estimula a degradação das proteínas que mantêm as cromátides-irmãs unidas. APC/C também promove a des- truição de ciclinas e, assim, a inativação da M-Cdk. desfosforilação resultante de alvos das Cdks é necessária aos eventos que completam a mitose, incluindo a dissociação do fuso e a formação do novo envelope nuclear. CITOCINESE A etapa final do ciclo celular é a citocinese, a divisão do citoplasma. Em muitas células, a citocinese segue cada mitose, embora algumas delas, como as células embrionárias iniciais da Drosophila e alguns hepatócitos de mamíferos e células musculares cardía- cas, entram em mitose sem citocinese e, dessa forma, adquirem múltiplos núcleos. Na maioria das células animais, a citocinese começa na anáfase e termina pouco depois da conclusão da mitose na telófase. A primeira mudança visível da citocinese em uma célula animal é o aparecimento repentino de uma reentrância, ou sulco de clivagem, na superfície celular. sulco rapida- mente se torna mais profundo e se espalha ao redor da célula, até dividir completamente a célula em duas. A estrutura subjacente a esse processo é anel contrátil um agrupa- mento dinâmico composto por filamentos de actina, filamentos de miosina II e muitas proteínas estruturais e reguladoras. Durante a anáfase, o anel se forma logo abaixo da membrana plasmática (Figura 17-41; ver também Painel 17-1). anel gradativamente se contrai, e, ao mesmo tempo, a fusão de vesículas intracelulares com a membrana plas- mática insere novo material de membrana adjacente ao anel. Essa adição de membrana compensa 0 aumento na área de superfície que acompanha a divisão citoplasmática. Quando a contração do anel é concluída, a inserção e a fusão da membrana selam a lacuna entre as células-filhas. A actina e a miosina do anel contrátil geram força para a citocinese Em células interfásicas, os filamentos de actina e miosina formam uma rede cortical sub- jacente à membrana plasmática. Em algumas células, eles também formam um grande feixe citoplasmático chamado de fibras de estresse (discutido no Capítulo 16). Quando as células entram na mitose, esses arranjos de actina e miosina se desestruturam; a maior parte da actina se reorganiza, e os filamentos de miosina são liberados. Quando as cro- mátides-irmãs se separam na anáfase, a actina e a miosina II começam a se acumular no anel contrátil (Figura 17-42) que está sendo rapidamente formado, que também contém numerosas outras proteínas que propiciam um suporte estrutural ou ajudam na formação do anel. A formação do anel contrátil é, em parte, resultante da polimerização Filamentos de actina e miosina do anel contrátil (A) (B) (C) 200 µm 25 µm Figura 17-41 Citocinese. (A) Os feixes de actina-miosina do anel contrátil são orientados como mostrado, de forma que sua contração a membrana para dentro. (B) Nesta micrografia eletrônica de varredura de baixo aumento de um de rã em clivagem, sulco de clivagem é particularmente proeminente, uma vez que a célula é surpreendentemente grande. enrugamento da membrana celular é causado pela atividade do anel contrátil embaixo dela. (C) A superfície de um sulco em maior aumento. e C, de H.W. Beams e R.G. Kessel, Am. Sci. 64:279-290, 1976. Com permissão de Sigma Xi.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 997 Microtúbulos interpolares remanescentes do fuso central Anel contrátil de actina e filamentos de miosina em sulco de clivagem (A) (B) (C) 0,5 µm 10 µm local de novos filamentos de actina, a qual depende de proteínas formina que nucleiam Figura 17-42 o anel contrátil. (A) a formação de arranjos paralelos de filamentos de actina lineares e não ramificados (dis- tração do sulco de clivagem em uma célula em divisão. (B) Uma micrografia eletrônica cutido no Capítulo 16). Após a anáfase, os arranjos sobrepostos de filamentos de actina e da borda, crescendo para dentro, de um miosina II se contraem para gerar a força que divide o citoplasma em dois. Uma vez ini- sulco de clivagem de uma célula animal ciada a contração, o anel exerce uma força suficientemente grande capaz de dobrar uma em divisão. (C) Micrografias de fluores- fina agulha de vidro. À medida que anel se comprime, mantém a mesma espessura, cência de uma ameba em divisão corada sugerindo que seu volume total e número de filamentos que contém diminuem cons- para actina (vermelho) e miosina (verde). Enquanto toda a miosina visível se redis- tantemente. Além disso, diferentemente da actina presente nos músculos, os filamentos tribuiu para anel contrátil, somente uma de actina no anel são altamente dinâmicos, e seu arranjo muda continuamente durante parte da actina o fez; o resto permanece a citocinese. no córtex das células-filhas nascentes. (B, anel contrátil é inteiramente desfeito quando a clivagem termina, uma vez que a de H.W. Beams e R.G. Kessel, Am. Sci. 64:279-290, 1976. Com permissão de membrana plasmática do sulco de clivagem se estreita para formar corpo mediano. Sigma Xi; C, cortesia de Yoshio Fukui.) corpo mediano subsiste como uma corrente entre as duas células-filhas e contém os res- tos do fuso central, uma grande estrutura proteica derivada dos microtúbulos interpolares antiparalelos da zona média do fuso, firmemente empacotados em conjunto dentro de um material denso de matriz (Figura 17-43). Após as células-filhas se separarem comple- tamente, alguns dos componentes do corpo mediano residual geralmente permanecem do lado interno da membrana plasmática de cada célula, onde podem servir de ponto de referência no córtex e ajudar a orientar fuso na divisão celular subsequente. A ativação local da RhoA desencadeia a formação e a contração do anel contrátil A RhoA, uma pequena GTPase da superfamília Ras (ver Tabela 15-5), controla a forma- ção e o funcionamento do anel contrátil no sítio de clivagem. A RhoA é ativada no córtex celular no futuro sítio de divisão, onde promove a formação de filamentos de actina, a associação da miosina II e a contração do anel. Ela estimula a formação de filamentos de actina pela ativação de forminas, e promove a associação e as contrações da miosina II pela ativação de múltiplas proteínas-cinase, incluindo a cinase ativada por Rho Rock (Figura 17-44). Essas cinases fosforilam a cadeia leve da miosina reguladora, uma su- bunidade da miosina II, estimulando dessa forma a formação do filamento bipolar da miosina II e atividade motora. Acredita-se que RhoA seja ativada pelo fator de troca de nucleotídeo guanina (RhoGEF), que é encontrada no córtex da célula no local da divisão futura e estimula a liberação de GDP e ligação do GTP ao RhoA (ver Figura 17-44). Sabe-se pouco sobre como o RhoGEF está localizado ou é ativado no sítio de divisão, embora os microtúbulos do fuso da anáfase pareçam estar envolvidos, como discutiremos a seguir. Os microtúbulos do fuso mitótico determinam plano de divisão da célula animal problema central da citocinese é como garantir que a divisão ocorra na hora certa e no lugar certo. A citocinese deve ocorrer somente após os dois conjuntos de cromos-998 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-43 o corpo mediano. (A) Uma micrografia eletrônica de varre- dura de uma célula animal cultivada em divisão; corpo mediano ainda une as duas células-filhas. (B) Uma micrografia eletrônica convencional do corpo media- no de uma célula animal em divisão. A clivagem está quase completa, porém as células-filhas permanecem ligadas por esse fino filamento de citoplasma, contendo restos do fuso central. (A, cortesia de Guenter Albrecht-Buehler; cortesia de J.M. Mullins.) (A) 10 µm Região de microtúbulos interpolares interdigitados no corpo mediano CÉLULA A CÉLULA B RhoA inativa GDP RhoGEF RhoGAP (B) GTP Microtúbulos interpolares Material denso da matriz Membrana plasmática remanescentes do fuso central 1 RhoA ativa Formina Cinases Rho-ativas somos terem sido totalmente segregados um do outro, e o sítio de divisão deve ser po- (incluindo Rock) sicionado entre os dois conjuntos de cromossomos-filhos, assegurando, com isso, que cada célula-filha receba um conjunto completo. A escolha do momento e o posicio- namento correto da citocinese em células animais ocorrem por meio de mecanismos Miosina fosfatase que dependem do fuso mitótico. Durante a anáfase, fuso gera sinais que iniciam a formação do sulco em uma posição a meio caminho entre os polos do fuso, assegu- Miosina reguladora rando, desse modo, que a divisão ocorra entre os dois conjuntos de cromossomos se- da fosforilação da parados. Como esses sinais se originam no fuso da anáfase, esse mecanismo também cadeia-leve contribui para a escolha do momento correto da citocinese no final da mitose. A citoci- nese também ocorre na hora correta, porque a desfosforilação de substratos das Cdks, Formação do filamento de actina Ativação da miosina II que depende da degradação de ciclinas na metáfase e na anáfase, inicia a citocinese. Descreveremos agora esses mecanismos reguladores em maior detalhe, com ênfase na citocinese em células animais. Formação e contração do Os estudos com os óvulos fertilizados de invertebrados marinhos revelaram, pela anel de actina-miosina primeira vez, a importância dos microtúbulos do fuso na determinação da disposição do Figura 17-44 Regulação do anel contrátil anel contrátil. Após a fertilização, esses embriões se dividem rapidamente, sem períodos pela GTPase RhoA. Como outra GTPase da intervenientes de crescimento. Dessa maneira, OVO original é progressivamente dividi- família Rho, RhoA é ativada pela proteína Rho- do em células cada vez menores. Como citoplasma é transparente, fuso pode ser ob- GEF e inativada por uma proteína de ativação servado em tempo real com um microscópio. Se, no início da anáfase, o fuso for puxado Rho GTPase (RhoGAP). A forma ativa (ligada a GTP) da RhoA é orientada no futuro sítio de cli- com força para uma nova posição com uma fina agulha de vidro, sulco de clivagem in- vagem. Ao se ligar a forminas, a RhoA ativada cipiente desaparece, e um novo se desenvolve de acordo com novo sítio do fuso subs- promove a formação de filamentos de actina tanciando a ideia de que sinais gerados pelo fuso induzem a formação local do sulco. no anel contrátil. Ao ativar proteínas-cinase ati- Como 0 fuso mitótico especifica 0 sítio de divisão? Três mecanismos gerais têm vadas por RhoA, como a Rock, estimula a for- mação e a atividade de filamentos de miosina sido propostos, e a maioria das células parece empregar uma combinação desses me- II, promovendo, assim, a contração do anel. canismos (Figura 17-45). 0 primeiro é chamado de modelo de estimulação astral, noCAPÍTULO 17 Ciclo celular 999 Figura 17-45 Três modelos atuais de como os microtúbulos do fuso da anáfase geram sinais que influenciam posicionamento do anel contrá- til. Nenhum modelo único explica todas as observações, e posicionamento do sulco é provavelmente determinado pela combi- nação desses mecanismos, com a impor- Modelo de estimulação astral Modelo de estimulação do fuso central Modelo de relaxamento astral tância de diferentes mecanismos variando em diferentes organismos. Ver texto para mais detalhes. qual microtúbulos astrais carregam sinais indutores de sulco, que são, de alguma forma, concentrados em um anel no córtex celular, a meio caminho entre os polos do fuso. As evidências para esse modelo provêm de experimentos engenhosos com células embrio- nárias grandes, que demonstram que um sulco de clivagem se forma a meio caminho entre dois ásteres, mesmo quando os dois centrossomos que nucleiam os ásteres não estão conectados um ao outro por um fuso mitótico (Figura 17-46). Uma segunda possibilidade, chamada de modelo de estimulação do fuso central, é que a zona média do fuso, ou fuso central, gera um sinal indutor do sulco que especi- fica o sítio de formação do sulco no córtex celular (ver Figura 17-45). Os microtúbulos interpolares que se sobrepõem no fuso central se associam a numerosas proteínas de sinalização, incluindo proteínas que podem estimular a RhoA (Figura 17-47). Defeitos no funcionamento dessas proteínas (p. ex., em mutantes de Drosophila) resultam no in- sucesso da citocinese. Um terceiro modelo propõe que, em alguns tipos celulares, os microtúbulos astrais promovem o relaxamento local de feixes de actina-miosina no córtex celular. De acordo com esse modelo de relaxamento astral, o relaxamento cortical é mínimo na placa equa- torial do fuso, promovendo, desse modo, a contração cortical naquele sítio (ver Figura 17-45). Nos embriões jovens de Caenorhabditis elegans, por exemplo, tratamentos que resultam na perda dos microtúbulos astrais levam ao aumento da atividade contrátil por todo córtex celular, consistente com esse modelo. Em alguns tipos celulares, o sítio de formação do anel é escolhido antes da mitose. Em leveduras de brotamento, por exemplo, um anel de proteínas chamadas de septinas se agrupa no final de G₁ no futuro sítio de divisão. Acredita-se que as septinas formem uma estrutura sobre a qual outros componentes do anel contrátil, incluindo a miosina II, associam-se. Em células vegetais, uma faixa organizada de microtúbulos e filamentos de actina, denominada faixa da pré-prófase, forma-se pouco antes da mitose e marca o sítio onde a parede celular será formada e dividirá a célula em duas, como discutiremos a seguir. Figura 17-46 Experimento demons- trando a influência da posição dos ásteres dos microtúbulos sobre sub- Cromossomos Centrossomo Pérola de vidro sequente plano de clivagem em uma célula-ovo grande. Se fuso mitótico é mecanicamente empurrado para um lado da célula com uma pérola de vidro, a formação do sulco na membrana é in- completa, não ocorrendo no lado oposto da célula. Clivagens subsequentes ocorrem Célula-ovo em divisão Uma pérola de vidro Sulco em apenas um lado não somente na zona média de cada um empurrada na célula da célula, produzindo um dos dois fusos mitóticos subsequentes desloca fuso ovo binucleado (setas amarelas), mas também entre os dois ásteres adjacentes que não estão ligados por um fuso mitótico mas que, nesta célula anormal, compartilham mesmo citoplasma (setas vermelhas). Apa- rentemente, anel contrátil que produz sulco de clivagem nessas células sempre se forma na região a meio caminho entre os dois ásteres, sugerindo que os ásteres Ambos núcleos Clivagem ocorre entre ambos os centrossomos ligados por de alguma maneira alteram a região adja- entram em mitose fusos mitóticos e entre os dois centrossomos que estão cente do córtex celular, a fim de induzir a adjacentes, e quatro células-filhas são formadas formação do sulco.1000 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-47 Localização de regula- dores da citocinese no fuso central da célula humana. (A) No centro está uma cultura de células humanas no início da citocinese, mostrando as localizações de GTPase RhoA (vermelho) e uma proteína chamada Cyk4 (verde), que é uma das muitas proteínas reguladoras que formam complexos com as extremidades mais (+) sobrepostas, além de microtúbulos inter- polares. Acredita-se que essas proteínas gerem sinais que ajudam a controlar a atividade da RhoA no córtex celular. (B) Quando a mesma imagem tridimensional é vista em um plano de anel contrátil, como mostrado aqui, RhoA (vermelho) é vista como um anel abaixo da superfície (A) (B) celular, enquanto a proteína Cyc4 (verde) do fuso central está associada com feixes de microtúbulos espalhados por todo O fragmoplasto orienta a citocinese nas plantas superiores plano equatorial da célula. (Cortesia de Alisa Piekny e Michael Glotzer.) Na maioria das células animais, o movimento interno do sulco de clivagem depende de um aumento da área de superfície da membrana plasmática. material de membrana novo é adicionado à borda interna do sulco de clivagem, sendo em geral fornecido por pequenas vesículas de membrana que são transportadas em microtúbulos do aparelho de Golgi ao sulco. A deposição de membrana é particularmente importante à citocinese em células de plantas superiores. Essas células são circundadas por uma parede celular semirrígida. Em vez de um anel contrátil dividindo o citoplasma de fora para dentro, o citoplasma da célula vegetal é repartido de dentro para fora pela construção de uma nova parede celu- lar, chamada de placa celular, entre os dois núcleos-filhos (Figura 17-48). A formação da placa celular começa no final da anáfase e é orientada por uma estrutura denominada fragmoplasto, que contém microtúbulos derivados do fuso mitótico. As proteínas moto- ras transportam pequenas vesículas ao longo desses microtúbulos do aparelho de Golgi para o centro da célula. Essas vesículas, cheias de polissacarídeos e glicoproteínas neces- sárias à síntese da nova parede celular, fundem-se e formam uma estrutura em forma de disco delimitada por membrana, denominada placa celular inicial. A placa se expande para fora por meio da fusão de mais vesículas, até alcançar a membrana plasmática e a parede celular original, dividindo a célula em duas. Posteriormente, microfibrilas de celulose são depositadas dentro da matriz da placa celular, completando a formação da nova parede celular (Figura 17-49). 50 µm Figura 17-48 Citocinese em uma célula vegetal em telófase. Nesta micrografia óptica, a placa celular inicial (entre as duas setas) se formou em um plano perpendicular ao plano da página. Os microtúbulos do fuso estão corados com anticorpos marcados com ouro contra a tubulina, e DNA nos dois conjuntos de cromossomos- -filhos está corado com um corante fluorescente. Observe que não há microtúbulos astrais, pois não existem centrossomos em células de plantas superiores. (Cortesia de Andrew Bajer.)CAPÍTULO 17 Ciclo celular 1001 Faixa da pré-prófase dos microtúbulos Remanescentes dos microtúbulos Matriz cortical dos microtúbulos e filamentos de actina do fuso interpolares da interfase Placa de célula precoce Nova parede celular Vacúolo Parede celular mãe Vesículas derivadas Microtúbulos do Golgi fragmoplastos G2 Telófase Citocinese G1 Organelas delimitadas por membrana devem ser distribuídas Figura 17-49 Características especiais da citocinese em uma célula de planta entre as células-filhas durante a citocinese superior. plano de divisão é estabe- lecido antes da fase M por uma faixa de processo de mitose garante que cada célula-filha receba um complemento inteiro microtúbulos e filamentos de actina (a de cromossomos. Contudo, quando uma célula eucariótica se divide, cada célula-filha faixa da pré-prófase) no córtex celular. No também deve herdar todos os outros componentes celulares essenciais, incluindo as início da telófase, após os cromossomos organelas delimitadas por membrana. Como discutido no Capítulo 12, organelas como terem se segregado, uma nova parede celular começa a ser formada dentro mitocôndrias e cloroplastos não podem ser formadas de novo a partir de seus compo- da célula na região equatorial do fuso nentes individuais; elas podem se originar somente pelo crescimento e pela divisão de antigo. Os microtúbulos interpolares do organelas preexistentes. Similarmente, as células não podem formar um novo retículo fuso mitótico remanescente na telófase endoplasmático (RE), a menos que uma parte dele já esteja presente. formam fragmoplasto. As extremidades mais (+) desses microtúbulos não mais se Como, então, as várias organelas delimitadas por membrana são segregadas quan- sobrepõem, terminando no equador da do uma célula se divide? As organelas como mitocôndrias e cloroplastos normalmente célula. As vesículas derivadas do aparelho estão presentes em números suficientemente grandes para serem herdadas sem proble- de Golgi, cheias de material da parede ma se, em média, seu número aproximadamente dobrar a cada ciclo. O RE em células celular, são transportadas ao longo desses interfásicas é contínuo à membrana nuclear e se encontra organizado pelo citoesqueleto microtúbulos e se fundem, formando uma nova parede celular, que cresce para fora de microtúbulos. Após a entrada na fase M, a reorganização dos microtúbulos e a frag- até alcançar a membrana plasmática e a mentação do envelope nuclear liberam RE. Na maioria das células, RE permanece parede celular original. A membrana plas- em grande parte intacto, sendo dividido em dois durante a citocinese. aparelho de mática e a membrana que cerca a nova Golgi é reorganizado e fragmentado durante a mitose. Os fragmentos do aparelho de parede celular se fundem, separando as duas células-filhas. Golgi se associam aos polos do fuso e são, desse modo, distribuídos a polos opostos do fuso, garantindo que cada célula-filha herde os materiais necessários para reconstruir aparelho na telófase. Algumas células reposicionam seu fuso para se dividirem de forma assimétrica A maioria das células animais se divide simetricamente: anel contrátil se forma em vol- ta da região equatorial da célula-mãe, produzindo duas células-filhas de tamanho igual e com os mesmos componentes. Essa simetria resulta da disposição do fuso mitótico, que na maioria dos casos tende a se centralizar no citoplasma. Os microtúbulos astrais e as proteínas motoras que empurram ou puxam esses microtúbulos contribuem para 0 processo de centralização. Contudo, existem muitos exemplos no desenvolvimento, quando as células se di- videm para produzir duas células que diferem quanto ao tamanho, ao conteúdo citoplasmático herdado ou a ambos os aspectos. Normalmente, as duas célu- las-filhas diferentes são destinadas a se desenvolverem ao longo de diferentes vias. A fim de criar células-filhas com diferentes destinos dessa maneira, a célula-mãe deve primeiro segregar certos componentes (denominados determinantes de destino celular) para um1002 PARTE IV Organização interna da célula lado da célula e, então, posicionar o plano de divisão de forma que a célula-filha apro- priada herde esses componentes (Figura 17-50). Para posicionar plano de divisão de forma assimétrica, o fuso tem de ser movido de maneira controlada dentro da célula em divisão. Parece plausível que mudanças nas regiões locais do córtex celular orientem tais movimentos do fuso, e que proteínas motoras lá localizadas puxem um dos polos do fuso, via microtúbulos astrais, para a região apropriada. As análises genéticas em C. elegans e Drosophila identificaram algumas das proteínas necessárias para tais divisões assimétri- cas, e algumas dessas proteínas parecem ter papéis similares nos vertebrados. A mitose pode ocorrer sem citocinese Embora a divisão nuclear normalmente seja seguida pela divisão citoplasmática, exis- tem exceções. Algumas células sofrem múltiplos ciclos de divisão nuclear sem divisões citoplasmáticas intervenientes. No embrião jovem de Drosophila, por exemplo, os pri- meiros 13 ciclos de divisão nuclear ocorrem sem divisão citoplasmática, resultando na formação de uma única grande célula que contêm vários milhares de núcleos, arranja- dos em uma monocamada próxima à superfície. Uma célula na qual múltiplos núcleos compartilham o mesmo citoplasma é chamada de sincício. Esse arranjo acelera imensa- mente o desenvolvimento inicial, na medida em que as células não têm de gastar tempo passando por todas as etapas da citocinese a cada divisão. Após essas rápidas divisões nucleares, membranas são criadas em volta de cada núcleo em um ciclo de citocinese coordenada denominado celularização. A membrana plasmática se estende para dentro e, com a ajuda de um anel de actina-miosina, se contrai com força para envolver cada núcleo (Figura 17-51). A divisão nuclear sem citocinese também ocorre em alguns tipos de células de mamíferos. Os megacariócitos, que produzem as plaquetas sanguíneas, e alguns hepa- tócitos e células musculares cardíacas, por exemplo, tornam-se multinucleados dessa maneira. Após a citocinese, a maioria das células entra em na qual as Cdks estão predo- minantemente inativas. Encerraremos esta seção discutindo como esse estado é atingi- Figura 17-50 Uma divisão celular as- do no final da fase M. simétrica segregando componentes citoplasmáticos somente para uma célula-filha. Estas micrografias ópticas A fase é um estado estável de inatividade das Cdks ilustram a segregação assimétrica con- trolada de componentes citoplasmáticos Um evento regulador-chave no final da fase M é a inativação das Cdks, que é prima- específicos para uma célula-filha durante a primeira divisão de um óvulo fertilizado riamente promovido pela degradação de ciclinas dependentes do APC/C. Como ante- do nematódeo C. elegans. fertili- riormente descrito, a inativação das Cdks no final da fase M tem muitas funções: de- zado está mostrado à esquerda e as duas sencadeia os eventos do final da mitose, promove a citocinese e possibilita a síntese de células-filhas à direita. As células na parte complexos pré-replicativos nas origens de replicação do DNA. Ela também proporciona superior foram coradas com um corante um mecanismo de recomposição do sistema de controle do ciclo celular a um estado fluorescente azul que se liga ao DNA, mos- trando núcleo (e os corpúsculos polares); de inatividade das Cdks, à medida que a célula se prepara para entrar em um novo ciclo elas são visualizadas tanto por microscopia de contraste de interferência diferencial como por microscopia de fluorescência. As células na parte inferior são as mesmas células coradas com um anticorpo contra grânulos P e visualizadas por microscopia de fluorescência. Esses pequenos grânulos são compostos por RNA e proteínas e determinam quais células se tornarão as células germinativas. Eles se distribuem ao acaso por todo citoplasma do óvulo não fertilizado (não mostrado), mas ficam res- tritos ao polo posterior do óvulo fertiliza- do. plano de clivagem é orientado a fim de assegurar que, quando se dividir, somente a célula-filha posterior receba os grânulos P. mesmo processo de segrega- ção é repetido em várias divisões celulares subsequentes, de forma que os grânulos P estarão presentes apenas nas células que irão dar origem a óvulos e espermatozoi- Anterior Posterior des. (Cortesia de Susan Strome.) 40 µmCAPÍTULO 17 Ciclo celular 1003 DIVISÕES MIGRAÇÃO A DELIMITAÇÃO CELULARIZAÇÃO NUCLEARES NUCLEAR DAS CÉLULAS É FINALIZADA PARA o INICIADA CÓRTEX Ovo fertilizado Vários núcleos Cutícula Membrana (A) no sincício plasmática Figura 17-51 Mitose sem citocinese no embrião jovem de Drosophila. (A) As primeiras 13 divisões nucleares ocorrem sincronicamente e sem divisão citoplasmática, criando um grande sincício. A maioria dos núcleos migra para córtex, e a membrana plasmática se estende para dentro e se contrai com força, envolvendo cada núcleo e formando células individuais, em um processo chamado de celularização. (B) Micrografia de fluorescência de múltiplos fusos mitóticos em um embrião de Drosophila antes da celularização. Os microtúbulos estão corados em verde e os centrômeros em vermelho. Observe que todos os núcleos entram no ciclo sincronicamente; aqui, eles estão todos em metáfase, com cromossomos não marcados vistos como uma faixa escura na placa equatorial do fuso. cortesia de Kristina Yu e William Sullivan.) celular. Na maioria das células, esse estado de inatividade das Cdks gera uma fase de intervalo durante a qual a célula cresce e monitora seu ambiente antes de se compro- meter com uma nova divisão. Em embriões jovens de animais, a inativação da M-Cdk no final da mitose se deve quase que inteiramente à ação do Cdc20-APC/C, discutida anteriormente. Recorde-se, contudo, que a M-Cdk estimula a atividade do Cdc20-APC/C. Como consequência, a (B) 10 µm destruição da M-ciclina no final da mitose leva prontamente à inativação de toda a ativi- dade do APC/C em uma célula embrionária. Essa inativação do APC/C imediatamente após a mitose é especialmente útil em ciclos celulares embrionários rápidos, uma vez que permite à célula rapidamente começar a acumular M-ciclina nova para o próximo ciclo (Figura 17-52A). rápido acúmulo de ciclina imediatamente após a mitose não é proveitoso, po- rém, é necessário para células nas quais a fase G₁ permite o controle de entrada no próxi- mo ciclo celular. Essas células empregam vários mecanismos para impedir a reativação das Cdks após a mitose. Um mecanismo usa outra proteína de ativação APC/C chamada mencionada anteriormente como fortemente relacionada com Cdc20 (ver Tabela 17-2). Embora tanto a Cdh1 como a Cdc20 se liguem e ativem o APC/C, elas diferem em um ponto importante. Enquanto complexo do Cdc20-APC/C é ativado pela M-Cdk, complexo do Cdh1-APC/C é inibido por ela, por fosforilação direta da Cdh1. resultado dessa relação é que a atividade do Cdh1-APC/C aumenta no final da mitose após com- plexo do Cdc20-APC/C ter iniciado a destruição da M-ciclina. Portanto, a destruição da M-ciclina continua após a mitose: embora a atividade do Cdc20-APC/C tenha decaído, a (A) Células embrionárias sem fase G1 atividade do alta (Figura 17-52B). Atividade Cdc20-APC/C Um segundo mecanismo que suprime a atividade das Cdks em G₁ depende do aumento da produção de CKIs, as proteínas inibidoras de Cdk anteriormente discuti- Nível de M-ciclina das. As células de leveduras de brotamento, nas quais esse mecanismo é mais bem com- preendido, contêm uma proteína CKI chamada de que se liga e inativa a M-Cdk no final da mitose e de (ver Tabela 17-2). Como a a Sicl é inibida pela M-Cdk, M S (B) Células com fase Atividade Cdc-20 APC/C Figura 17-52 Estabelecimento da fase G₁ pela inibição estável das Cdks após a mitose. (A) Em ciclos celulares de embriões jovens, a atividade do Cdc20-APC/C aumenta no final da metáfase, provocando a des- Nível de Atividade de M-ciclina Cdh1-APC/C truição da M-ciclina. Como a atividade da M-Cdk estimula a atividade do Cdc20-APC/C, a perda da M-ciclina mantém nível leva à inativação do APC/C após a mitose, permitindo que as M-ciclinas comecem novamente a se acumular. (B) de M-ciclina Em células que apresentam uma fase a queda na atividade da M-Cdk no final da mitose leva à ativação do baixo em Cdh1-APC/C (assim como acúmulo de proteínas inibidoras das Cdks; não mostrado). Isso garante a supressão contínua da atividade das Cdks após a mitose, necessária a uma fase M1004 PARTE IV Organização interna da célula que fosforila a durante a mitose e, com isso, promove sua ubiquitinação por SCF. Assim, a Sicl e a M-Cdk, como a e a M-Cdk, inibem uma à outra. Como resultado, decréscimo na atividade da M-Cdk que ocorre no final da mitose faz a proteína Sicl se acumular, e essa CKI ajuda a manter a atividade da M-Cdk baixa após a mitose. Uma proteína CKI chamada de p27 (ver Figura 17-14) pode desempenhar funções similares em células animais. Na maioria das células, o decréscimo da transcrição dos genes M-ciclina também inativa as M-Cdks no final da mitose. Na levedura de brotamento, por exemplo, a M-Cdk promove a expressão desses genes, resultando em um ciclo de retroalimentação positiva. Esse circuito é inativado quando as células saem da mitose: a inativação da M-Cdk por Cdh1 e Sicl leva à diminuição da transcrição do gene da M-ciclina e, assim, à diminuição da síntese de M-ciclina. As proteínas de regulação gênicas que promovem a expressão de e S-ciclinas também são inibidas durante Assim, a ativação do Cdh1-APC/C, o acúmulo de CKIs e a diminuição da expressão dos genes de ciclinas atuam em conjunto para garantir que o início da fase G₁ seja um período em que essencialmente toda a atividade das Cdks está suprimida. Como muitos outros aspectos do controle do ciclo celular, uso de mecanismos múltiplos reguladores permite que o sistema opere com razoável eficiência, mesmo se um dos mecanismos falhar. Então, como a célula escapa desse estado estável de para iniciar um novo ciclo celular? A resposta é que a atividade G₁/S-Cdk, que aumenta em G₁ tardia, libera todos os mecanismos de travagem que suprimem a atividade de Cdk, como descreveremos mais tarde, na última seção deste capítulo. Resumo Após a mitose concluir a formação de um par de núcleos-filhos, a citocinese finaliza ciclo celular, dividindo a própria célula. A citocinese depende de um anel de filamentos de actina e miosina que se contrai no final da mitose em um sítio a meio caminho entre os cromossomos segregados. Em células animais, o posicionamento do anel contrátil é deter- minado por sinais liberados pelos microtúbulos do fuso da anáfase. A desfosforilação de alvos das Cdks, resultante da inativação das Cdks na anáfase, desencadeia a citocinese no momento correto após a anáfase. Depois da citocinese, a célula entra em um estado estável de de baixa atividade das Cdks, onde aguarda por sinais para entrar em um novo ciclo celular. MEIOSE A maioria dos organismos eucarióticos se reproduz de forma sexuada: os genomas de dois pais se misturam para gerar uma descendência geneticamente distinta de ambos os progenitores. Em geral, as células desses organismos são diploides, isto é, contêm duas cópias ligeiramente diferentes, ou homólogas, de cada cromossomo, uma de cada proge- nitor. A reprodução sexuada depende de um processo especializado de divisão nuclear chamado de meiose, que produz células haploides que portam somente uma única cópia de cada cromossomo. Em muitos organismos, as células haploides se diferenciam em células reprodutivas especializadas chamadas de gametas óvulos e espermatozoides na maioria das espécies. Nessas espécies, ciclo reprodutivo termina quando um es- permatozoide e um óvulo se fundem para formar um zigoto diploide, que tem potencial de formar um novo indivíduo. Nesta seção, consideraremos os mecanismos básicos e a regulação da meiose, enfatizando como eles se comparam àqueles da mitose. A meiose inclui dois ciclos de segregação cromossômica A meiose reduz o número de cromossomos pela metade usando muitas das mesmas maquinarias moleculares e controle dos sistemas que operam a mitose. Como ciclo celular mitótico, a célula começa programa pela duplicação dos cromossomos na fase meiótica S, resultando em pares de cromátides-irmãs que são finamente ligadas ao longo de todo seu comprimento por complexos de coesina. Ao contrário da mitose, contudo, dois ciclos sucessivos de segregação cromossômica ocorrem (Figura 17-53). A primei-CAPÍTULO 17 Ciclo celular 1005 ra dessas divisões (meiose I) resolve problema, exclusivo da meiose, de segregar os Figura 17-53 Comparação da meiose homólogos. Os homólogos maternal e paternal duplicados emparelham-se um ao lado e da mitose. Para maior clareza, somente um par de cromossomos (homólogos) é do outro e tornam-se fisicamente ligados por um processo genético de recombinação. mostrado. (A) A meiose é uma forma de Esses pares de homólogos, cada um contendo um par de cromátides-irmãs, em segui- divisão nuclear na qual um único ciclo da alinham-se no primeiro fuso meiótico. Na primeira anáfase meiótica, os homólogos de duplicação dos cromossomos (fase duplicados em vez de cromátides-irmãs são separados e segregados em dois núcleos-fi- S meiótica) é seguido por dois ciclos lhos. Apenas na segunda divisão (meiose II), que ocorre sem mais replicação do DNA, as de segregação dos cromossomos. Os homólogos duplicados, cada um consis- cromátides-irmãs são separadas e segregadas (como na mitose) para produzir núcleos- tindo de cromátides-irmãs firmemente -filhos haploides. Desse modo, cada um dos núcleos diploides que entra em meiose pro- ligadas, emparelham-se e são segregados duz quatro núcleos haploides, cada um dos quais contém ou a cópia materna ou paterna em diferentes núcleos-filhos na meiose de cada cromossomo, mas não ambas (Animação 17.7). I; cromátides-irmãs são segregadas na meiose II. Como indicado pela formação de cromossomos que são em parte ver- (A) MEIOSE (B) melho e em parte cinza, o pareamento MITOSE homólogo na meiose leva à recombinação Homólogo genética durante a meiose Cada célula FASE S MEIÓTICA paternal diploide que entra em meiose, portanto, Homólogo produz quatro núcleos haploides geneti- maternal camente diferentes, que são distribuídos por citocinese em células haploides que se REPLICAÇÃO DO DNA REPLICAÇÃO DO DNA diferenciam em gametas. (B) Na mitose, ao contrário, os homólogos não formam res e as cromátides-irmãs são segregadas durante a divisão única. Assim, cada célula diploide que se divide por mitose produz dois núcleos-filhos diploides geneticamen- PAREAMENTO E RECOMBINAÇÃO te idênticos, que são distribuídos por cito- DE HOMÓLOGOS DUPLICADOS cinese em um par de células-filhas. PARES HOMÓLOGOS SE ALINHAM NO FUSO MEIOSE CROMOSSOMOS DUPLICADOS SEGREGAÇÃO DE HOMÓLOGOS SE ALINHAM INDIVIDUALMENTE NA ANÁFASE NO FUSO SEGREGAÇÃO DE SEGREGAÇÃO DE NA ANÁFASE NA ANÁFASE MEIOSE = Células-filhas haploides Células-filhas diploides1006 PARTE IV Organização interna da célula Par de homólogos duplicados durante a prófase meiótica Durante a mitose em muitos organismos, os cromossomos homólogos comportam-se independentemente uns dos outros. Durante a meiose I, contudo, é crucial que cada ho- mólogo se reconheça e se associe fisicamente com objetivo de que os homólogos ma- ternais e paternais sejam biorientados no primeiro fuso meiótico. Mecanismos especiais medeiam essas interações. A justaposição gradual de homólogos ocorre durante período prolongado cha- mado de prófase meiótica (ou prófase I), que pode levar horas em leveduras, dias em camundongos e semanas em plantas superiores. Da mesma forma que na mitose, os cromossomos duplicados na prófase da meiose aparecem como estruturas delgadas longas, nas quais as cromátides-irmãs estão unidas firmemente e tão próximas que parecem apenas uma. É durante a prófase I inicial que os homólogos começam a se associar ao longo de seu comprimento em um processo chamado pareamento, o qual, em alguns organismos ao menos, começa com interações entre sequências de DNA complementar (chamadas sítios de pareamento) nos dois homólogos. Com o avanço da prófase, os homólogos tornam-se mais intimamente justapostos, formando uma es- trutura de quatro cromátides chamada de bivalente (Figura 17-54A). Em muitas espé- cies, pares homólogos são, então, entrelaçadas por recombinação homóloga: quebras na fita dupla do DNA são formadas em várias partes em cada cromátide-irmã, resul- tando em um grande número de eventos de recombinação de DNA entre os homólo- gos (como descrito no Capítulo 5). Alguns desses eventos levam a trocas recíprocas de DNA denominadas entrecruzamentos, onde ocorre a recombinação do DNA de uma cromátide para que este fique contínuo ao DNA da cromátide homóloga (Figura 17- 54B; ver também Figura 5-54). O pareamento dos homólogos culmina na formação de um complexo sinaptonêmico Os homólogos pareados são justapostos, com seus eixos estruturais (centro axial) dis- tantes cerca de 400 nm, por um mecanismo que depende, na maioria das espécies, das quebras na fita dupla de DNA que ocorrem nas cromátides-irmãs. Por que alinhar os eixos? Uma possibilidade é que a grande máquina proteica, chamada de complexo de re- combinação, que se organiza sobre uma quebra da fita dupla em uma cromátide, liga-se à sequência de DNA correspondente no homólogo próximo e ajuda a aproximar seu par. Esse assim chamado alinhamento pré-sináptico dos homólogos é seguido por sinapse, na qual o centro axial de um homólogo torna-se intimamente ligado ao centro axial de seu par por um arranjo hermeticamente agrupado de filamentos transversos para criar um complexo sinaptonêmico, qual atravessa o espaço, agora de 100 nm, entre os ho- mólogos (Figura 17-55). Embora a recombinação inicie antes da formação do complexo sinaptonêmico, as etapas finais ocorrem enquanto o DNA é mantido no complexo. Cromossomo Cromossomo parental maternal As modificações morfológicas que ocorrem durante pareamento são a base replicado replicado para dividir a prófase meiótica em cinco estágios sequenciais leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno e diacinese (Figura 17-56). A prófase começa com o leptoteno, quando homólogos se condensam e pareiam, e inicia a recombinação genética. No zigoteno, 0 complexo sinaptonêmico começa a formar-se em locais onde os homólo- gos estão associados intimamente e os eventos de recombinação estão ocorrendo. No paquiteno, o processo de formação está completo e os homólogos estão unidos por Centrômero sinapses ao longo de todo seu comprimento (ver Figura 9-35). estágio de paquiteno Figura 17-54 Pareamento homólogo e recombinação. (A) A estrutura formada por dois homólogos dupli- Cromátides- cados alinhados de forma muito próxima é chamada de bivalente. Como na mitose, as cromátides-irmãs estão irmãs firmemente conectadas ao longo de todo seu comprimento, bem como pelos seus centrômeros. Nesse estágio, os homólogos normalmente estão unidos por um complexo proteico chamado de complexo sinaptonêmico (não mostrado; ver Figura 17-55). (B) Um estágio tardio bivalente no qual um único evento de recombinação ocorreu entre cromátides não irmãs. Somente quando complexo sinaptonêmico se desfaz e os homólogos pareados (A) separam-se um pouco no final da prófase I, como é mostrado, é possível visualizar o ponto de recombinação Bivalente (B) Quiasma microscopicamente como uma tênue conexão, chamada de quiasma, entre os homólogos.CAPÍTULO 17 Ciclo celular 1007 Figura 17-55 Representação esque- mática simplificada de um complexo sinaptonêmico. Cada homólogo está Filamentos organizado em torno de um núcleo axial transversais de proteínas, e os complexos sinaptonê- micos se formam quando esses eixos ho- mólogos são ligados por fios transversais 100 nm em forma de filamentos. núcleo axial Núcleos de cada homólogo também interage com axiais dos homólogos os complexos coesina que seguram as cromátides-irmãs juntas (ver Figura 9-35). Coesina (Modificada de K. Nasmyth, Annu. Rev. Genet. 35:673-745, 2001.) Alças de cromatina das cromátides-irmãs de um homólogo pode persistir por dias ou mais tempo, até a separação iniciar no diploteno com a de- sorganização dos complexos sinaptonêmicos e a concomitante condensação e o en- curtamento dos cromossomos. É somente nesse estágio, depois dos complexos terem se desfeito, que os eventos individuais de recombinação por entrecruzamento entre cromátides não irmãs podem ser vistos como conexões inter-homólogas chamadas de quiasmas, que agora desempenham um papel crucial na manutenção dos homólogos juntos de forma compacta (Figura 17-57). Os homólogos agora estão prontos para ini- ciar o processo de segregação. LEPTOTENO PAQUITENO Cromátide 1 Cromátides- -irmãs Formação Dissociação paternas do complexo do complexo Cromátide 2 sinaptonêmico sinaptonêmico Cromátide 3 Cromátides- -irmãs maternas Cromátide 4 INTERFASE ZIGOTENO DIPLOTENO (A) SEGUIDO POR DIACINESE (B) 0,1 µm (C) (D) 5 µm Figura 17-56 Sinapse e separação dos homólogos durante os diferentes estágios da prófase I. (A) Um único bivalente é representado de forma es- quemática. Em leptoteno, as duas cromátides-irmãs ligam-se, e suas alças de cromatina se estendem juntas para fora a partir de um centro axial comum. A formação do complexo sinaptonêmico começa no zigoteno inicial e é completada no paquíteno. complexo se desfaz no diploteno. (B) Uma eletromicrografia de um complexo sinaptonêmico de uma célula meiótica em paquiteno em uma flor de lírio. e D) As fotomicrografias de imunofluorescência de células em prófase do fungo Sordaria. Bivalentes parcialmente em sinapse no zigoteno são mostrados em (C) e bivalentes totalmente em sinapse são mostrados em (D). Setas vermelhas em (C) apontam para as regiões onde a sinapse ainda está incompleta. (B, cortesia de Brian Wells; e D, de A. Storlazzi et al., Genes Dev. 17:2675-2687, 2003. Com permissão de Cold Spring Harbor Laboratory Press.)1008 PARTE IV Organização interna da célula Figura 17-57 Um bivalente com três quiasmas resultantes de três eventos de recombinação. (A) Foto- micrografia de luz de um bivalente de gafanhoto. (B) mostrando arranjo da recombinação por entre- cruzamento em (A). Observe que a cromátide 1 foi submetida a uma troca com a cromátide 3, e a cromátide 2 sofreu trocas com as cromátides 3 e 4. Observe também como a combinação do quiasma e a fixação dos braços das cromátides-irmãs umas às outras (mediada por complexos coesina) mantém os dois homólogos juntos após complexo sinaptonêmico ser desfeito; se tanto o quiasma ou a coesão das cromátides-irmãs não se formam, os homólogos iriam divergir nesta fase e não seriam segregados adequadamente na meiose I. (A, cortesia de Bernard John.) A segregação homóloga depende de muitas características únicas 4 da meiose 3 2 Uma diferença fundamental entre meiose I e mitose (e meiose II) é que, na meiose I, em (A) (B) vez das cromátides-irmãs, são os homólogos que se separam e são segregados (ver Figu- ra 17-53). Essa diferença depende de três características da meiose I que a distinguem da mitose (Figura 17-58). Primeiro, ambos os cinetocoros-irmãos em um homólogo devem se ligar de for- ma estável ao mesmo polo do fuso. Esse tipo de ligação normalmente é evitada durante a mitose (ver Figura 17-33). Contudo, na meiose I, os dois cinetocoros-filhos são fu- sionados em uma única unidade de ligação a microtúbulos, a qual se liga a um polo (ver Figura 17-58A). A fusão dos é alcançada por um complexo de proteínas que está localizado nos cinetocoros na meiose I, mas não se sabe em deta- lhes como essas proteínas atuam. Elas são removidas dos cinetocoros após a meiose I, portanto, na meiose II, os pares das cromátides-irmãs podem ser biorientados no fuso como elas são na mitose. (A) MEIOSE Microtúbulos do cinetocoro + Cinetocoro Coesina Coesina Núcleos-filhos haploides Centrômero Cinetocoro Cromátide + METÁFASE ANÁFASE METÁFASE II ANÁFASE II TELÓFASE II (B) MITOSE Coesina Cromátide Núcleos-filhos diploides Centrômero + Microtúbulos do cinetocoro Cinetocoro METÁFASE ANÁFASE TELÓFASE Figura 17-58 Comparação do comportamento do cromossomo em meiose I, meiose e mitose. Os cromossomos comportam-se de modo similar na mitose e na meiose II, mas diferente na meiose I. (A) Na meiose I, dois cinetocoros-irmãos estão localizados lado a lado em cada homólogo e ligados a mi- crotúbulos do mesmo polo do fuso. A clivagem proteolítica da coesina ao longo dos braços das cromátides-irmãs separa os braços e finaliza a recombinação, permitindo que os homólogos duplicados se separem na anáfase I, enquanto a coesina residual nos centrômeros mantém juntas as irmãs. A clivagem da coesina centromérica permite às cromátides-irmãs se separarem na anáfase II. (B) Na mitose, ao contrário, dois cinetocoros-irmãos ligam-se aos microtúbulos de dife- rentes polos do fuso, e as duas cromátides-irmãs se dissociam no início da anáfase e segregam em núcleos-filhosCAPÍTULO 17 Ciclo celular 1009 Segundo, a recombinação por entrecruzamento gera uma forte ligação física entre homólogos, permitindo sua biorientação na placa equatorial do fuso, bem como a coesão entre cromátides-irmãs é importante para sua biorientação na mitose (e meiose II). Os entrecruzamentos mantêm unidos os pares de homólogos somente porque os braços das cromátides-irmãs estão conectados pela coesão de cromátides-irmãs (ver Figura 17-58A). Terceiro, a coesão é removida na anáfase I apenas dos braços dos cromossomos e não das regiões perto dos centrômeros, onde os cinetocoros estão localizados. A perda da coesão nos braços desencadeia a separação homóloga no início da anáfase I. Esse processo depende da ativação de APC/C, que leva à degradação da securina, ativação da separase e clivagem da coesina ao longo dos braços (ver Figura 17-38). As coesinas perto dos centrômeros são protegidas das separases na meiose I por uma proteína associada ao cinetocoro, chamada shugoshin (do japonês, "espírito guar- dião"). A shugoshin age recrutando uma proteína-fosfatase que remove fosfatos das coe- sinas centroméricas. A fosforilação da coesina é normalmente necessária para a separase clivar a coesina; assim, a remoção dessa fosforilação perto do centrômero, previne a cli- vagem da coesina. Portanto, os pares de cromátides-irmãs permanecem ligados durante a meiose I, possibilitando sua biorientação correta no fuso na meiose II. A shugoshin é inativada após a meiose I. No início da anáfase II, a ativação de APC/C desencadeia a clivagem da coesina centromérica e a separação das cromátides-irmãs assim como na mitose. Seguindo a anáfase II, envelopes nucleares se formam em torno dos cromosso- mos para produzir quatro núcleos haploides, após que, a citocinese e outros processos de diferenciação levam à produção de gametas haploides. A recombinação por entrecruzamento é altamente regulada A recombinação por entrecruzamento tem duas funções distintas na meiose: ele aju- da a manter os homólogos juntos até que sejam segregados de forma adequada para as duas células-filhas produzidas pela meiose Ie contribui para a diversidade genética dos gametas que, finalmente, são produzidos. No entanto, como poderia ser esperado, essa recombinação é altamente regulada: número e a localização das quebras na fita dupla ao longo de cada cromossomo são controlados, assim como a probabilidade que uma quebra seja convertida em um ponto de entrecruzamento. Em média, o resultado dessa regulação é que cada par de homólogos humanos está ligado por dois ou três pontos de recombinação (Figura 17-59). Embora as quebras nas fitas duplas que ocorrem na meiose I possam ser localiza- das em quase qualquer lugar ao longo do cromossomo, elas não estão uniformemente distribuídas: elas aglomeram-se em "locais de alta probabilidade", onde DNA é acessí- vel, e ocorrem apenas de forma rara em "locais de baixa probabilidade", como as regiões de heterocromatina ao redor dos centrômeros e telômeros. Pelo menos dois tipos de regulação influenciam a localização e o número de entre- cruzamentos que se formam, nenhum deles sendo bem compreendido. Ambos funcio- nam antes do complexo sinaptonêmico se organizar. Um assegura que pelo menos um entrecruzamento se forme entre os membros de cada par homólogo, como é necessário para a segregação normal dos homólogos em meiose I. No outro, chamado de interferên- Figura 17-59 Recombinação por entre- cruzamento entre homólogos no tes- tículo humano. Nesta fotomicrografia de imunofluorescência, anticorpos foram usa- dos para corar os complexos sinaptonêmi- (vermelho), os centrômeros (azul) e os locais de recombinação (verde). Observe que todos os bivalentes têm ao menos um ponto de entrecruzamento e nenhum tem mais que quatro. (Modificada de A. Lynn et al., Science 296:2222-2225, 2002. 10 µm Com permissão de AAAS.)1010 PARTE IV Organização interna da célula cia de entrecruzamento, a presença de um evento de recombinação inibe a formação de outro próximo a ele, talvez pela depleção local das proteínas necessárias para converter uma quebra na fita dupla de DNA em um entrecruzamento estável. A meiose frequentemente funciona mal A distribuição dos cromossomos que ocorre durante a meiose é uma façanha extraordiná- ria de contabilidade intracelular. Em humanos, cada meiose necessita que a célula inicial não perca de vista 92 cromátides (46 cromossomos, cada um duplicado), distribuindo um conjunto completo de cada tipo de autossomo para cada um dos quatro haploides des- cendentes. Não surpreende que podem ocorrer erros na distribuição dos cromossomos durante esse processo complicado. Os erros são especialmente comuns na meiose em mu- lheres, a qual é interrompida após diploteno durante anos: a meiose I só é completada no momento da ovulação, e a meiose II somente após oócito ser fecundado. Na verda- de, tais erros na segregação de cromossomos durante desenvolvimento do oócito são as causas mais comuns tanto de aborto espontâneo quanto de retardo mental em humanos. Quando homólogos falham em se separar de forma adequada um fenômeno cha- mado não disjunção -, o resultado é que alguns gametas haploides resultantes não têm um cromossomo particular, enquanto outros tem mais de uma cópia deles. Na fecunda- ção, esses gametas formam embriões anormais, a maioria dos quais morre. No entanto, alguns sobrevivem. Por exemplo, em humanos, a síndrome de Down, que é a principal causa de retardo mental, é causada por uma cópia extra do cromossomo 21, normalmen- te resultante da não disjunção durante a meiose I no ovário da fêmea. Erros de segregação durante a meiose I aumentam muito à medida que a idade materna avança. Resumo Os gametas haploides são produzidos por meiose, na qual um núcleo diploide entra em duas divisões celulares sucessivas após uma rodada de replicação do DNA. A meiose é dominada por uma prófase prolongada. No início da prófase, os cromossomos estão repli- cados e consistem em duas cromátides-irmãs unidas. Então, os cromossomos homólogos pareiam e tornam-se, de forma progressiva, mais justapostos à medida que a prófase I prossegue. Os homólogos alinhados entram em recombinação genética formando pontos de entrecruzamento que ajudam a manter cada par de homólogos juntos durante a metá- fase I. As proteínas associadas ao cinetocoro específicas da meiose auxiliam a garantir que ambas as cromátides-irmãs em um homólogo liguem-se ao mesmo polo do fuso; outras proteínas associadas ao cinetocoro asseguram que os homólogos permaneçam conecta- dos em seus centrômeros durante a anáfase I, de maneira que os homólogos, em vez das cromátides-irmãs, sejam segregados na meiose I. Depois da longa meiose I, a meiose II ocorre rapidamente, sem replicação de DNA, em um processo que lembra a mitose, no qual cromátides-irmãs são separadas na anáfase. CONTROLE DA DIVISÃO E DO CRESCIMENTO CELULAR Um óvulo fertilizado de camundongo e um óvulo fertilizado humano são similares em ta- manho, embora produzam animais de tamanhos muito diferentes. Que fatores no controle do comportamento celular em humanos e camundongos são responsáveis por essas dife- renças de tamanho? A mesma questão fundamental pode ser feita para cada órgão e tecido do corpo de um animal. Que fatores determinam o comprimento da tromba de um elefan- te ou tamanho de seu cérebro ou do fígado? Essas questões são, em grande parte, sem respostas, mas, apesar disso, é possível dizer quais componentes uma resposta deve ter. tamanho de um órgão ou organismo, depende da sua massa total de células, que depende de ambos, número total de células e seu tamanho. Por sua vez, número de célu- las depende da quantidade de divisões celulares e mortes celulares. Portanto, tamanho de órgãos e do corpo é determinado por três processos celulares fundamentais: cresci- mento, divisão e sobrevivência. Cada um é fortemente regulado tanto por programas intracelulares como por moléculas-sinal extracelulares que controlam esses programas. As moléculas de sinalização extracelular que regulam 0 crescimento celular, a di- visão e a sobrevivência são geralmente proteínas solúveis secretadas, proteínas ligadas àCAPÍTULO 17 Ciclo celular 1011 superfície celular ou componentes da matriz extracelular. Elas podem ser operacional- mente divididas em três classes principais: 1. Mitógenos, que estimulam a divisão celular, fundamentalmente desencadeando uma onda de atividade de G₁/S-Cdk que atenua controles intracelulares negativos que, de outra maneira, bloqueariam a progressão ao ciclo celular. 2. Fatores de crescimento, que estimulam o crescimento celular (aumento da massa celular) ao promover a síntese de proteínas e outras macromoléculas e ao inibir sua degradação. 3. Fatores de sobrevivência, que promovem a sobrevivência celular ao suprimir a for- ma de morte celular programada conhecida como apoptose. Muitas moléculas de sinalização extracelular promovem todos esses processos, enquanto outras promovem um ou dois. Na verdade, termo fator de crescimento é fre- quentemente usado de forma inapropriada para descrever um fator que possui qualquer uma dessas atividades. Ainda pior: termo crescimento celular muitas vezes é usado no sentido de aumento do número de células ou de proliferação celular. Além dessas três classes de sinais estimuladores, existem moléculas de sinalização extracelular que suprimem a proliferação celular, o crescimento celular, ou ambos; em geral, sabe-se menos a respeito delas. Existem também moléculas de sinaização extrace- lular que ativam a apoptose. Nesta seção, enfocaremos principalmente como os mitógenos e outros fatores, como danos ao DNA, controlam a taxa de divisão celular. Em seguida, nos voltaremos a um problema importante, porém muito pouco compreendido: como uma célula em proliferação coordena 0 crescimento com a divisão celular, de forma a manter seu tama- nho adequado. Discutiremos 0 controle da sobrevivência celular e da morte celular por apoptose no Capítulo 18. Os mitógenos estimulam a divisão celular Os organismos unicelulares tendem a crescer e se dividir tão rápido quanto possível e sua taxa de proliferação depende em grande parte da disponibilidade de nutrientes no ambiente. Contudo, as células de um organismo multicelular se dividem somente quan- Microtúbulo do organismo necessita de mais células. Assim, para que uma célula animal se proli- fere, ela deve receber sinais extracelulares estimuladores, sob a forma de mitógenos, de Mitocôndria outras células, geralmente suas vizinhas. Os mitógenos superam os mecanismos intrace- lulares de freagem que bloqueiam a progressão ao ciclo celular. Um dos primeiros mitógenos identificados foi o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF; do inglês, platelet-derived growth factor), sendo característico de mui- tos outros descobertos desde então. A via para seu isolamento começou com a observa- ção de que fibroblastos em uma placa de cultura se proliferam quando é fornecido soro, mas não quando é fornecido plasma. plasma é preparado pela remoção das células do sangue sem que ocorra a coagulação; soro é preparado permitindo que o sangue coagule e coletando líquido livre de células que resta. Quando o sangue coagula, as Glicogênio plaquetas incorporadas ao coágulo são estimuladas a liberar o conteúdo de suas vesí- culas secretoras (Figura 17-60). A capacidade superior do soro de manter a proliferação Vesícula secretora celular sugeriu que as plaquetas contêm um ou mais mitógenos. Essa hipótese foi con- firmada pela demonstração de que, em vez de soro, extratos de plaquetas podiam agir na estimulação da proliferação de fibroblastos. Demonstrou-se que o fator crítico nos ex- 1 µm tratos era uma proteína, que foi subsequentemente purificada e denominada PDGF. No Figura 17-60 Uma plaqueta. As plaque- organismo, a PDGF liberada dos coágulos sanguíneos ajuda a estimular a divisão celular tas são células em miniatura e sem núcleo. durante a cicatrização de feridas. Elas circulam no sangue e ajudam a esti- A PDGF é apenas uma das mais de 50 proteínas que, sabe-se, atuam como mitó- mular a coagulação sanguínea em locais genos. A maioria dessas proteínas tem uma especificidade ampla. A PDGF, por exemplo, onde houve danos teciduais, impedindo, pode estimular muitos tipos de células a se dividirem, incluindo fibroblastos, células com isso, sangramento excessivo. Elas também liberam vários fatores que estimu- musculares lisas e células da neuroglia. Similarmente, o fator de crescimento epidérmico lam a cicatrização. A plaqueta mostrada (EGF; do inglês, epidermal growth factor) age não somente em células epidérmicas, mas aqui foi cortada ao meio para mostrar suas também em muitos outros tipos celulares, incluindo células epiteliais e não epiteliais. vesículas secretoras, algumas das quais Contudo, alguns mitógenos têm uma especificidade restrita; a eritropoietina, por exem- contêm o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF).1012 PARTE IV Organização interna da célula plo, induz somente a proliferação de precursores dos eritrócitos. Muitos mitógenos, in- cluindo PDGF, também têm ações além da estimulação da divisão celular: elas podem estimular crescimento celular, sobrevivência, diferenciação ou migração, dependendo das circunstâncias e do tipo celular. Em alguns tecidos, proteínas de sinalização extracelular inibidoras se opõem aos reguladores positivos e, desse modo, inibem crescimento de órgãos. As proteínas-si- nal inibidoras mais bem caracterizadas são os fatores de crescimento transformador (TGFß) e proteínas relacionadas. inibe a proliferação de vários tipos celulares, principalmente bloqueando a progressão do ciclo celular em As células podem entrar em um estado especializado de não divisão Na ausência de um sinal mitogênico para a proliferação, a inibição das Cdks em é mantida pelos múltiplos mecanismos anteriormente discutidos, e a progressão a um novo ciclo celular é bloqueada. Em alguns casos, as células parcialmente desmontam seu sistema de controle do ciclo celular e saem do ciclo para um estado especializado de não divisão, chamado G₀. A maioria das células em nosso organismo está em porém as bases molecula- res e a reversibilidade desse estado variam em diferentes tipos celulares. A maioria de nossos neurônios e células musculares esqueléticas, por exemplo, está em um estado de G₀ terminalmente diferenciado, no qual seu sistema de controle do ciclo celular está completamente ausente: a expressão dos genes que codificam várias Cdks e ciclinas está permanentemente inativada, e a divisão celular raramente ocorre. Alguns tipos celulares não possuem ciclo celular apenas de forma transitória e retêm a capacidade de remontar o sistema de controle do ciclo celular rapidamente e de entrar em ciclo novamente. A maioria das células hepáticas, por exemplo, está em mas pode ser estimulada a se di- vidir se fígado sofrer danos. Já outros tipos celulares, incluindo fibroblastos e linfócitos, retiram-se e entram em ciclo celular repetidamente ao longo de sua vida. Quase todas as variações na duração do ciclo celular no organismo adulto ocorrem durante espaço de tempo que a célula passa em G₁ ou G₀. Por outro lado, tempo que uma célula leva para progredir do início da fase S à mitose normalmente é breve (em geral, de 12 a 24 horas em mamíferos) e relativamente constante, independentemente do intervalo existente entre as divisões. Os mitógenos estimulam as atividades de e Na grande maioria das células animais, os mitógenos controlam a taxa de divisão celular agindo na fase do ciclo celular. Como discutido anteriormente, múltiplos mecanis- mos agem durante G₁ para suprimir a atividade Cdk. Os mitógenos liberam esses inibi- dores na atividade Cdk, permitindo, assim, a entrada em um novo ciclo celular. Como discutimos no Capítulo 15, os mitógenos interagem com receptores de su- perfície celular a fim de acionar múltiplas vias de sinalização intracelular. Uma via princi- pal age através de GTPase Ras monomérica, a qual leva à ativação de uma cascata da pro- teína-cinase mitógeno-ativada (MAP-cinase) (ver Figura 15-49). Isso leva a um aumento da produção de proteínas reguladoras de transcrição, incluindo a Myc. Acredita-se que a promova a entrada no ciclo celular por meio de vários mecanismos, um dos quais é o aumento da expressão de genes que codificam (ciclinas D), aumentando, com isso, a atividade da (ciclina D-Cdk4). A Myc também tem um importante papel na estimulação da transcrição de genes que aumentam crescimento celular. A função-chave dos complexos de em células animais é ativar um grupo de fatores reguladores gênicos denominados proteínas E2F, que se ligam a sequências específicas de DNA nos promotores de uma grande variedade de genes que codificam proteínas necessárias à entrada na fase S, incluindo S-ciclinas e proteínas envolvidas na síntese de DNA e na duplicação dos cromossomos. Na ausência de esti- mulação mitogênica, a expressão gênica dependente de E2F é inibida por uma interação entre E2F e membros da família de proteínas do retinoblastoma (Rb). Quando as cé- lulas são estimuladas a se dividir pelos mitógenos, a ativa se acumula e fosforila membros da família Rb, reduzindo sua ligação a E2F. As proteínas E2F liberadas ativam, então, a expressão de seus próprios genes-alvo (Figura 17-61).