O Laboratório de Reprodução Humana Assistida-4

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<p>O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>Prof.ª Ana Clara Coelho Esteves</p><p>Descrição</p><p>Técnicas de preparo seminal, de fertilização in vitro e transferência</p><p>embrionária.</p><p>Propósito</p><p>Compreender as técnicas empregadas na rotina dos laboratórios de</p><p>andrologia e embriologia envolvidas nos diversos tratamentos de</p><p>reprodução assistida.</p><p>Objetivos</p><p>Módulo 1</p><p>Laboratório de andrologia e inseminação</p><p>intrauterina (IIU).</p><p>Descrever as técnicas empregadas no laboratório de andrologia e de</p><p>inseminação intrauterina (IIU);</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 1/67</p><p>Módulo 2</p><p>Laboratório de embriologia e técnicas de</p><p>fertilização in vitro</p><p>Descrever as técnicas de fertilização in vitro;</p><p>Módulo 3</p><p>Técnicas especiais empregadas no</p><p>laboratório de embriologia.</p><p>Reconhecer as técnicas especiais empregadas no laboratório de</p><p>embriologia clínica.</p><p>Muito do que está envolvido nos tratamentos de reprodução</p><p>humana assistida acontece nos bastidores da clínica nos</p><p>laboratórios de andrologia e embriologia. Neles é onde acontece</p><p>todo o preparo dos gametas, prévio à sua utilização nos</p><p>procedimentos.</p><p>No laboratório de andrologia realizamos análise diagnóstica e</p><p>processamento terapêutico seminal. Na análise diagnóstica ‒ o</p><p>espermograma ‒ observamos todas as características</p><p>macroscópicas e microscópicas da amostra ejaculada, o que</p><p>resulta em um parecer pontual sobre aquela amostra.</p><p>Já no processamento terapêutico, processamos e capacitamos a</p><p>amostra para que seja utilizada nos tratamentos de infertilidade ‒</p><p>sejam inseminação intrauterina, fertilização in vitro, ou mesmo</p><p>congelamento da amostra para preservação da fertilidade.</p><p>Vamos conhecer também o laboratório de embriologia, onde são</p><p>realizadas as técnicas de alta complexidade, e também saber mais</p><p>sobre os procedimentos às quais estão relacionadas.</p><p>Introdução</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 2/67</p><p>Nesse laboratório, manipulamos oócitos e embriões, desde a</p><p>punção ovariana para aspiração do líquido folicular, contendo os</p><p>complexos cumulus-oócito, até o momento da transferência ou</p><p>criopreservação dos embriões formados.</p><p>Algumas das etapas compreendidas nesse processo são:</p><p>identificação e denudação dos oócitos, classificação da maturação</p><p>oocitária, fecundação dos oócitos, verificação da fertilização,</p><p>cultivo embrionário, avaliação da morfologia e desenvolvimento</p><p>dos embriões, criopreservação de oócitos e embriões, e</p><p>transferência embrionária.</p><p>Também veremos algumas técnicas especiais que figuram no dia-</p><p>a-dia dos embriologistas, como obtenção cirúrgica de</p><p>espermatozoides, técnicas alternativas de seleção espermática</p><p>(em casos como alto índice de fragmentação de DNA e alteração</p><p>da morfologia espermática) e eclosão assistida, para auxiliar</p><p>embriões a saírem da zona pelúcida em situações específicas,</p><p>como espessamento de zona e criopreservação prévia.</p><p>Orientação sobre unidade de medida</p><p>Em nosso material, unidades de medida e números são escritos</p><p>juntos (ex.: 25km) por questões de tecnologia e didáticas. No</p><p>entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o</p><p>número e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e</p><p>demais materiais escritos por você devem seguir o padrão</p><p>internacional de separação dos números e das unidades.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 3/67</p><p>1 - Laboratório de andrologia e inseminação intrauterina (IIU).</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas empregadas no laboratório</p><p>de andrologia e de inseminação intrauterina (IIU).</p><p>Introdução à análise seminal</p><p>O sêmen é um fluido orgânico cuja principal função é transportar os</p><p>espermatozoides desde os testículos até o oócito, para que ocorra a</p><p>fecundação e, consequentemente, a gravidez. Para que o</p><p>espermatozoide consiga ser ejaculado, são produzidas as secreções</p><p>pelo aparelho genital masculino, que se misturam aos espermatozoides</p><p>produzidos nos testículos, formando o sêmen em si.</p><p>Cada secreção tem a sua função para que o espermatozoide consiga</p><p>percorrer todo o caminho até o encontro com o oócito. O líquido</p><p>vesicular tem função na coagulação e na manutenção da alcalinidade</p><p>do pH; a secreção prostática possui enzimas proteolíticas que ajudam</p><p>na liquefação seminal; e as glândulas bulbouretrais realizam a</p><p>lubrificação.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 4/67</p><p>Espermograma</p><p>A análise seminal ou espermograma é um exame que fornece</p><p>informações importantes sobre a produção de espermatozoides e das</p><p>funções secretoras das glândulas acessórias (próstata e vesícula</p><p>seminal), e consiste na avaliação macroscópica e microscópica do</p><p>sêmen, como veremos a seguir.</p><p>Para a realização do espermograma, é indicada a abstinência sexual</p><p>entre 2 e 7 dias, já que sabemos que um período menor ou maior pode</p><p>alterar os resultados do exame.</p><p>Exemplo</p><p>Se o paciente tem ejaculações frequentes, o volume e a concentração</p><p>diminuem, ficando predominantes os espermatozoides mais jovens e</p><p>móveis. Um período prolongado de abstinência ejaculatória, por sua vez,</p><p>influencia negativamente a motilidade e a vitalidade dos</p><p>espermatozoides, uma vez que a concentração de espermatozoides</p><p>inativos aumenta.</p><p>É importante lembrar que um único espermograma não é diagnóstico</p><p>definitivo da qualidade seminal, uma vez que diferentes amostras de um</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 5/67</p><p>mesmo paciente podem apresentar variações e sofrer alterações devido</p><p>à ação de fatores externos, como alguns medicamentos, por exemplo.</p><p>Assim, para um panorama mais fidedigno de avaliação da qualidade</p><p>seminal, é aconselhável que o espermograma seja repetido em um</p><p>período de dois a três meses.</p><p>O método de coleta é, de preferência, a masturbação, realizada em uma</p><p>sala isolada, próxima ao laboratório, utilizando um frasco coletor estéril,</p><p>atóxico (feito de polipropileno) e previamente identificado, com boca</p><p>larga, e sem o uso de lubrificante.</p><p>Após a coleta, o paciente preenche um questionário, informando se</p><p>houve perda de amostra, já que a primeira parte do ejaculado é a que</p><p>possui a maior concentração de espermatozoides.</p><p>Para cada paciente é preenchido um prontuário no qual anotamos os</p><p>horários de coleta e de início da análise. A análise deve ser realizada em</p><p>até uma hora após a ejaculação, e, além disso, a amostra não pode</p><p>sofrer bruscas alterações de temperatura, devendo ser mantida sempre</p><p>entre 25°C e 37°C.</p><p>Ao chegar no laboratório, a amostra passará por uma análise</p><p>macroscópica, que consiste na verificação da presença de coágulos,</p><p>liquefação, viscosidade, aspecto, cor, pH, e volume seminal. Na</p><p>avaliação microscópica, por sua vez, observamos a concentração,</p><p>motilidade dos espermatozoides e concentração de células redondas.</p><p>Saiba mais</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 6/67</p><p>Os valores de referência, tanto para os parâmetros macro quanto para</p><p>os microscópicos, são definidos pela Organização Mundial de Saúde</p><p>(OMS) e estabelecidos a partir da média de diversas análises seminais</p><p>provindas de homens de diferentes nacionalidades, que foram capazes</p><p>de engravidar suas esposas por método natural em até um ano.</p><p>Liquefação</p><p>Em condições fisiológicas, o sêmen fica em forma de coágulo logo após</p><p>a ejaculação. Esse coágulo tem como função proteger os</p><p>espermatozoides do pH ácido da vagina. O coágulo se forma a partir de</p><p>proteínas secretadas pelas vesículas seminais.</p><p>O coágulo deve se desfazer naturalmente</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 61/67</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>Vimos que existem algumas técnicas para seleção de</p><p>espermatozoides que se baseiam em características específicas.</p><p>Em relação a elas, assinale as afirmativas a seguir:</p><p>I. A PICSI tem por objetivo selecionar espermatozoides</p><p>teoricamente livres de fragmentação de DNA.</p><p>II. A super ICSI/ IMSI seleciona espermatozoides baseando-se em</p><p>sua morfologia, com um aumento de 6000 vezes.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 62/67</p><p>III. A super ICSI é capaz de selecionar espermatozoides</p><p>geneticamente saudáveis.</p><p>É correto o que se afirma em:</p><p>Parabéns! A alternativa D está correta.</p><p>A super ICSI não garante que o espermatozoide selecionado será</p><p>geneticamente saudável, pois, mesmo com a alta magnificação</p><p>proporcionada, essa tecnologia não consegue verificar sua carga</p><p>genética, apenas sua morfologia. Portanto, as afirmativas I e II</p><p>estão corretas.</p><p>Questão 2</p><p>Nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente</p><p>características que possam ser prejudiciais à sua eclosão,</p><p>realizamos um procedimento chamado de assisted hatching (AH).</p><p>Sobre essa técnica, é correto afirmar que:</p><p>A I</p><p>B II</p><p>C III</p><p>D I e II</p><p>E I e III</p><p>A</p><p>Pode ser feita de três formas: química, mecânica e</p><p>com laser.</p><p>B</p><p>O método mais utilizado de AH hoje em dia é o</p><p>químico.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 63/67</p><p>Parabéns! A alternativa A está correta.</p><p>AH químico é feito por uma pequena abertura na zona pelúcida,</p><p>com ácido de Tyrode. Já o AH mecânico, também conhecido como</p><p>dissecção parcial da zona (PZD), consiste em fazer uma pequena</p><p>incisão na zona pelúcida, com auxílio de microagulhas. Foi o</p><p>primeiro método de AH utilizado.</p><p>AH com laser: Método mais utilizado atualmente, consiste em abrir</p><p>um orifício na zona pelúcida do embrião com auxílio de pulsos de</p><p>laser. Para isso, é necessário um equipamento especial acoplado</p><p>ao micromanipulador.</p><p>Considerações �nais</p><p>Vimos que, no laboratório de andrologia, podem ser realizados diversos</p><p>métodos de análise e preparo seminal, tanto diagnósticos quanto</p><p>terapêuticos. A escolha do processamento seminal depende do</p><p>procedimento que será realizado e da qualidade da amostra.</p><p>Já no laboratório de embriologia, acontecem todas as técnicas em que</p><p>há manipulação de oócitos e embriões, como fertilização in vitro e as</p><p>etapas que a antecedem, cultivo embrionário e preparo do cateter para</p><p>transferência dos embriões.</p><p>C O AH com laser também é conhecido como PZD.</p><p>D</p><p>O AH mecânico consiste em abrir um orifício na</p><p>zona pelúcida do embrião e, para sua realização, é</p><p>necessário um equipamento especial acoplado ao</p><p>micromanipulador.</p><p>E</p><p>O AH químico consiste em fazer uma pequena</p><p>incisão na zona pelúcida e requer o auxílio de</p><p>microagulhas para ser realizado.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 64/67</p><p>Além disso, existem técnicas especiais que têm o objetivo de auxiliar no</p><p>sucesso do tratamento de reprodução assistida, como a obtenção</p><p>cirúrgica de espermatozoides, as técnicas alternativas de seleção</p><p>espermática e a técnica de eclosão assistida. Todas essas técnicas são</p><p>realizadas pelos embriologistas.</p><p>O laboratório de reprodução assistida é o coração da clínica, onde</p><p>acontecem os eventos mais importantes. Por isso, deve ser um</p><p>ambiente com rigoroso controle de qualidade e com profissionais</p><p>capacitados.</p><p>Podcast</p><p>Antes de finalizarmos, a biomédica Beatriz Campos bate um papo com a</p><p>biomédica Ana Clara Esteves sobre a sua experiência no laboratório de</p><p>Andrologia e embriologia.</p><p></p><p>Explore +</p><p>Para aprofundar seus conhecimentos sobre o tema:</p><p>Leia o manual de laboratório da OMS para exame e processamento do</p><p>sêmen humano. Disponível no site do PNCQ.</p><p>Leia Sperm Preparation and Selection Techniques, de Beydola e</p><p>colaboradores, e Sperm processing and selection, de Sharma e Agarwal</p><p>(2020), para aprofundar seus conhecimentos em técnicas de separação</p><p>e seleção espermática.</p><p>Leia o artigo Sperm Retrieval Techniques for Assisted Reproduction, de</p><p>Esteves e colaboradores (2011), para mais detalhes sobre as técnicas</p><p>especiais de coleta de espermatozoides.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 65/67</p><p>Referências</p><p>AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: técnicas de laboratório. 1</p><p>ed. Porto Alegre, RS: AGE, 2017.</p><p>ESTEVES, S.C. et al. An update on sperm retrieval techniques for</p><p>azoospermic Clinics Review. 68(S1), pp. 99-110.</p><p>ESTEVES, S.C.; ROQUE, M. Extended indications for sperm retrieval:</p><p>summary of current literature. F1000 Research, 2019, pp. 1-12.</p><p>GOSPODINOVA, M. et al. Developing a method for sperm selection</p><p>trough Cumulus Ligands. Annual of Sofia University “St. Kliment</p><p>Ohridski” Faculty of Biology Book 4 — Scientific Sessions of the Faculty</p><p>of Biology 2019, volume 104, pp. 335-347.</p><p>KEEL, B.A.; MAY,J.V.; JONGE, C.J. Handbook of the assisted</p><p>reproduction laboratory. Florida: CRC press LLC, 2000.</p><p>PAREKATTIL, S. J. et al. Male infertily. Sperm Processing and Selection,</p><p>2020.</p><p>SIMON, L. et al. Sperm DNA fragmentation: consequences for</p><p>reproduction. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019.</p><p>The Practice Committee of the American Society for Reproductive</p><p>Medicine. Sperm retrieval for obstructive azoospermia. American</p><p>Society for Reproductive Medicine. 2006; 86(Suppl 4):S115–120.</p><p>OMS. Laboratory manual for the examination and processing of human</p><p>semen. 6. ed. Geneva: World Health Organization, 2021.</p><p>Material para download</p><p>Clique no botão abaixo para fazer o download do</p><p>conteúdo completo em formato PDF.</p><p>Download material</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 66/67</p><p>javascript:CriaPDF()</p><p>O que você achou do conteúdo?</p><p>Relatar problema</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 67/67</p><p>e assumir um aspecto líquido</p><p>em até 30 minutos. Essa liquefação é enzimática e acontece por causa</p><p>das proteases prostáticas.</p><p>Se o sêmen não se liquefizer em 60 minutos, essa amostra teve</p><p>liquefação incompleta ou ausente (condição relacionada a alterações</p><p>prostáticas), podendo precisar de liquefação mecânica ‒ quando</p><p>aspiramos e soltamos o sêmen manualmente com auxílio de uma</p><p>pipeta.</p><p>Proteases</p><p>Enzimas que digerem proteínas.</p><p>Viscosidade</p><p>Após a completa liquefação, observamos a viscosidade da amostra:</p><p>com o auxílio de uma pipeta sorológica estéril, a amostra deve gotejar</p><p>ou formar um filamento de até 2cm ‒ nesse caso, consideramos uma</p><p>viscosidade normal. Caso a amostra apresente um filamento maior do</p><p>que 2cm, a viscosidade é aumentada.</p><p>Volume</p><p>Para medir o volume da amostra pipetamos toda a amostra com o</p><p>auxílio de uma pipeta graduada estéril. De acordo com a OMS, o valor de</p><p>referência para o volume é de 1,4mL (WHO, 2021).</p><p>Amostras com volume inferior são classificadas com hipospérmicas.</p><p>Essa alteração pode estar relacionada à obstrução do ducto</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 7/67</p><p>ejaculatório, ausência congênita bilateral dos vasos deferentes ou</p><p>inflamação crônica. Um volume aumentado, por sua vez, pode ser</p><p>causado por processos inflamatórios agudos nas glândulas anexas.</p><p>Aspecto</p><p>O sêmen normal tem aspecto homogêneo e cor cinza/branco</p><p>opalescente. A amostra pode apresentar mudança de coloração devido</p><p>às infecções ou doenças sistêmicas, ou uso de medicamento.</p><p>Exemplo</p><p>Quando a amostra tem presença de hemácias (hematospermia), fica</p><p>avermelhada; amostras amarelas podem ser indicativas de infecção ou</p><p>icterícia; já amostras translúcidas, em geral, possuem baixa</p><p>concentração de espermatozoides.</p><p>pH</p><p>O pH é o balanço de secreções alcalinas das vesículas seminais e da</p><p>secreção ácida prostática. Em condições normais, o sêmen é um pouco</p><p>alcalino ‒ apresentando valor entre 7,2 e 7,8. Para medir o pH, é utilizado</p><p>o papel indicador de pH.</p><p>Concentração espermática</p><p>A concentração espermática está associada à produção espermática</p><p>pelos testículos. Para a avaliação da concentração, pode ser utilizado</p><p>um dispositivo específico, chamado câmara de Makler, ou um</p><p>dispositivo utilizado para contagem de células em geral (câmara de</p><p>Neubauer, por exemplo).</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 8/67</p><p>No caso da câmara de Makler, dispositivo mais comumente utilizado</p><p>nos laboratórios de Reprodução Assistida, são colocados 10µL de</p><p>sêmen liquefeito e homogeneizado no centro do dispositivo, que são</p><p>cobertos com uma lamínula especial.</p><p>Essa câmara possui um quadrante com 100 quadrados ‒ medindo</p><p>0,1mm X 0,1mm cada um ‒ e profundidade de 0,01mm, o que permite</p><p>que os espermatozoides nadem livremente mesmo com a lamínula.</p><p>Para determinar a concentração de espermatozoides por mL, conta-se a</p><p>quantidade de espermatozoides presentes em 10 quadrados (uma fileira</p><p>ou coluna) e multiplica-se por 106.</p><p>Câmera de Makler sendo carregada com amostra para análise.</p><p>Vamos a um exemplo prático ?</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 9/67</p><p>Fotografia de visão microscópica de amostra seminal analisada na câmara de Makler.</p><p>Contando 42 espermatozoides em uma fileira de 10 quadrados, a</p><p>amostra tem 42 x 106/mL (42 milhões de espermatozoides por mililitro).</p><p>Essa avaliação é feita em microscópio óptico com aumento de 200x.</p><p>Para saber o número total de espermatozoides na amostra, multiplica-se</p><p>o resultado da concentração por mililitro pelo volume total da amostra</p><p>ejaculada. Por exemplo, uma amostra com 3mL de volume com uma</p><p>concentração de 42 x 106/mL tem 126 x 106 (126 milhões) de</p><p>espermatozoides.</p><p>De acordo com a OMS, o valor de referência para a concentração</p><p>seminal é de 16 x 106/mL (16 milhões de espermatozoides por mililitro)</p><p>(WHO, 2021). Para amostras que apresentem concentração espermática</p><p>inferior a esse valor, utilizamos a nomenclatura de oligozoospermia.</p><p>Falamos em azoospermia quando há ausência de espermatozoides na</p><p>amostra.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 10/67</p><p>Concentração espermática normal.</p><p>Oligozoospermia.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 11/67</p><p>Azoospermia.</p><p>Motilidade</p><p>A motilidade espermática é definida como o movimento espontâneo do</p><p>espermatozoide, e sua avaliação deve ser feita logo após a liquefação</p><p>do sêmen. A contagem é realizada na câmara de Makler, em</p><p>microscópio óptico com aumento de 200x.</p><p>De acordo com a OMS, os espermatozoides são classificados em quatro</p><p>grupos:</p><p> Moveis rápidos progressivos (A):</p><p>E id l id d</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 12/67</p><p>Geralmente, contamos em duplicata 100 espermatozoides (totalizando</p><p>200 espermatozoides ao final das duas contagens) com auxílio de um</p><p>contador de células. Após as duas contagens, é feita a média aritmética</p><p>e calculada a porcentagem dos tipos de motilidade encontradas, de</p><p>acordo com a OMS.</p><p>Também segundo a OMS, a motilidade progressiva (A+B) deve ser maior</p><p>do que 30%, e a motilidade total (A+B+C) maior do que 42% (WHO,</p><p>2021). Utilizamos a nomenclatura astenozoospermia para amostras</p><p>com motilidade espermática inferior a esses valores.</p><p>Morfologia</p><p>A morfologia espermática caracteriza-se pela forma do espermatozoide,</p><p>porém não deve ser considerada como indicador absoluto de</p><p>infertilidade. Para avaliação desse parâmetro, a OMS recomenda o</p><p>Espermatozoides que apresentam uma velocidade</p><p>rápida, tanto de forma linear quanto realizando</p><p>curvas durante o trajeto;</p><p> Lentos progressivos (B):</p><p>Espermatozoides que nadam de forma lenta, linear</p><p>ou realizando curvas durante o trajeto;</p><p> Não progressivos (C):</p><p>Espermatozoides que têm movimento sem</p><p>progressão, ou seja, não saem do lugar;</p><p> Imóveis (D):</p><p>Espermatozoides que não apresentam movimento</p><p>algum.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 13/67</p><p>critério de Tygerberg, descrito em 1986 por Kruger et al. (WHO, 2021).</p><p>Avaliamos todas as partes do espermatozoide para determinar um</p><p>padrão de normalidade.</p><p>Nessa classificação, dividimos a observação do espermatozoide em</p><p>três partes: cabeça, peça intermediária e cauda.</p><p>Estrutura do espermatozoide.</p><p>Ao realizar leitura da morfologia espermática, começamos observando a</p><p>cauda, depois a peça intermediária e, por último, a cabeça. Abaixo,</p><p>descrevemos estas estruturas:</p><p>Deve possuir formato oval e superfície lisa, com cerca de 5-6µm</p><p>de comprimento e 2,5-3,5µm de largura. Deve, ainda, apresentar</p><p>uma porção mais clara, o acrossoma — que ocupa de 40 a 70%</p><p>da área da cabeça —, e uma região posterior mais escura, que</p><p>corresponde ao núcleo.</p><p>É a parte que une a cauda do espermatozoide à cabeça,</p><p>apresenta 1,5x o comprimento da cabeça, e largura superior à da</p><p>Cabeça </p><p>Peça intermediária </p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 14/67</p><p>cauda.</p><p>Deve ter aproximadamente 45µm de comprimento, ser mais fina</p><p>do que a peça intermediária e se apresentar uniforme, reta e</p><p>desenrolada.</p><p>A figura a seguir representa as alterações dos espermatozoides com</p><p>suas respectivas nomenclaturas.</p><p>Representação das alterações morfológicas dos espermatozoides e respectivas nomenclaturas,</p><p>de acordo com a classificação de Kruger.</p><p>E como podemos fazer a leitura</p><p>da morfologia seminal?</p><p>Para a realização da leitura da morfologia seminal, realiza-se um</p><p>esfregaço com 10µL de sêmen liquefeito. Após seca, a lâmina é corada</p><p>pelo método panótico rápido e a leitura é realizada em um microscópio</p><p>óptico, sob imersão em óleo, com aumento de 1000x.</p><p>Esfregaço</p><p>Também chamado de “lâmina de extensão”, é a lâmina preparada com uma</p><p>fina camada de sêmen para posterior coloração e análise.</p><p>Método panótico</p><p>Método de coloração baseado no princípio de coloração hematológica,</p><p>composto por três substâncias diferentes (uma fixadora e outras duas</p><p>corantes).</p><p>Cauda </p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 15/67</p><p>Lâmina contendo o esfregaço do sêmen mostrando os espermatozoides.</p><p>Contam-se 100 espermatozoides, classificando-os de acordo com as</p><p>alterações. O valor de referência indicado pela OMS para a morfologia</p><p>espermática é de 4% (WHO, 2021).</p><p>A alteração da morfologia espermática em uma amostra é caracterizada</p><p>como teratozoospermia.</p><p>Testes complementares</p><p>Além dessa análise seminal básica da infertilidade masculina, existem</p><p>outras análises que nos dão mais informações quanto à função</p><p>espermática. Veja a seguir:</p><p>Leucospermia</p><p>A leucospermia é definida por uma quantidade maior que 1 milhão de</p><p>células redondas por mililitro de sêmen.</p><p>Para a realização dessa análise, durante a verificação da concentração</p><p>espermática, quantificamos também o número de células redondas na</p><p>amostra. Quando encontramos mais de 1,0 x 106/mL de células</p><p>redondas, realizamos o teste de endtz, ou teste da peroxidase, com o</p><p>qual vamos conseguir diferenciar e quantificar as células germinativas</p><p>imaturas dos leucócitos.</p><p>Na imagem ao lado, vemos a diferenciação das células redondas,</p><p>utilizando o teste de endtz. A letra N representa uma célula peroxidase</p><p>negativa (células germinativas) e a letra P, uma célula peroxidade</p><p>positiva (leucócitos).</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 16/67</p><p>Teste de endtz.</p><p>Saiba mais</p><p>O teste de Endtz nos dá informação para o tratamento de uma possível</p><p>infecção. Pacientes com leucospermia, geralmente, apresentam</p><p>elevadas quantidades de espermatozoides imaturos e com alteração de</p><p>morfologia.</p><p>Vitalidade</p><p>Outro teste complementar é o de vitalidade, que realizamos quando a</p><p>amostra tem menos de 30% de motilidade progressiva. Esse teste nos</p><p>ajuda a verificar se os espermatozoides estão imóveis por causa de um</p><p>defeito estrutural ou pela morte celular.</p><p>Para realização desse teste, fazemos uma lâmina de esfregaço seminal</p><p>que, posteriormente, passa por um processo especial de coloração. Os</p><p>espermatozoides com a membrana intacta (vivos) são capazes de</p><p>excluir o corante; já os mortos, que não possuem membrana íntegra, são</p><p>corados. Esse teste nos auxilia no diagnóstico de necrozoospermia.</p><p>Necrozoospermia</p><p>Quantidade de espermatozoides vivos abaixo do valor de referência.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 17/67</p><p>Teste de vitalidade.</p><p>Na imagem ao lado, conseguimos observar o resultado de um teste de</p><p>vitalidade. Os espermatozoides corados com a cabeça em rosa são</p><p>considerados mortos (D) e os não corados são considerados vivos (L).</p><p>Outro teste que avalia a vitalidade espermática é o teste hiposmótico</p><p>(HOS), que consiste na adição de um meio com baixa osmolaridade à</p><p>amostra, o que causa um “inchaço" na cauda do espermatozoide cuja</p><p>membrana celular está íntegra.</p><p>Osmolaridade</p><p>Concentração total de todos os solutos na solução.</p><p>Avaliação de aglutinação</p><p>Quando realizamos as contagens ‒ tanto de concentração quanto de</p><p>motilidade seminal, observamos se os espermatozoides estão</p><p>aglutinados, ou seja, se estão “presos” um ao outro pela cauda ou pela</p><p>cabeça.</p><p>Essa aglutinação é causada pela presença de anticorpos</p><p>antiespermatozoides (AAE) em caso de rompimento da barreira</p><p>hematotesticular, podendo ser por trauma cirúrgico ou infecção.</p><p>Na imagem a seguir, conseguimos observar os tipos de aglutinação que</p><p>podemos encontrar durante avaliação da amostra seminal na câmara de</p><p>Makler.</p><p>Barreira hematotesticular</p><p>Barreira física entre os vasos sanguíneos e os túbulos seminíferos, formada</p><p>pelas células de Sertoli.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 18/67</p><p>Representação dos tipos de aglutinação.</p><p>Saiba mais</p><p>A presença de AAE prejudica a motilidade espermática, já que os</p><p>anticorpos aglutinam ou imobilizam os espermatozoides.</p><p>Fragmentação de DNA</p><p>Outro exame importante na análise seminal é o de fragmentação do</p><p>DNA espermático, no qual analisamos se existem quebras de fita única</p><p>ou dupla na cadeia de DNA. Essas quebras podem ser ocasionadas por</p><p>apoptose, durante a espermatogênese, problemas no empacotamento</p><p>da cromatina na formação dos espermatozoides e pela ação de</p><p>espécies reativas de oxigênio.</p><p>A fragmentação do DNA espermático pode ser devida a varicocele,</p><p>idade paterna avançada, infecção genital, tabagismo e obesidade.</p><p>E como podemos analisar a fragmentação do DNA</p><p>espermático?</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 19/67</p><p>Existem quatro técnicas para analisar a fragmentação do DNA</p><p>espermático: TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Uracil Nick</p><p>End Labeling), Teste do cometa (comet assay), Teste da dispersão da</p><p>cromatina (SCD- Sperm Chromatin Dispersion), SCSA (Sperm Chromatin</p><p>Structure Assay).</p><p>Vamos conhecer cada uma delas?</p><p>Espécies reativas de oxigênio</p><p>Compostos químicos resultantes da ativação ou redução do oxigênio</p><p>molecular ou derivados dos produtos da redução.</p><p>Técnica TUNEL, mostrando espermatozoides com o DNA fragmentado corados em</p><p>verde e com DNA íntegro em azul.</p><p>Técnica TUNEL</p><p>Esta técnica, avalia diretamente a fragmentação de DNA da</p><p>amostra. É capaz de diferenciar, por meio de diferentes</p><p>colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 20/67</p><p>Teste do cometa, mostrando vários graus de fragmentação do DNA evidenciados</p><p>pelo comprimento e intensidade da cauda.</p><p>Teste do cometa</p><p>É realizado por eletroforese. Para tal, adicionamos uma</p><p>solução que remove as proteínas. Logo em seguida, são</p><p>adicionados géis de agarose em uma lâmina e submetidos à</p><p>corrente elétrica. Como o DNA do espermatozoide possui carga</p><p>negativa, naqueles que apresentarem fragmentação ocorrerá</p><p>uma migração do DNA para fora do núcleo, formando, assim,</p><p>uma aparência de cometa.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 21/67</p><p>Técnica de dispersão da cromatina espermática.</p><p>Técnica de dispersão da cromatina espermática</p><p>Consiste na resposta diferenciada do espermatozoide quando</p><p>entra em contato com a solução que quebra proteínas. A</p><p>desnaturação e a extração das proteínas nucleares formam um</p><p>halo ao redor da cabeça do espermatozoide quando o DNA</p><p>está íntegro. Assim, ocorre ausência do halo em</p><p>espermatozoides com fragmentação de DNA.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 22/67</p><p>Esquema mostrando um resultado da fragmentação de DNA pela técnica de SCSA.</p><p>Técnica de SCSA</p><p>A técnica de SCSA é realizada por citometria de fluxo e permite</p><p>a análise de grande número de células. Para sua realização,</p><p>são associados fluorocromos para a diferenciação de</p><p>espermatozoides fragmentados dos não fragmentados.</p><p>Preparo seminal</p><p>Como já vimos, o sêmen é composto</p><p>pelo plasma seminal, que auxilia</p><p>os espermatozoides a atravessarem o muco cervical, que, por sua vez,</p><p>tem como função natural selecionar os espermatozoides viáveis.</p><p>Para os tratamentos de reprodução assistida ‒ tanto a inseminação</p><p>intrauterina (IIU) quanto a fertilização in vitro clássica (FIV) e a injeção</p><p>intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) ‒, essa etapa de seleção</p><p>natural é driblada, pois removemos o plasma seminal com as técnicas</p><p>de preparo seminal.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 23/67</p><p>Assim, conseguimos preparar uma amostra com maior concentração de</p><p>espermatozoides e com melhor motilidade, e retiramos as células</p><p>germinativas, debris, espermatozoides inviáveis. A técnica escolhida</p><p>para realizar o preparo seminal vai depender da qualidade seminal, ou</p><p>seja, da concentração e motilidade seminal.</p><p>Debris</p><p>Sujeiras, elementos que não fazem parte do sêmen propriamente dito.</p><p>Sperm wash</p><p>Para amostras com oligozoospermia severa é realizada a técnica de</p><p>sperm wash, que consiste em concentrar todos os elementos do sêmen,</p><p>incluindo os espermatozoides móveis e imóveis ‒ aumentando a</p><p>concentração da amostra.</p><p>Para a realização dessa técnica, adicionamos, em um tubo cônico de</p><p>15mL, meio de cultivo tamponado à amostra seminal liquefeita,</p><p>homogeneizamos e centrifugamos. Após a centrifugação, removemos o</p><p>sobrenadante e ressuspendemos o pellet em uma pequena quantidade</p><p>de meio tamponado; homogeneizamos e realizamos uma nova análise</p><p>da amostra para determinar as novas concentração e motilidade</p><p>espermática.</p><p>Meio de cultivo tamponado</p><p>Meio de cultivo cujo pH não sofre grandes variações em condições</p><p>ambiente (e, por isso, é usado quando fazemos algum procedimento que vá</p><p>manter os gametas fora da incubadora por um período maior do que dois</p><p>minutos).</p><p>Pellet</p><p>Amostra concentrada ao fundo do tubo, que se distingue do sobrenadante.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 24/67</p><p>Esquema mostrando a técnica de Sperm wash.</p><p>Swim-up</p><p>Para amostra com oligozoospermia grave, leucospermia e boa</p><p>motilidade, ou seja, amostras com motilidade acima de 30%, realizamos</p><p>a técnica de swim-up, que consiste na migração dos espermatozoides</p><p>contra a gravidade, como o próprio nome da técnica diz (“nadar para</p><p>cima”), resultando na seleção de espermatozoides móveis na alíquota</p><p>superior.</p><p>Para a realização dessa técnica colocamos 1mL de meio de cultivo</p><p>tamponado em um tubo cônico de 15mL e adicionamos 1mL da</p><p>amostra seminal liquefeita no fundo dele. Deixamos a amostra em um</p><p>bloco aquecido com angulação de 45° por 60 minutos.</p><p>Após esse período, retiramos uma alíquota de 0,5mL do sobrenadante e</p><p>colocamos em outro tubo cônico. Realizamos uma nova análise da</p><p>amostra para determinar a concentração e a motilidade espermática.</p><p>Esquema ilustrando a técnica de Swim-up.</p><p>Gradiente descontínuo de densidade</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 25/67</p><p>Outra técnica utilizada nos tratamentos de reprodução assistida é o</p><p>gradiente descontínuo de densidade. Podemos realizar essa técnica em</p><p>amostras normozoospermicas (que apresentam resultados ideais em</p><p>relação aos valores de referência) ou limítrofes.</p><p>Esse preparo tem como princípio a seleção dos espermatozoides por</p><p>meio da passagem da amostra por duas camadas de densidades</p><p>distintas, a de 90% e a de 45%. A diferença de densidade do meio se dá</p><p>a partir da concentração de partículas de sílica recobertas por</p><p>polivinilpirrolidona (PVP). Essa técnica seleciona os espermatozoides</p><p>com melhor motilidade e morfologia. A seguir, demonstraremos as</p><p>etapas que envolvem a realização deste processo:</p><p>Polivinilpirrolidona (PVP)</p><p>É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se</p><p>movimentem mais lentamente.</p><p>Depositamos em um tubo cônico 1,0mL do meio com maior</p><p>densidade (90%), para formar a camada inferior. Depois,</p><p>cuidadosamente, adicionamos o mesmo volume do meio de</p><p>menor densidade (45%) para formar a camada superior.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 26/67</p><p>Por último, adicionamos, cuidadosamente, no máximo 3,0mL</p><p>da amostra de sêmen liquefeita, sobre as camadas.</p><p>Caso a amostra tenha mais de 3,0mL, indica-se fazer dois</p><p>gradientes.</p><p>Em seguida, centrifugamos a amostra durante 20 minutos e, ao</p><p>final, retiramos o pellet.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 27/67</p><p>Após retirar o pellet, este é depositado em um tubo limpo e, em</p><p>seguida, adicionamos entre 2,0 e 3,0mL de meio de cultivo</p><p>tamponado, para, então, seguir as mesmas etapas do sperm</p><p>wash.</p><p>Finalizada essa etapa, realizamos uma nova análise da</p><p>amostra para determinar a concentração e a motilidade</p><p>espermática resultantes.</p><p>Em amostras com contagens limítrofes de concentração e</p><p>motilidade, podemos realizar um mini gradiente, para o qual</p><p>usamos 0,5mL, em invés de 1,0mL, de volume das camadas do</p><p>gradiente e adicionamos, no máximo, 1,0mL de sêmen.</p><p>Saiba mais</p><p>Essas três técnicas ‒ sperm wash, swim-up e gradiente descontínuo de</p><p>densidade ‒ são as principais. Entretanto, existem as variações, como,</p><p>por exemplo, realizar um sperm wash na amostra e, com o pellet, realizar</p><p>o swim-up. Outra variação é realizar a técnica de gradiente descontínuo</p><p>de densidade e, após a segunda centrifugação, realizar o swim-up.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 28/67</p><p>Preparo seminal para casais sorodiscordantes</p><p>Em casais sorodiscordantes, nos quais pode ocorrer de apenas um</p><p>cônjuge ser afetado, ou ambos, por uma doença viral infecciosa</p><p>sexualmente transmissível, e que necessitam realizar algum tratamento</p><p>de fertilização in vitro, realizamos a lavagem do sêmen com o intuito de</p><p>retirar totalmente o plasma seminal da amostra, pois é nele que se</p><p>encontram as partículas virais.</p><p>Assim, diminuímos o risco de contaminação. As principais infecções</p><p>que podem se beneficiar desse preparo são HIV, hepatite B e hepatite C.</p><p>Nessas amostras de pacientes com carga viral positiva, realiza-se um</p><p>gradiente descontínuo de densidade, com dupla lavagem do pellet em</p><p>meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um swim-up,</p><p>dependendo da qualidade seminal.</p><p>Uma parte da amostra é congelada e a outra é enviada para a realização</p><p>do exame de carga viral, o PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Se o</p><p>resultado desse exame for negativo, podemos utilizar a amostra</p><p>congelada em um tratamento de fertilização in vitro. Caso o resultado</p><p>seja positivo, encaminhamos o paciente para um infectologista.</p><p>Preparo seminal</p><p>Neste vídeo, a especialista fala sobre os objetivos do preparo seminal e</p><p>apresenta as principais técnicas utilizadas neste processo.</p><p>Ejaculação retrógrada</p><p>Alguns pacientes podem apresentar ejaculação retrógrada, na qual o</p><p>volume do ejaculado não passa pelo ducto deferente e acaba refluindo</p><p>para a bexiga, sendo liberado na urina.</p><p></p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 29/67</p><p>Nesses casos, o paciente precisa realizar um preparo pré-coleta, com a</p><p>ingestão de bicarbonato de sódio em doses previamente recomendadas</p><p>pelo médico, para manter o pH da urina neutro, e esvaziar a bexiga duas</p><p>horas antes da coleta. A coleta é feita por masturbação e, logo após, o</p><p>paciente realiza a coleta de urina em um frasco estéril.</p><p>Logo quando a urina chega ao laboratório, realizamos a leitura do pH,</p><p>para verificar se ele não está ácido, o que</p><p>seria prejudicial aos</p><p>espermatozoides. Depois, separamos a urina em tubos cônicos de</p><p>15mL e centrifugamos. Todos os pellets são, então, colocados juntos</p><p>em um novo tubo cônico, e a eles adicionamos 5,0mL meio de cultivo</p><p>tamponado para lavagem (sperm wash).</p><p>Retiramos o sobrenadante e realizamos uma nova lavagem. Após esse</p><p>processamento, realizamos uma análise da amostra para determinar a</p><p>concentração e a motilidade dos espermatozoides.</p><p>Inseminação intrauterina (IIU)</p><p>A inseminação intrauterina é um tratamento de baixa complexidade para</p><p>o qual manipulamos apenas o sêmen, a fim de capacitá-lo. Esse</p><p>processo é realizado no laboratório de andrologia e visa processar e</p><p>preparar o sêmen de forma que a amostra inseminada contenha os</p><p>melhores espermatozoides. A IIU, em geral, é um procedimento rápido e</p><p>indolor, que não necessita de sedação.</p><p>Para esta técnica, elegemos o preparo seminal adequado de acordo</p><p>com a qualidade da amostra seminal. Uma vez terminada a etapa de</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 30/67</p><p>preparo, a amostra capacitada resultante é carregada em uma seringa</p><p>de 1mL e inseminada no útero da paciente por meio de um cateter</p><p>previamente posicionado pelo médico.</p><p>Processo de inseminação intrauterina.</p><p>Recomendação</p><p>A paciente deve estar com a bexiga cheia (para melhor posicionamento</p><p>do útero) e em posição ginecológica.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 31/67</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>O espermograma é um exame que fornece informações</p><p>importantes sobre a produção de espermatozoides e das funções</p><p>secretoras das glândulas acessórias. Sobre esse exame, é correto</p><p>afirmar:</p><p>A</p><p>Um único espermograma fornece diagnóstico</p><p>definitivo da qualidade seminal.</p><p>B</p><p>Consiste na avaliação de parâmetros macro e</p><p>microscópicos.</p><p>C Avalia somente motilidade dos espermatozoides.</p><p>D Não avalia a morfologia dos espermatozoides.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 32/67</p><p>Parabéns! A alternativa B está correta.</p><p>Um único espermograma não é diagnóstico definitivo da qualidade</p><p>seminal, uma vez que diferentes amostras de um mesmo paciente</p><p>podem apresentar variações e sofrer alterações devido à ação de</p><p>fatores externos. O período de abstinência indicado é de 2 a 7 dias.</p><p>A amostra passará por uma análise macroscópica, que consiste na</p><p>verificação da presença de coágulos, liquefação, viscosidade,</p><p>aspecto, cor, pH, e volume seminal. Já na avaliação microscópica,</p><p>observamos a concentração, motilidade dos espermatozoides e</p><p>concentração de células redondas.</p><p>Questão 2</p><p>As técnicas de preparo seminal nos permitem preparar uma</p><p>amostra com maior concentração de espermatozoides e com</p><p>melhor motilidade, e retirar as células germinativas, debris e</p><p>espermatozoides inviáveis.</p><p>Qual processamento realizamos em uma amostra com volume de</p><p>3,0mL, viscosidade normal, pH 7,2, liquefação completa de 30</p><p>minutos, com concentração de 120 milhões /mL, 74% de motilidade</p><p>progressiva, sendo que o paciente possui sorologia de HIV</p><p>reagente?</p><p>E É indicada abstinência de 10 dias.</p><p>A Gradiente de densidade</p><p>B Swim-up +Lavagem</p><p>C Lavagem</p><p>D Swim-up + Gradiente</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 33/67</p><p>Parabéns! A alternativa E está correta.</p><p>Como o paciente possui HIV, realizamos o processamento para</p><p>casais sorodiscordantes, no qual a principal preocupação é a</p><p>retirada de todo o plasma seminal, para que não haja carga viral na</p><p>amostra. Outro detalhe importante é que se trata de uma amostra</p><p>com boa qualidade, ou seja, conseguimos realizar todos os</p><p>processamentos.</p><p>Assim para pacientes com carga viral positiva, realiza-se um</p><p>gradiente descontínuo de densidade, com dupla lavagem do pellet</p><p>em meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um</p><p>swim-up, dependendo da qualidade seminal.</p><p>2 - Laboratório de embriologia e técnicas de fertilização in</p><p>vitro</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de fertilização in vitro</p><p>Punção ovariana</p><p>Sabemos que as técnicas de alta complexidade são definidas pela</p><p>necessidade de manipulação de oócitos e embriões em laboratório, mas</p><p>E Gradiente + lavagem + lavagem + Swim-up</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 34/67</p><p>você sabe como são obtidos os oócitos?</p><p>Após a estimulação ovariana controlada, ocorre a punção ovariana com</p><p>aspiração folicular para obtenção dos oócitos. Com a paciente sedada e</p><p>em posição ginecológica, o médico utiliza um transdutor de ultrassom</p><p>transvaginal com um guia acoplado.</p><p>O ultrassom permite localizar os ovários e visualizar os folículos em seu</p><p>interior, enquanto o guia permite o movimento controlado de uma longa</p><p>agulha, com a qual o médico puncionará cada folículo para aspirar todo</p><p>o líquido nele contido, tendo em mente que, teoricamente, cada folículo</p><p>contém um oócito.</p><p>Saiba mais</p><p>É possível não encontrarmos oócito em alguns folículos, seja porque ele</p><p>não se soltou da parede folicular e, por isso, não foi aspirado ou porque</p><p>o folículo realmente não continha oócito. Em alguns casos, pode ocorrer</p><p>o que chamamos de Síndrome do Folículo Vazio, quando nenhum ou a</p><p>maioria dos folículos não fornece oócito algum. Essa síndrome pode ter</p><p>várias causas, sendo a maioria ligada à medicação da estimulação</p><p>ovariana controlada.</p><p>Ilustração 3D do processo de aspiração folicular.</p><p>Existem sistemas diferentes de aspiração folicular: com seringas</p><p>(manualmente) ou com bombas de aspiração automática.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 35/67</p><p>Independentemente da técnica utilizada, uma vez aspirado, o líquido</p><p>folicular é encaminhado ao laboratório de embriologia para ser</p><p>analisado pelo embriologista.</p><p>Quando analisamos o líquido folicular (em uma placa, como na figura a</p><p>seguir), buscamos o complexo cumulus-oophorus (CCO), que, a olho nu,</p><p>se apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante à</p><p>clara de ovo.</p><p>A análise é feita com auxílio de um estereomicroscópio (ou “lupa”) e,</p><p>com ele, conseguimos visualizar o oócito no interior do CCO.</p><p>Uma vez verificada a presença de oócito, com uma pipeta Pasteur de</p><p>vidro, transferimos esse CCO para outra placa contendo meio de cultivo</p><p>tamponado, na qual ficarão todos os CCOs identificados até o término</p><p>da análise de todo o líquido folicular aspirado pelo médico.</p><p>Punção ovariana com esteroscoópio.</p><p>Uma vez finalizada a análise dos líquidos foliculares, os CCOs são</p><p>trocados de placa, sendo, agora, colocados em uma com meio de</p><p>cultivo não tamponado, para serem incubados até a hora da denudação</p><p>enzimática/ mecânica ou da FIV convencional.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 36/67</p><p>Fertilização in vitro (FIV) convencional</p><p>A FIV convencional é feita duas horas (h) após a punção oocitária e</p><p>consiste em colocar os CCOs em contato com os espermatozoides</p><p>recuperados após processamento seminal, em placa e meio de cultivo</p><p>específicos.</p><p>Não existe consenso sobre uma concentração ideal de espermatozoides</p><p>na amostra capacitada a ser utilizada na FIV convencional, mas os</p><p>profissionais costumam trabalhar com valores entre 50 e 500 mil</p><p>espermatozoides/mL, a depender da quantidade de CCOs a serem</p><p>inseminados.</p><p>Por necessitar de uma quantidade mínima razoável de espermatozoides</p><p>pós-capacitação, com boa motilidade, não é um procedimento indicado</p><p>em casos</p><p>de fator masculino severo.</p><p>E como ocorre a fecundação nesta técnica?</p><p>A fecundação ocorre</p><p>similarmente à natural, com as</p><p>células da granulosa (que fazem</p><p>parte do CCO) desempenhando</p><p>papel fundamental na seleção do</p><p>espermatozoide que conseguirá</p><p>fertilizar o oócito — motivo pelo</p><p>qual elas não são retiradas.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 37/67</p><p>Denudação oocitária</p><p>A denudação do oócito nada mais é do que a retirada das células do</p><p>cumulus e da corona radiata, o que permite a verificação do estágio de</p><p>maturação oocitária. É feita em duas etapas: química e mecânica.</p><p>A etapa química da denudação simula o que aconteceria na fecundação</p><p>natural: lavamos os CCOs em uma solução de hialuronidase, que,</p><p>naturalmente, seria liberada pelo acrossomo do espermatozoide.</p><p>Corona radiata</p><p>Células da corona radiada são aquelas células mais internas do cumulus,</p><p>imediatas à zona pelúcida.</p><p>No dia seguinte à coincubação</p><p>dos gametas, procedemos com</p><p>a denudação dos óvulos para</p><p>verificar se a fertilização</p><p>ocorreu. Um zigoto corretamente</p><p>fertilizado, como já vimos, deve</p><p>apresentar dois pró-núcleos e</p><p>dois corpúsculos polares entre</p><p>16 e 18h após a fecundação.</p><p>Aqueles que apresentarem</p><p>fertilização incorreta são</p><p>descartados, enquanto os outros</p><p>são mantidos em cultivo para</p><p>que possamos acompanhar seu</p><p>desenvolvimento até o momento</p><p>da criopreservação ou</p><p>transferência.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 38/67</p><p>Denudação oocitária com pipetador stripper.</p><p>Como consequência dessa lavagem, as interações celulares são</p><p>enfraquecidas e as células do cumulus se dissolvem. Dessa forma, as</p><p>poucas células restantes do cumulus e as da corona radiata são</p><p>retiradas de forma mecânica.</p><p>Para isso, utiliza-se um pipetador, chamado stripper, ao qual acoplamos</p><p>capilares com pontas bem finas (135 - 170µm de diâmetro) e, com eles,</p><p>fazemos rápidos movimentos de sugar e soltar os oócitos, passando-os</p><p>por diversas gotas de meio de cultivo tamponado, até vermos com</p><p>clareza a zona pelúcida, o espaço perivitelínico (que, nos oócitos</p><p>maduros, contém o corpúsculo polar) e o citoplasma oocitário.</p><p>Após a etapa de denudação, os oócitos imaturos são descartados e os</p><p>maduros podem ser criopreservados ou submetidos à ICSI.</p><p>Fertilização in vitro com ICSI</p><p>A FIV com ICSI é realizada aproximadamente 4h após a punção</p><p>ovariana, podendo haver variação nesse tempo de acordo com o</p><p>protocolo de cada clínica.</p><p>Para tal procedimento, preparamos uma placa específica com pequenas</p><p>gotas de meio tamponado, na qual são colocados os oócitos maduros, e</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 39/67</p><p>uma gota de PVP, na qual é colocada uma pequena alíquota da amostra</p><p>contendo os espermatozoides capacitados.</p><p>Essas gotas são cobertas com óleo mineral ou de parafina, de uso</p><p>específico para laboratórios de reprodução assistida, para evitar</p><p>evaporação dos meios. Essa placa é, então, levada ao microscópio com</p><p>sistema micromanipulador, em cujos suportes acoplamos microagulhas</p><p>que nos permitem manipular os gametas com precisão.</p><p>PVP</p><p>É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se</p><p>movimentem mais lentamente.</p><p>Micromanipulador.</p><p>Esse microscópio nos permite um aumento de até 400x, o que nos</p><p>auxilia na avaliação da morfologia dos espermatozoides para sua</p><p>seleção. Apesar disso, alguns profissionais preferem trabalhar com</p><p>aumento de 200x, por oferecer um campo mais amplo de visão.</p><p>Mas qual é o jeito correto para fazermos esta avaliação?</p><p>Resposta</p><p>Não existe certo ou errado ‒ como estamos vendo, os protocolos podem</p><p>variar entre as clínicas e o modo de trabalho de cada profissional, em</p><p>várias etapas ‒, o importante é que o método de escolha seja validado</p><p>para a aplicação na rotina.</p><p>O sistema de micromanipulação pode ter injetores pneumáticos (cuja</p><p>regulação dos movimentos é à base de ar) ou hidráulicos (que usam</p><p>óleo para regular os movimentos). Os injetores regulam a pressão de</p><p>aspiração/ejeção das microagulhas.</p><p>O sistema de micromanipulação tem dois sistemas injetores, um de</p><p>cada lado: de um lado, conectamos a microagulha de holding; com</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 40/67</p><p>diâmetro maior, vai estabilizar o oócito na posição correta para ser</p><p>injetado; do outro lado, conectamos a agulha de injeção, com diâmetro</p><p>menor e um bisel na ponta, e que será usada para quebrar a cauda dos</p><p>espermatozoides, aspirá-los e injetá-los nos oócitos.</p><p>Detalhe com as agulhas do micromanipulador.</p><p>O oócito deve ser posicionado de forma que o corpúsculo polar fique</p><p>para cima ou para baixo (na posição de 12h ou 6h), porque,</p><p>teoricamente, o fuso meiótico estaria na porção citoplasmática próxima</p><p>ao local em que o corpúsculo foi expulso. Qualquer perturbação no fuso</p><p>meiótico poderia ser prejudicial à conclusão da meiose e ao posterior</p><p>desenvolvimento do zigoto.</p><p>Dessa forma, essas posições oferecem menos risco de interferência no</p><p>fuso quando a agulha de injeção entra no oócito. Após a ICSI, os óvulos</p><p>são transferidos para uma placa com gotas de meio de cultivo não</p><p>tamponado com pH e temperatura previamente equilibrados, e voltam</p><p>para a incubadora.</p><p>Saiba mais</p><p>A ICSI possibilita a fertilização do oócito em casos de fator masculino</p><p>grave, uma vez que só precisamos de um espermatozoide para ser</p><p>injetado no interior de cada oócito.</p><p>Cultivo embrionário</p><p>Após o procedimento de fertilização in vitro, os óvulos voltam à</p><p>incubadora e ali permanecem até o dia da transferência ou</p><p>criopreservação embrionária. A função das incubadoras é mimetizar as</p><p>condições das trompas e cavidade uterinas, que seriam o local de</p><p>fertilização e desenvolvimento embrionário em condições naturais.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 41/67</p><p>O gás que supre as incubadoras ‒ seja apenas gás carbônico ou uma</p><p>mistura desse gás com oxigênio e nitrogênio ‒ tem a função de regular o</p><p>pH do meio de cultivo, proporcionando aos embriões um pH semelhante</p><p>ao do ambiente uterino. Para regular o pH do meio, regulamos a</p><p>porcentagem de gás injetado na incubadora.</p><p>Quando aumentamos a concentração de gás, ao reagir com os</p><p>componentes do meio de cultivo, ele o torna ácido, diminuindo seu pH;</p><p>quando diminuímos a concentração de gás, o pH do meio aumenta.</p><p>Existem diferentes tipos de incubadoras: verticais, de bancada, secas,</p><p>úmidas, monogás, trigás, com sistema de monitoramento ou sem.</p><p>Vamos, agora, conhecer as principais.</p><p>Incubadoras verticais</p><p>Incubadora vertical.</p><p>As incubadoras verticais são mais antigas, mas ainda utilizadas em</p><p>muitos laboratórios. Apesar das incubadoras verticais oferecerem mais</p><p>espaço para acomodar placas, são mais instáveis, uma vez que</p><p>possuem apenas uma porta e, ao abri-la, o ambiente de todas as placas</p><p>é influenciado.</p><p>Além disso, a limpeza das incubadoras verticais é demorada e requer</p><p>que elas sejam desmontadas para que todas as peças sejam lavadas</p><p>individualmente.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 42/67</p><p>Incubadoras de bancada</p><p>Já as incubadoras de bancada ocupam menos espaço e sua</p><p>manutenção é mais rápida e simples, motivo pelo qual elas vêm sendo a</p><p>opção mais escolhida atualmente. Além disso, a limpeza das</p><p>incubadoras de bancada não requer retirada de peças.</p><p>Incubadoras de bancada - trigás.</p><p>Essas incubadoras, ainda que possuam modelos diferentes, costumam</p><p>ter nichos separados e se estabilizam mais rapidamente após a abertura</p><p>das tampas.</p><p>Incubadoras</p><p>de bancada com time-lapse</p><p>As incubadoras com sistema de monitoramento (sistema de time-lapse)</p><p>são as mais modernas (e mais caras) e, apesar de seu uso ser bastante</p><p>comum nas clínicas dos países de primeiro mundo, no Brasil, ainda</p><p>ocupam um tímido espaço no mercado.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 43/67</p><p>Incubadora de bancada com time-lapse.</p><p>As incubadoras com time-lapse são incubadoras de bancada com</p><p>câmeras internas acopladas que registram o desenvolvimento dos</p><p>embriões, fotografando-os a cada período determinado</p><p>(aproximadamente 10 minutos).</p><p>Assim, forma-se um vídeo do desenvolvimento embrionário que nos</p><p>permite analisar cada etapa do processo. Essas incubadoras têm placas</p><p>especiais de cultivo, projetadas de forma que os embriões permaneçam</p><p>dentro do campo de abrangência da câmera, permitindo que as fotos</p><p>sempre compreendam a totalidade do embrião, para que nenhum</p><p>detalhe seja perdido.</p><p>Saiba mais</p><p>As incubadoras com time-lapse, geralmente, possuem programas</p><p>próprios que nos permitem marcar o horário em que cada evento</p><p>aconteceu ao analisar o vídeo: por exemplo, podemos registrar o</p><p>momento de aparecimento e desaparecimento dos pró-núcleos, da</p><p>primeira divisão celular, de início e término da compactação, de início da</p><p>formação do blastocele, entre outros.</p><p>Como foi dito, a maioria das clínicas brasileiras possui incubadoras sem</p><p>sistema de monitoramento. Dessa forma, para acompanharmos o</p><p>desenvolvimento embrionário, é necessário retirar a placa da incubadora</p><p>e levá-la ao microscópio. Assim, observamos e anotamos cada estágio</p><p>pontualmente.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 44/67</p><p>Lembrando que, nessas placas, os embriões se encontram em meio de</p><p>cultivo não tamponado; por isso, o procedimento de observação deve</p><p>ser rápido (menos de dois minutos, idealmente) para não desestabilizar</p><p>as condições de pH e temperatura nas quais os embriões se encontram.</p><p>As observações estáticas não nos permitem saber o que aconteceu</p><p>previamente ao que estamos observando, por exemplo: se, ao avaliar a</p><p>fertilização, o zigoto apresenta apenas um pró-núcleo, não temos como</p><p>saber se é apenas um caso de assincronia, de singamia, ou se,</p><p>realmente, só houve aparição de um pró-núcleo.</p><p>Essa é uma vantagem do sistema de monitoramento que nos permitiria</p><p>esclarecer essa dúvida ao analisarmos os registros feitos, que nos</p><p>oferecem observação dinâmica.</p><p>Como nosso objetivo é tirar os embriões das incubadoras, o mínimo</p><p>possível para não os expor às condições ambientes, fazemos</p><p>observações estáticas em momentos críticos do desenvolvimento:</p><p>Observações estáticas</p><p>Aquelas que fazemos apenas quando retiramos a placa da incubadora e</p><p>observamos os embriões ao microscópio.</p><p>Assincronia</p><p>Assincronia da aparição dos pró-núcleos é quando os pró-núcleos feminino</p><p>e masculino aparecem em tempos diferentes.</p><p>Singamia</p><p>União dos pró-núcleos, formando um envoltório nuclear único.</p><p>Observação dinâmica</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 45/67</p><p>É aquela oferecida pelo sistema de monitoramento de time-lapse, em que</p><p>vemos um vídeo do desenvolvimento, e não apenas uma “foto" de um</p><p>momento pontual.</p><p>No primeiro dia (D1)</p><p>Para verificar se a</p><p>fertilização ocorreu</p><p>corretamente</p><p>No terceiro (D3) e no</p><p>quinto dia (D5)</p><p>Caso o cultivo seja até o</p><p>estágio de blastocisto.</p><p>Situações especiais incluem observação no segundo dia (D2) ‒</p><p>geralmente se o cultivo for até D3, para termos mais dados sobre a</p><p>evolução do embrião ‒ e no sexto ou sétimo (D6/ D7), caso o embrião</p><p>não tenha alcançado o estágio de blastocisto no quinto dia.</p><p>Saiba mais</p><p>É incomum observarmos o quarto dia de desenvolvimento, a não ser que</p><p>seja necessário obter mais informações, a fim de tomar alguma decisão</p><p>sobre transferência ou criopreservação. Não é incomum que os</p><p>embriões atrasem um pouco seu desenvolvimento e acabem</p><p>alcançando o estágio de blastocisto expandido no sexto ou ‒ apesar de</p><p>menos frequente ‒ sétimo dia de cultivo.</p><p>Transferência embrionária</p><p>A última etapa do tratamento de fertilização in vitro que envolve o</p><p>laboratório é a transferência embrionária. Para esse procedimento, os</p><p>embriões a serem transferidos se encontram, inicialmente, em uma</p><p>placa com meio de cultivo, que permanece na incubadora até o</p><p>momento da transferência.</p><p>O preparo da paciente para a transferência embrionária requer que ela</p><p>esteja com a bexiga cheia para ajudar no posicionamento e visualização</p><p>do útero. Na anatomia feminina sem alterações, o útero é anterovertido</p><p>e localizado atrás da bexiga. Quando a bexiga enche, "empurra" o útero,</p><p>deixando-o mais alinhado com o canal vaginal, o que facilita a</p><p>passagem do cateter contendo o(s) embrião(ões).</p><p>Anterovertido</p><p></p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 46/67</p><p>Flexionado para a “frente" do corpo, sobre a bexiga, formando um ângulo de</p><p>aproximadamente 90º com o canal vaginal.</p><p>Útero em posição normal (anterovertido).</p><p>A transferência embrionária não requer sedação, salvo alguma</p><p>indicação médica específica. A paciente é preparada em posição</p><p>ginecológica e, com auxílio de ultrassonografia abdominal, o médico</p><p>insere um fino cateter guia pelo canal vaginal, atravessando o colo</p><p>uterino e posicionando-o, por fim, a alguns centímetros do fundo do</p><p>útero.</p><p>Atenção!</p><p>Apesar de, em geral, ser um procedimento rápido e indolor, a paciente</p><p>pode sentir uma leve cólica durante o posicionamento do cateter-guia,</p><p>especialmente durante a passagem pelo colo do útero e, principalmente,</p><p>se houver estenose. Também pode ser um procedimento incômodo e</p><p>um pouco mais demorado se a anatomia uterina for alterada.</p><p>Estenose</p><p>Estreitamento do colo do útero, colo muito “fechado”. Em alguns casos, é</p><p>necessário dilatar o colo com um aparelho especial para permitir a</p><p>passagem do cateter.</p><p>Uma vez que o cateter-guia esteja devidamente posicionado, é o</p><p>momento do embriologista trazer o cateter interno contendo os</p><p>embriões a serem transferidos. Esse cateter passa por dentro do</p><p>cateter-guia previamente posicionado e avança um pouco mais, ficando</p><p>a aproximadamente 1cm de distância do fundo uterino, local onde os</p><p>embriões serão depositados.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 47/67</p><p>Se os embriões forem depositados muito próximos ao fundo do útero, o</p><p>risco de gravidez ectópica aumenta; por isso, a distância de</p><p>aproximadamente 1cm é recomendada.</p><p>Gravidez ectópica</p><p>É definida pela implantação do embrião em local que não seja a cavidade</p><p>uterina. O local mais comum de se ocorrer gravidez ectópica é nas trompas</p><p>de Falópio, mas também pode ocorrer no cérvix (colo), ovários e até mesmo</p><p>no abdômen, fora do útero. O feto não sobrevive à gravidez ectópica.</p><p>Embriologista carregando um cateter para transferência embrionária.</p><p>No laboratório, o embriologista lava o cateter com meio de cultivo,</p><p>aspirando o meio com uma seringa de 1mL, acoplando-a ao cateter e</p><p>pressionando seu êmbolo, para que o meio corra por dentro do cateter.</p><p>Uma vez terminada essa etapa de lavagem (que é opcional e pode variar</p><p>de acordo com o protocolo local), a seringa permanece acoplada no</p><p>cateter e, para carregar os embriões, o embriologista deve pegar na</p><p>incubadora a placa na qual eles estão contidos e aspirá-los na</p><p>extremidade do cateter oposta à qual a seringa está acoplada. O cateter</p><p>contendo os embriões é, então, levado até o médico.</p><p>Após o devido posicionamento do cateter trazido pelo embriologista, o</p><p>médico (ou o embriologista, a depender do protocolo local) pressiona a</p><p>seringa delicadamente para</p><p>depositar os embriões no local desejado.</p><p>Apesar de haver diferenças nos protocolos de carregamento do cateter,</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 48/67</p><p>é costumeiro deixar uma pequena bolha de ar antes e/ou depois dos</p><p>embriões.</p><p>Isso é feito porque o ar, quando visualizado no ultrassom, fica</p><p>branco, o que ajuda a referenciar a posição dos embriões no</p><p>útero após a transferência, uma vez que os embriões em si não</p><p>podem ser visualizados na imagem do ultrassom.</p><p>Terminada a transferência, o cateter é retirado e entregue ao</p><p>embriologista, que o levará ao laboratório para verificar se os embriões</p><p>não ficaram grudados no cateter. Caso isso aconteça, o processo é</p><p>refeito e os embriões são transferidos novamente.</p><p>A transferência embrionária pode ser realizada no ciclo a fresco ou em</p><p>um ciclo com embriões descongelados e preparo endometrial</p><p>específico. O estágio de desenvolvimento dos embriões a serem</p><p>transferidos varia de acordo com o caso. Essa é uma decisão conjunta</p><p>da equipe médica e de embriologistas, que vão sugerir a melhor conduta</p><p>em cada caso, respeitando, claro, a decisão dos pacientes.</p><p>Transferência embrionária</p><p>Neste vídeo, a especialista explica os detalhes da transferência</p><p>embrionária.</p><p>E você sabe por que isso é feito? </p><p></p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 49/67</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>Os oócitos são obtidos por punção ovariana com aspiração do</p><p>líquido folicular. Uma vez aspirado, o líquido folicular é</p><p>encaminhado ao laboratório de embriologia para ser analisado pelo</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 50/67</p><p>embriologista. O que o embriologista procura identificar no líquido</p><p>folicular?</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>No líquido folicular, o embriologista identifica o oócito envolto pelas</p><p>células da granulosa, CCO (complexo cumulus-oophorus), que se</p><p>apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante à</p><p>clara de ovo.</p><p>As células da granulosa (que fazem parte do CCO) desempenham</p><p>papel fundamental na seleção do espermatozoide que conseguirá</p><p>fertilizar o oócito.</p><p>Questão 2</p><p>Os tratamentos de reprodução assistida podem ser de alta ou baixa</p><p>complexidade. Um dos tratamentos de alta complexidade é</p><p>caracterizado por injetar um único espermatozoide no interior de</p><p>cada oócito maduro, sendo este previamente denudado. Sobre esse</p><p>procedimento, considere as afirmativas a seguir:</p><p>I- Trata-se do procedimento de FIV com ICSI.</p><p>II- Para esse procedimento, costuma-se posicionar o oócito com o</p><p>corpúsculo polar na posição de 3h ou 9h, para que o</p><p>espermatozoide não seja injetado de uma forma que perturbe o</p><p>fuso meiótico.</p><p>A Oócitos sem células à sua volta</p><p>B Óvulos</p><p>C Complexo cumulus-oophorus</p><p>D Embriões</p><p>E Apenas células da granulosa oocitária</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 51/67</p><p>III- Para esse procedimento, não é necessário nenhum equipamento</p><p>específico além da lupa (estereomicroscópio).</p><p>IV- Qualquer perturbação no fuso meiótico poderia ser prejudicial à</p><p>conclusão da meiose e ao posterior desenvolvimento do zigoto.</p><p>Estão corretas as afirmativas:</p><p>Parabéns! A alternativa B está correta.</p><p>Para a FIV com ICSI, o oócito deve ser posicionado com o</p><p>corpúsculo polar para cima ou para baixo (posição das 12h ou 6h),</p><p>sendo necessário um sistema de micromanipulação e microscópio</p><p>com aumento de 200-400x. Portanto, as afirmativas I e IV estão</p><p>corretas.</p><p>A I, II e III</p><p>B I e IV</p><p>C II e III</p><p>D I, II e IV</p><p>E II e IV</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 52/67</p><p>3 - Técnicas especiais empregadas no laboratório de</p><p>embriologia</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as técnicas especiais empregadas no</p><p>laboratório de embriologia clínica.</p><p>Técnicas alternativas de obtenção de</p><p>espermatozoides</p><p>Até agora falamos sobre pacientes que possuem espermatozoides no</p><p>ejaculado; porém, existem os pacientes azoospermicos, ou seja, que</p><p>apresentam ausência de espermatozoides no ejaculado.</p><p>Os casos de azoospermia podem ser classificadas como azoospermia</p><p>não obstrutiva ou azoospermia obstrutiva.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 53/67</p><p>Azoospermia obstrutiva</p><p>Nestes casos, a</p><p>espermatogênese e os</p><p>níveis hormonais de</p><p>FSH, LH e testosterona</p><p>são normais. O que</p><p>ocorre é a obstrução no</p><p>sistema de dutos de</p><p>transporte dos</p><p>espermatozoides,</p><p>impedindo a passagem</p><p>desses gametas. Pode</p><p>ser causada por</p><p>vasectomia, traumas,</p><p>epididimites, cirurgias</p><p>inguinais, entre outras</p><p>causas.</p><p>Azoospermia não</p><p>obstrutiva</p><p>Nestes casos não</p><p>ocorre a</p><p>espermatogênese.</p><p>É indicativo de que, em</p><p>algum momento, houve</p><p>uma agressão ao</p><p>testículo — como a</p><p>varicocele, orquite,</p><p>criptorquidia,</p><p>quimioterapia, entre</p><p>outras causas.</p><p>Vasectomia</p><p>Cirurgia de esterilização masculina, na qual o médico corta os ductos</p><p>deferentes, responsáveis por levar os espermatozoides dos testículos ao</p><p>pênis.</p><p>Epididimites</p><p>Inflamações no epidídimo.</p><p>Nesses casos de azoospermia no ejaculado, uma alternativa é tentar a</p><p>obtenção de espermatozoides por métodos cirúrgicos. Dentre os</p><p>métodos de recuperação cirúrgica de espermatozoides, encontram-se:</p><p>Neste método, também conhecido como PESA (na abreviação do</p><p>termo em inglês), o epidídimo é puncionado com uma pequena</p><p>agulha e seringa para retirada dos espermatozoides.</p><p></p><p>Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo </p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 54/67</p><p>Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de PESA.</p><p>É no epidídimo que os espermatozoides completam sua</p><p>maturação; por isso, é a técnica mais utilizada em casos de</p><p>azoospermia obstrutiva ou vasectomia.</p><p>A técnica conhecida como MESA (na abreviação em inglês)</p><p>segue o mesmo princípio da PESA, porém com um grau maior de</p><p>complexidade, uma vez que o urologista utiliza um microscópio</p><p>para localizar os espermatozoides no epidídimo. Essa técnica é</p><p>utilizada em casos especiais, como epidídimos de volume</p><p>reduzido.</p><p>A figura ilustra a ampliação do epidídimo, local em que os espermatozoides são</p><p>coletados por aspiração.</p><p>Esta técnica, conhecida como TESA (na abreviação em inglês), é</p><p>indicada em casos de azoospermia obstrutiva e não obstrutiva,</p><p>impossibilidade de ejaculação e ausência de espermatozoides</p><p>em amostras do epidídimo, esta técnica consiste em aspirar</p><p>parênquima testicular.</p><p>Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do</p><p>Epidídimo </p><p>Aspiração de Espermatozoides do Testículo </p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 55/67</p><p>Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de TESA.</p><p>A amostra aspirada segue para o laboratório, onde é feita a</p><p>dissecção dos túbulos seminíferos para confirmar a presença de</p><p>espermatozoides. Também está indicada nos casos de suspeita</p><p>de defeito de maturação dos espermatozoides (que ocorre no</p><p>epidídimo).</p><p>Esta técnica, conhecida como TESE (na abreviação em inglês),</p><p>também é utilizada para obtenção de parênquima testicular</p><p>(como na TESA). Nesse método é feita a biópsia de um pequeno</p><p>fragmento de parênquima testicular, retirado com pinça ou</p><p>tesoura, após pequenas incisões.</p><p>Esquema mostrando a biopsia do tecido - extração de um pequeno fragmento de</p><p>parênquima testicular durante</p><p>a TESE.</p><p>O fragmento retirado segue o mesmo processamento</p><p>laboratorial que a TESA, ou seja, é dissecado até que permita a</p><p>visualização dos túbulos seminíferos.</p><p>A técnica conhecida como micro-TESE (na abreviação em</p><p>inglês), é semelhante à TESE. Seu diferencial é que esta técnica</p><p>Extração de Espermatozoides do Testículo </p><p>Extração de Espermatozoides do Testículo por</p><p>Microdissecção </p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 56/67</p><p>utiliza um microscópio cirúrgico que permite melhor visualização</p><p>dos túbulos seminíferos e identificação das áreas com maior</p><p>probabilidade de produção ativa de espermatozoides</p><p>(espermatogênese).</p><p>Microdissecção do testicular realizada na Micro-TESE. A espermatogênese</p><p>provavelmente é mais ativa na imagem superior.</p><p>Azoospermia obstrutiva</p><p>Causada por alguma obstrução nos canais do sistema reprodutor</p><p>masculino, que impediria a passagem e ejaculação dos gametas.</p><p>Nos casos de PESA ou MESA, podemos realizar a técnica de sperm</p><p>wash na amostra, a fim de concentrar os espermatozoides. Nessas</p><p>técnicas geralmente são encontrados poucos espermatozoides, e com</p><p>baixa motilidade. Quando há necessidade de realizar essas técnicas</p><p>para a obtenção dos espermatozoides, realiza-se obrigatoriamente a</p><p>ICSI.</p><p>Nessas amostras, também podemos realizar o teste hiposmótico (HOS).</p><p>Nesse caso, com o auxílio da agulha de ICSI, colocamos somente a</p><p>cauda do espermatozoide na solução e verificamos se ocorre o inchaço</p><p>seguido de uma curvatura na cauda, indicando viabilidade celular.</p><p>Outro teste que podemos realizar nessas amostras é o teste de</p><p>flexibilização da cauda. Com o auxílio de uma agulha de ICSI,</p><p>manipulamos a cauda do espermatozoide para cima e para baixo: os</p><p>espermatozoides que obtiverem um movimento da cauda independente</p><p>da cabeça podem ser utilizados.</p><p>Quando há movimento de toda a estrutura do espermatozoide,</p><p>considera-se o espermatozoide inviável para o procedimento.</p><p>Técnicas alternativas de seleção</p><p>espermática</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 57/67</p><p>Existem algumas técnicas para seleção de espermatozoides que se</p><p>baseiam em características específicas. Vamos conhecê-las?</p><p>PICSI</p><p>Abreviação do termo em inglês que designa Injeção</p><p>Intracitoplasmática Fisiológica de Espermatozoide, essa técnica</p><p>tem por objetivo selecionar espermatozoides teoricamente livres</p><p>de fragmentação de DNA. Um alto índice de fragmentação do</p><p>DNA espermático pode reduzir as chances de gravidez, causar</p><p>abortos ou síndromes genéticas.</p><p>Para sua realização, os espermatozoides são colocados em uma</p><p>placa específica contendo ácido hialurônico. O princípio é que</p><p>espermatozoides maduros se ligariam ao ácido. Entretanto, não</p><p>existem estudos comprovando que espermatozoides maduros</p><p>apresentam menores índices de fragmentação em seu DNA.</p><p>Dessa forma, é necessário que mais estudos sobre essa relação</p><p>sejam realizados, uma vez que até o momento eles não mostram</p><p>diferenças significativas nas taxas de nascidos vivos com</p><p>espermatozoides selecionados por PICSI ou por ICSI.</p><p>Super ICSI/ IMSI</p><p>Seleciona espermatozoides baseando-se em sua morfologia, eles</p><p>são analisados e escolhidos pelo embriologista com ajuda de</p><p>uma magnificação de 6000 vezes — aproximadamente 10 vezes</p><p>mais do que em uma ICSI comum.</p><p>Apesar dessa alta magnificação proporcionada, essa tecnologia</p><p>não garante que o espermatozoide selecionado será</p><p>geneticamente saudável, uma vez que não é possível verificar sua</p><p>carga genética, apenas sua morfologia.</p><p>Micro�uídica</p><p>Atualmente com uso crescente no mercado, essa técnica é</p><p>baseada na capacidade dos espermatozoides de nadarem</p><p>através de microcanais. Dessa forma, seleciona espermatozoides</p><p>baseando-se em sua morfologia e motilidade, sem os efeitos</p><p>negativos causados pela centrifugação. Também tem se</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 58/67</p><p>mostrado eficiente em selecionar espermatozoides com DNA</p><p>íntegro.</p><p>Saiba mais</p><p>A centrifugação — necessária em técnicas como gradiente de densidade</p><p>e sperm wash — tem efeito prejudicial na integridade espermática,</p><p>especialmente por aumentar os índices de fragmentação de DNA.</p><p>Técnicas alternativas de seleção</p><p>espermática</p><p>Neste vídeo, a especialista apresenta as principais alternativas de</p><p>seleção espermática, demonstrando seu passo a passo, aplicação e</p><p>vantagens e desvantagens.</p><p>Assisted Hatching (Eclosão Assistida)</p><p>Já comentamos sobre esse termo em momentos anteriores, mas agora</p><p>vamos retomá-lo e explicá-lo com mais detalhes.</p><p>Na fecundação natural, o oócito é fertilizado nas trompas, vai se</p><p>dividindo e multiplicando suas células enquanto se desloca em direção</p><p>ao útero. Quando chega na cavidade uterina, por volta do quinto dia de</p><p>desenvolvimento, rompe a zona pelúcida e o trofoblasto começa a</p><p>invadir o endométrio, no processo chamado de nidação, que define o</p><p>início da implantação do embrião.</p><p>O rompimento da zona pelúcida (eclosão) ocorre porque, quando o</p><p>embrião atinge o estágio de blastocisto, ele continua multiplicando suas</p><p>células e aumentando o tamanho da blastocele. Esse aumento do</p><p>tamanho do embrião, como um todo, vai pressionando a zona pelúcida</p><p>por dentro, que vai afinando até o momento da eclosão.</p><p></p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 59/67</p><p>Também é comum que o embrião passe por algumas contrações e</p><p>reexpansões para auxiliar o processo de eclosão. É assim que o</p><p>trofoblasto fica livre para iniciar o processo de implantação.</p><p>Contudo, em alguns casos, a zona pelúcida pode apresentar condições</p><p>que dificultam seu afinamento e eclosão do embrião. Isso acontece, por</p><p>exemplo, em embriões desvitrificados, uma vez que o processo de</p><p>criopreservação “endurece" a zona pelúcida, de modo que ela perde sua</p><p>“elasticidade" e, portanto, o embrião tem mais dificuldade para eclodir.</p><p>Nesse caso, pode ser que ele precise de um número maior de</p><p>contrações e reexpansões do que precisaria naturalmente — gastando</p><p>mais energia celular, o que pode ser prejudicial no momento da</p><p>implantação (outro processo que requer energia) — e, às vezes, pode</p><p>nem conseguir eclodir, o que resultaria em impossibilidade de</p><p>implantação, uma vez que o trofoblasto precisa estar exposto para</p><p>iniciar a nidação no endométrio.</p><p>Zonas pelúcidas mais espessas, escuras ou densas que o ideal, também</p><p>prejudicam a eclosão embrionária.</p><p>Assim sendo, nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente</p><p>características que possam ser prejudiciais à eclosão, realizamos um</p><p>procedimento chamado de assisted hatching (AH), com o intuito de</p><p>facilitar a saída do embrião e, consequentemente, sua implantação.</p><p>Esse procedimento pode ser feito de três formas: química, mecânica e</p><p>com laser.</p><p> AH químico</p><p>Uma pequena abertura é feita na zona pelúcida,</p><p>com ácido de Tyrode.</p><p> AH mecânico</p><p>Também conhecido como dissecção parcial da</p><p>zona (PZD), esse método consiste em fazer uma</p><p>i i ã lú id íli d</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p><p>https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03010/index.html?brand=estacio# 60/67</p><p>Ilustração demonstrando o procedimento de AH.</p><p>Após o procedimento de AH, o embrião é transferido ao útero da</p><p>paciente, e agora conseguirá sair da zona pelúcida e se implantar no</p><p>endométrio mais facilmente.</p><p>pequena incisão na zona pelúcida, com auxílio de</p><p>microagulhas. Foi o primeiro método de AH</p><p>utilizado.</p><p> AH com laser</p><p>Método mais utilizado atualmente, consiste em</p><p>abrir um orifício na zona pelúcida do embrião com</p><p>auxílio de pulsos de laser. Para isso, é necessário</p><p>um equipamento especial acoplado ao</p><p>micromanipulador.</p><p>23/09/2024, 17:09 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida</p>