Amplificação in vitro de DNA

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Amplificação in vitro de DNA
Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações em
rotina laboratorial.
Prof.ª Camila Freze Baez
1. Itens iniciais
Propósito
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes formas e
entender quais são suas vantagens, desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o
profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho.
Objetivos
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro.
Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.
Introdução
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você já parou para
pensar como certas características físicas passam dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do
rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações transmitidas às gerações futuras dos
ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos:
o ácido desoxirribonucleico (ADN – também conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico
(ARN, ou RNA, em inglês).
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade viva conhecida
— a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA
para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente, em fita simples e mais
instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da maioria
das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande parte, é feita de
proteínas. O papel das proteínas não se limita apenas em traços físicos, mas também em funcionais.
Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria em um
ambiente extremamente complexo e controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao momento que a
célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas moléculas de DNA,
tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse processo.
Apesar de toda a complexidade da duplicação do DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos
trechos do DNA em um tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em
RNA, que é traduzido em proteína.
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1. Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos
Princípios da PCR concencional
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro relembrar algumas
informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA
quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e,
consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e
RNA. Mas como são esses tijolos?
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais
simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a
principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da
ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases
nitrogenadas:
Desoxirribonucleico
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que
está ausente.
Adenina (A) Citosina (C)
Guanina (G) Timina (T)
Para o RNA há uma diferença:
No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U).
Essas bases são as responsáveis pela informação genética.
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma das letras do
teclado do computador. Como seria possível entender a informação que você quis codificar? Agora, se você
escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado, usará um código binário. Isso
também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar,
em sequência, uma informação preciosa.
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são
capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose,
fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como fosfodiéster, sendo
considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são formadas. É
importante manter em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA – vamos
voltar a falar a respeito disso mais à frente.
Código binário
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como
computadores.
Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato,
desoxirribose e base nitrogenada.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5
deixam as bases nitrogenadas livres para interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo
oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo
com o número de anéis aromáticos que possuem:
Pirimidinas
(C, T, U) - Possuem um anel.
Purinas
(A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam com purinas, de acordo
com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para
interação, e C interage com G através de três cargas. Essas interações são chamadas de pontes de hidrogênio
e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e
químicos, como o pH.
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por complementariedade. Note as
pontes de hidrogênio duplas (seta verde) entre adenina e timina, e as triplas (seta preta) entre citosina e
guanina.
Pareamento de bases nitrogenadas.
No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e
garantem à molécula uma de suas características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa
complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do RNA, as polimerases, sabem qual
nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a
característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação 
semiconservada.
Semiconservada
Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita
filha). 
Atenção
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos
que uma das fitas se encontra com o carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda,
enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para
interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas
antiparalelas. Esse sentido de interação por complementariedade traz à tona outra característica do
DNA: sua replicação deve ser feita de forma semidescontínua (In vivo, apenas a fita no sentido
antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de
forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação). 
Reação em cadeiaVimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que a variação
cíclica de temperatura permite a desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de
acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita
simples de DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Essas
últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para podermos escolher qual a
melhor técnica para cada caso: para aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado; para síntese de
cDNA a partir de RNA polaridade positiva; para quantificação de DNA ou cDNA; e para diferenciação rápida
entre diferentes produtos de amplificação.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm em áreas da
ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e
prognóstico.
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma área
empolgante e que se torna, a cada dia, mais importante para diversas áreas das ciências biológicas.
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Academy, para mais detalhes e vídeos sobre replicação do DNA.
 
Assista ao vídeo 4. Teste de Paternidade, de Carlos Simeão, no Youtube. Você aprenderá mais sobre a
variabilidade genética estudada em análises forenses e em testes de paternidade.
 
Assista ao vídeo Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D, de Carlos Simeão, no Youtube.
Você irá conhecer o passo a passo da técnica de PCR.
 
Para conhecer mais sobre a história do PCR, leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela
polimerase (PCR).
 
Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR e as suas variações.
Referências
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out. 2020.
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CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. DBBM FIOCRUZ. Consultado na internet em: 18
out. 2020.
 
DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. Saúde & Ambiente em Revista, 2(2), p.
11-22, 2007.
 
NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.
 
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what does it mean for your
PCR? NEB. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
 
REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. ThermoFisher Scientific website.
Consultado na internet em: 18 out. 2020.
 
VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. Gene Quantification. Consultado na
internet em: 18 out. 2020.
 
ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-step tripletprimed PCR
and melting curve assay. PLoS ONE. Consultado na internet em: 18 out. 2020.pela polimerase: amplificando DNA in vitro
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o
DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos utilizar os
conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e
adaptação da técnica in vitro. Veja:
Complementariedade entre fitas antiparalelas
Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as
bases nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases
correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis
que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de
90ºC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas
fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem
e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla
se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo
funciona passo a passo mais à frente.
Síntese enzimática pela polimerase
Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro.
Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um
molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está
sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase
não inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita
dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou
adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a
fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por
outra enzima, chamada primase. 
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction –
PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima
termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas sequências de nucleotídeos em
fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são
chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, conhecidos
como primers, em inglês.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde
fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o
trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação fosfodiéster com o
carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela
5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido
5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a região do genoma a ser amplificada. Essa
informação é importante para dar especificidade à PCR!
Etapas da reação em cadeia da polimerase
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100ºC,
e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente
chamada de Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que
se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender
como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus
ingredientes básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos
esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.• 
Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.
A Taq polimerase, termorresistente.
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os
três fosfatos são usados como fonte de energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq
polimerase aconteça.
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.
Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da
temperatura do qual a PCR consiste. Vejamos:
A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo
aquecimento da reação a, pelo menos, 95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10
minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito
concentradas, superenoveladas e ser muito longas.
 
Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento
e extensão.
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos iniciadores à
sequência-alvo por complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.
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1. 
2. 
Ilustração das etapas da PCR.
Entenda melhor como acontecem estas etapas:
Desnaturação
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por cerca de 1 minuto. O
tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma. Por exemplo, genomas
ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas com
G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações duplas.
Anelamento
Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65ºC por,
aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da temperatura deve ser feita com exatidão para que
os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for baixa demais, a
fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar 
inespecificamente e sua reação não funcionará apropriadamente. Se for alta demais, os
oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua
reação será gravemente comprometida. Você pode estar se perguntando como saber exatamente a
temperatura a ser usada. A resposta certa dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu
oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a concentração de sais no tampão de PCR. De modo geral,
quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá
esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da
temperatura a 95ºC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas.
No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de
nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC a 72ºC.
Atenção
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os
oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase
com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de extensão de 30 a
40 segundos. 
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas recém-
sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No
final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja
concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os
termocicladores. Esses aparelhos foram um grandeavanço para as ciências biológicas e permitiram a grande
difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso,
conhecida como amplicon (produto amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas
uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do
terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo. Assim, no final de 30
ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma
mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente.
Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia,
em aparelho termociclador.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
PCR qualitativa
Todos os ciclos ocorrem em um termociclador
comum, precisa de etapas posteriores para
revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se
dá pela constatação da presença ou ausência
do produto alvo da amplificação. Abordaremos
alguns outros tipos de PCR que se encaixam
nessa categoria.
PCR quantitativa
Também conhecida como em tempo real. Os
ciclos se dão em um aparelho capaz de ler
automaticamente a amplificação e, assim, é
capaz de quantificar em tempo real. Existem
dois métodos que são mais comuns para a
quantificação. Nesse caso, não há necessidade
de revelação posterior à reação, o que a torna
mais rápida.
Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em
um tampão de reação que é transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o
resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos manter em mente que, após uma PCR bem-
sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos
oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para
verificarmos se o tamanho corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a
localização do DNA, ou um agente revelador especial.
Dica
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de
matriz ou gel de agarose. 
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona de maneira
semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se
solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a
passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais
rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão
mais tempo para viajarem pela malha. Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho.
Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta
simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um
pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de
agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e faz
com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione
adequadamente.
Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e
aplicação do produto de PCR.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante
azul, podemos começar a eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente
que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte
do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas
migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as
moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o polo
positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de
agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e,
assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de
carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente,
servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e não da posição do DNA.
Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA
que consiste em sequências de DNA de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus
representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho das sequências de DNA que
amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon) no gel de
agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no
comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente com o
DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita
dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e
teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar de nos
contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes
da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação extra.
Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um
equipamento chamado transiluminador.
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo
com o marcador de tamanho molecular. 
Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de
etídio em luz ultravioleta.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única
banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem
aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única era esperada.
Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de
possíveis problemas.
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de
acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas
com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida
também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas diferentes, mais
complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para execução.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética também são mais
trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR
mais utilizada.
PCR e eletroforese
Veja na prática a reação em cadeia pela polimerase.
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Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Reagentes necessários auma reação em cadeia da polimerase (PCR)
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Como ocorre a amplificação exponencial do DNA-alvo
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Diferenças entre PCR qualitativa e quantitativa
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Verificando o aprendizado
Questão 1
Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto
afirmar que
A
a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.
B
a especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e permitir que a
polimerase inicie a síntese.
C
a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.
D
a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.
E
apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq polimerase.
A alternativa B está correta.
As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função das
primases a colocação dos primeiros nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que se anelarão por
complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O anelamento dos oligonucleotídeos permite o
reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.
Questão 2
A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura. Considerando as
etapas, leia as afirmativas a seguir e assinale a alternativa correta: 
I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA em fitas
simples.
II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a 70ºC.
III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação
colorimétrica.
IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas de acordo
com o tamanho, através de eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA
fluorescentes em ultravioleta.
V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel em direção ao cátodo,
quando submetido à corrente elétrica.
A
Somente a afirmativa II está correta.
B
Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
C
Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
D
Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.
E
Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.
A alternativa E está correta.
Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à sequência-
alvo. No entanto, esse aumento é invisível a olho nu e precisa ser revelado.
2. Variações entre cada técnica de PCR
Variações da técnica de PCR
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o nosso objetivo.
Podemos nos deparar com casos em que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode
limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações, como o sequenciamento. Em determinadas
ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras
situações, podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar
para o RNA mensageiro ao invés do DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes,
salvo raras exceções.
Dica
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base
para que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas. 
Reação de transcrição reversa
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA
molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar
a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm material
genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A
Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha
com desoxirriboses.
Como conseguimos resolver esse problema?
Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma RNA. Os
primeiros vírus a serem estudados pela humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses
vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA → proteína do dogma central da
Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA.
Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é DNA
polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o
reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os pesquisadores conseguiram isolar a TR,
ela passou a ser usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de vírus
aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para
diagnóstico e pesquisa.
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada daqui em diante para
designar a reação em si) precisa de alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de
polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na manipulação e extração do material.
Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro
(mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na
célula, como os próprios retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa
para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é resistente à
temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas
temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT) seguida por PCR, vem o
termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR
convencional, para iniciar a transcrição.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem
ser específicos para determinada sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-
T), que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por
permitir a síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
Primeiro caso
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se
anelam.
Segundo caso
Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de
expressão gênica.
Terceiro caso
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os
RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita
de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto reagente, os
desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de determinada
sequência, a RT é linear: cada etapa acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal.
Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos
casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples.
Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA queprecisam de temperaturas moderadas para
desnaturação.
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por anelamento dos
hexâmeros iniciadores à sequência-alvo por complementariedade, e síntese de cDNA pela transcriptase
reversa.
Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR. Diferentemente da PCR
convencional, a RT possui diversas TR de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos
variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas,
de anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por
meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a
chamada RT-PCR.
Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do
cDNA em uma RT-PCR.
Nested-PCR
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada sequência que esteja
presente em pouquíssima quantidade. Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR
convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós
chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade.
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o
DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a
sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente,
pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do
número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não
oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a
interpretação.
Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até
chegar a um platô, em que não há mais aumento significativo de DNA a cada ciclo.
Gráfico representativo das qPCR.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da primeira reação
como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para
isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira reação, chamado de
iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos
aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80
ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a
quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de
etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR.
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da reação, que deve
ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a
determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo e específico o suficiente para ser
usado como DNA-molde na segunda reação.
Saiba mais
Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma
primeira PCR cujo amplicon contenha regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma
boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se anelem especificamente à
região que foi amplificada anteriormente. 
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem reduzir a
eficácia da segunda reação, além de gerar produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a
segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na segunda, o que evita
contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR. Note
o uso de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de
amplificação na segunda reação, que usa iniciadores internos.
Representação esquemática de uma nested-PCR.
PCR quantitativo em tempo real – qPCR
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos
produtos da PCR e posterior revelação das bandas através de agentes intercalantes do DNA que emitem
fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta. Esses tipos de PCR são
categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for
utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna
pouco informativa.
Exemplo
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador
genético específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não informam o
suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de certa
sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa -
também conhecida como PCR em tempo real - (qPCR). 
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem
necessidade de revelação posterior. Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a
adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente.
Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de
DNA-alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers
para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais
complexo do que um termociclador convencional, porém seus resultados podem ser igualmente mais
informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura
única para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 oC.
Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de
amplificação e a fase de curva de dissociação.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem especialmente na 
forma como a fluorescência é emitida e na especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação
são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes? Vejamos!
SYBR Green
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando
está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência
verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência drasticamente reduzida. Por
sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema
alternativo na revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de
etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão, pois esse é o
momento em que há maior número de bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um
laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência será detectada pelo aparelho, que
mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois
maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada.
Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo,
até que a reação atinja sua saturação, e um platôapós a curva de crescimento exponencial será observado.
Repare que, quando não está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite
fluorescência. Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.
Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de
fluorescência seja menos específica: como em uma reação convencional, apenas os
oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela especificidade. Assim, outras formas de
controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal fluorescente usado na quantificação
corresponda apenas ao produto desejado.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa etapa, o
termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA
sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da fluorescência pelo SYBR.
Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em
uma curva de dissociação boa e específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma
temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais
de um pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível
de controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.
A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto amplificado, o que confirma a
especificidade da qPCR. Observe:
Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por
SYBR Green.
Quantificação absoluta por SYBR
Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer uma curva de quantificação
absoluta.
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
TaqMan
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de videogame dos anos 1980,
PacMan. Assim como na técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e
detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como
a emissão da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui, temos a
presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é
conhecida como sonda e é curta, com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores,
e possui temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na
extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a molécula
fluorescente não for liberada de seu bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é
diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases,
e remove nucleotídeos (função exonuclease).
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao
nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu
bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável. A cada novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão 
desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com
remoção dos nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência
proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan polimerase durante
a extensão do DNA, permitindo a emissão de fluorescência.
Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico
para a região alvo a ser amplificada. A especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas
um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas como single nucleotide
polymorphism (SNP).
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como a curva de
dissociação, o que a faz mais rápida do que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais
cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de múltiplas detecções na
mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a
quantificação é obtida varia, mas a maioria das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez
que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de qualidade.
Quantificação
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo
aparelho.
Configuração do aparelho
Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a
excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da emissão ele deverá buscar o sinal para detecção.
Isto é, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.
Detecção de ruído
Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível
em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza fluoróforos para a
quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da reação que não está
relacionada com a amplificação da sequência-alvo em si.
Definição do limiar
Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído
(background). O ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção (threshold).
O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do
ruído (ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar diretamente
relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada. A relação entre concentração inicial de
DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma
amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou normalizar) a reação internamente são
a ROX, um fluoróforo passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do
DNA) usado como referência, e o Rn, que representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do
fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência ROX. A maioria dos reagentes para
qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a observação para eventual
detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a qPCR tem que manter
padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam
confiáveis.
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a
cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para
funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae. Note a reta
paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela,
temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação das amostras e, como
você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda
no gráfico, com menor Ct.
Você consegue dizer qual é o Ct da amostramais concentrada?
Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação relativa,
ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt). 
Pela curva padrão
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso, devemos ter em
mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de
laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós mesmos, através de clonagens e
purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma
fração da solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro
com apenas água, e assim sucessivamente até termos pelo menos 5 pontos de curva.
Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a
nossa metodologia é utilizada a escala em microlitro (µL).
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma que o
próprio computador calcule os parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a
quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração desconhecida. Alguns dos principais
valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a 
linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho), obtidas
pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir
de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.
Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.
Linearidade da curva
Matematicamente conhecida como R2, deve ser
superior a 0.985 para que a reação seja
aceitável, e a quantificação de sua amostra-
teste seja calculada com máximo de precisão.
Usando fórmulas de linearidade, calculamos o
valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da
amplificação começar, baseado no Ct de cada
uma.
Eficiência de amplificação
Com ela, a cada ciclo, espera-se que a
quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o
que significaria uma eficiência de 100% da
reação. Porém, devido a pequenos erros,
podemos considerar aceitáveis eficiências que
variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros
serão mais robustos com uso de replicatas
(repetições da mesma reação em poços
diferentes.).
Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é
desconhecida na amostra, e o DNA de referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de
interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra ultrapassou o limiar)
pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de
interesse pode variar de acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode ser devido à quantidade
de material usado na extração.
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA
de referência, que, geralmente, é um gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo
delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração na amostra-teste e uma
amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira
subtração; ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência
entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene
devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de procedermos para a técnica de
quantificação relativa.
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos um método
especial. Você consegue identificar qual? A pista mais importante é: você está investigando a expressão
gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está olhando diretamente o genoma, mas um
produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?
Atenção
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-
qPCR: uma reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa. 
PCR em multiplex
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR,
RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações
separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto desejado, e
depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado
chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os quatro (ou
mais) oligonucleotídeos necessários, sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais
importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os amplicons tenham tamanhos
distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de ultravioleta não
sejam confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200
pb de diferença. Para produtos maiores de 1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.
Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo de
extensão. Outro fator ao qual você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos múltiplos
pares de iniciadores, que devem ter temperaturas o mais próximas possível.
Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação é possível
ao utilizarmos duas (ou mais) sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua
sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam fluorescência em comprimentos
de onda diferentes.
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita fluorescência no
espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por diante.
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque a
emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas
do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos entre os sinais
dos diferentes produtos.
Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os
produtos distintos têm sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%.
Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto, sequências
distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não veremos
diferenças em suas curvas de dissociação.
Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Conhecendo nested-PCR
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
O que é e qual função de uma sonda TaqMan?
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
O que é valor de Ct (cycle threshold)?
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
Verificando o aprendizado
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de
suas variações, é correto afirmar que
A
na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que geram
produtos de tamanhos distintos.
B
o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.C
na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de
amplificação da sequência-alvo presente no cDNA.
D
uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que o produto amplificado da
primeira serve como molde para amplificação na segunda.
E
a reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.
A alternativa C está correta.
A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e polimerizar RNA. Quando
queremos analisar RNAm, precisamos que o cDNA seja sintetizado pela DNA-polimerase RT dependente,
ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA sintetizado como molde em uma PCR.
Questão 2
Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas. Considerando isso, leia as afirmativas abaixo e,
em seguida, assinale a alternativa correta. 
I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e modificarmos
geneticamente um organismo simples.
II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR TaqMan pode ser usada na
identificação e quantificação de mutações em diferentes alelos.
III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de aplicações
muito restritas.
IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas.
 
A
Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.
B
Somente as afirmativas I e IV estão corretas.
C
Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
D
Somente as afirmativas I e II estão corretas.
E
Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.
A alternativa A está correta.
A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através de um vetor, como plasmídeo. Na
qPCR-TaqMan, as sondas auxiliam na quantificação de mutações de alelos diferentes. O tamanho e
conteúdo das STRs oferecem grande precisão na identificação de indivíduos. As técnicas moleculares,
como a PCR e as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o
diagnóstico por amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a única opção. Suas
aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas ao acompanhamento da evolução e
tratamento de cânceres e infecções crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e
aconselhamentos.
3. Aplicações apropriadas ao uso de cada método
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA
até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a
partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda mais relevante e
útil em diversos contextos.
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações disso? Para ilustrar
melhor o quão útil a PCR é, veremos alguns exemplos a seguir.
A PCR e as suas variantes em ciências forenses
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter
entrado em contato com a identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja
por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é possível
porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem
do DNA. Denominadas marcadores moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos
genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de
interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em
tandem (ou STRs – short tandem repeats).
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na
identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por
separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim, aumentarmos o
sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os 
primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista forense, além de
fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil
genético.
Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os
marcadores moleculares.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico,
acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos
identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto. Seu
uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a
infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes
perfis – autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da
PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a doença e
de seu perfil genético.
O PCR multiplex pode ser utilizado para
verificar qual alelo está sendo expresso, dentre
dois alelos distintos, em uma mesma reação e
assim ajudar no reconhecimento de pequenas
mutações que levariam ao desenvolvimento de
uma doença genética. Mas temos outras
aplicações, usando PCR convencional.
Vamos usar a doença de Huntington como
exemplo. Nessa doença genética autossômica
dominante, ocorre um excesso de repetição de
três nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica
uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que causa
perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil
também. A PCR torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da
região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em
si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de Huntington, o
número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições, maior
o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no caso da doença de
Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.
Atenção
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs,
mas não nas STRs em si, pois isso geraria inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose. 
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de doenças
infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos
diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela
amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da
doença.
A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como
o Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do
material genético de determinado microrganismo não é suficiente para seu diagnóstico como agente causador
da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assimcomo técnicas de PCR mais
elaboradas que darão maiores informações.
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe acute respiratory
syndrome coronavirus 2), assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético.
Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou
seja, fazemos uma RT-qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo
SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre coleta,
extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso, esse método é muito sensível e
específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A efetividade do
tratamento para HIV pode ser monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga
viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa
também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista pode
requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão.
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no
tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico
diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas, mas que exigem abordagens
clínicas diferentes.
Exemplo
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o
nefrologista a pensar em duas possibilidades: na primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade
pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar
acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do
órgão e até mesmo ao óbito do paciente. 
A PCR e as suas variantes em pesquisa científica
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para
manipulação genética de organismos simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto,
podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao amplificarmos a sequência
gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira
região liga-se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é
a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos colocar nosso gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas que é capaz de
se replicar autonomamente quando inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os
plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, comuns em
bactérias.
Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a
inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por
PCR, ao vetor original.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que
queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o
gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em
pontos específicos, após amplificação por PCR.
A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em
entender mecanismos complexos de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma
ferramenta muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes em células
submetidas a diversas condições diferentes.
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de interesse com
um gene constitutivo de expressão estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar
mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer aplicação que determinado
método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é usada em pesquisa
científica, como, provavelmente, foi originada de uma.
Quantificação relativa de genes por RT-qPCR e seu uso em pesquisa
Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de SYBR. 
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Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Diagnóstico molecular de covid-19 por PCR
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A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas
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A PCR e as suas variantes em pesquisa científica (plasmídeos)
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Verificando o aprendizado
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de
suas variações em ciências forenses, é correto afirmar que:
A
a nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em situações forenses.
B
a PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de indivíduos.
C
as STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos geneticamente.
D
a qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra antes de seu
sequenciamento.
E
o sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos, além de ser
trabalhoso e caro.
A alternativa C está correta.
Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de tamanho entre indivíduos.
Pela identificação de diferentes padrões de um conjunto de STRs, podemos correlacionar amostras com
grande precisão, além ser possível também estabelecer grau de parentesco.
Questão 2
A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes para amplificações na pesquisa e
diagnósticos. Sobre a PCR, escolha a alternativa correta:
A
Um dos principais métodos utilizados em análises forenses é o sequenciamento de genes conservados dentro
de um DNA.
B
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre genes diferentes dentro de um mesmo organismo e
oferecem grande precisão na identificação de cromossomos se a detecção de várias STRs for usada em
conjunto.
C
Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma
infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.
D
Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR basta a amplificação do gene alvo que queremos clonar.
E
O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem o DNA como
material genético. Isso facilita o processo de laboratório porque o material já está disponível para qPCR.
A alternativa C está correta.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em
tandem e não sequências conservadas. As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e
oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em
conjunto. Este processo não compara genes entre cromossomos de um único indivíduo, mas vários.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR para amplificar o gene alvo e depois inserir o gene clonado no
vetor. O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem RNA fita
simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um DNA
viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
4. Conclusão
Considerações finais