RESUMO BIOMOLECULAR

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TEMA 2 
1. Introdução à Biologia Molecular 
Propósito: Entender a descoberta do DNA/RNA e seu papel nas células procarióticas e 
eucarióticas, além do fluxo de informação genética (dogma central). 
Objetivos: 
• História da biologia molecular. 
• Origem da vida. 
• Organização gênica dos organismos. 
• Funções do DNA. 
• Dogma central da Biologia. 
 
2. Histórico da Biologia Molecular 
Johannes Friedrich Miescher (1869): 
• Descobriu a “nucleína” (hoje sabemos que era DNA), no núcleo dos leucócitos. 
Albrecht Kossel (1880): Identificou as bases nitrogenadas. 
Richard Altmann (1889): Isolou a nucleína e a renomeou como “ácido nucleico”. 
Bases nitrogenadas: 
• Púricas: Adenina (A) e Guanina (G). 
• Pirimídicas: Citosina (C), Timina (T) e Uracila (U – somente no RNA). 
Nucleotídeo: Base + Pentose (Ribose ou Desoxirribose) + Fosfato. 
DNA: Dupla hélice (Watson e Crick, 1953), ligação A-T (2 ligações H) e G-C (3 ligações 
H). Mais estável. 
RNA: Fita simples, contém uracila em vez de timina, mais frágil. 
Ligação Fosfodiéster: Conecta nucleotídeos pela pentose e o grupo fosfato. 
 
3. Estrutura e Função do DNA/RNA 
DNA: 
• Armazena informação genética. 
• Sequência de nucleotídeos define genes. 
&
• Formado por regiões codificantes (genes) e não codificantes (regulam a 
expressão gênica). 
RNA: 
• Transcrito a partir do DNA. 
• Pode ser mensageiro (mRNA), transportador (tRNA) ou ribossômico (rRNA). 
 
4. Teorias da Origem da Vida 
Oparin e Haldane: 
• Moléculas orgânicas se formaram espontaneamente. 
• Evoluíram para estruturas replicativas → vida primitiva. 
Experimento de Miller (1953): Simulou atmosfera primitiva → formou aminoácidos. 
Fontes termais (Michael Russell): Minerais reagem com CO₂/H₂ → formam compostos 
orgânicos e nucleotídeos. 
Panspermia: 
• Vida chegou à Terra via meteoritos. 
• Aminoácidos e bases nitrogenadas (como citosina e timina) foram detectados 
em meteoritos (ex: Murchinson, 1997). 
• Não explica a origem da vida na Terra, mas propõe origem externa. 
Mundo RNA: 
• RNA autorreplicante teria sido o primeiro material genético. 
• Pequenos peptídeos + RNA → estruturas celulares rudimentares. 
• Lipídios formaram micelas → primeiras membranas celulares. 
 
5. Organização do Material Genético 
Procariotos: 
• DNA circular, disperso no citoplasma (nucleoide). 
• 1 cromossomo principal + elementos genéticos móveis (EGMs). 
EGMs principais: 
• Plasmídeos: DNA circular independente, replicação autônoma. Usado para 
engenharia genética. 
• Bacteriófagos: Vírus que injetam DNA na bactéria. 
• Transposons: DNA “saltador”, causa mutações. Tipos: 
o IS (sequências de inserção). 
o Tn (transposons compostos). 
o TnA (complexos, induzem replicação). 
Eucariotos: 
• DNA linear no núcleo (carioteca). 
• Compactação em níveis: DNA → Nucleossomos → Solenoides → Alças → 
Cromátides → Cromossomos. 
• Contêm também DNA mitocondrial e cloroplastidial (teoria endossimbiótica). 
• Regiões: 
o Eucromatina: DNA aberto (expressão ativa). 
o Heterocromatina: DNA fechado (silenciado). 
 
6. Dogma Central da Biologia Molecular 
Fluxo de informação genética: 
• DNA → RNA → Proteína 
 
7. Replicação do DNA 
Etapas: 
• Helicase: Abre a dupla hélice. 
• Topoisomerase: Alivia a tensão. 
• Primase: Coloca o primer (RNA). 
• DNA polimerase III: Sintetiza nova fita 5’→3’. 
• DNA polimerase I: Remove primers e substitui por DNA. 
• DNA ligase: Liga fragmentos (Okazaki na fita atrasada). 
Fita líder: Contínua. 
Fita atrasada: Discontínua (fragmentos de Okazaki). 
Semiconservativa: Cada nova dupla hélice tem uma fita antiga e uma nova. 
 
8. Transcrição 
DNA → RNA (mRNA) 
Eucariotos: 
• Ocorre no núcleo. 
• RNA precisa ser processado: 
o Cap 5’ 
o Cauda poli-A 3’ 
o Splicing alternativo: Íntrons (removidos) / Éxons (ligados). 
o Possibilidade de gerar múltiplas proteínas a partir de um gene. 
Regulação da transcrição: 
• Histonas: Compactação (metilação) e abertura (acetilação). 
• Metilação do DNA: Inibe expressão. 
• Fatores transcricionais: Ativam ou reprimem genes. 
Procariotos: 
• RNAm é policistrônico (vários genes). 
• Sem carioteca, transcrição e tradução ocorrem simultaneamente. 
 
9. Regulação Pós-transcricional 
• miRNA e siRNA: 
o RNAs pequenos que impedem a tradução ou degradam o RNAm. 
o miRNA: Endógeno, pareamento imperfeito. 
o siRNA: Exógeno (ou retrotransposons), pareamento perfeito. 
 
10. Tradução 
mRNA → Proteína 
Ribossomo: 
• Subunidades: 
o Maior (50S): Sítios A (entrada), P (formação da cadeia), E (saída). 
o Menor (30S): Leitura do RNAm. 
Código genético: 
• Códons: Trincas de bases → 1 aminoácido. 
• Start códon: AUG. 
• Stop códons: UAA, UAG, UGA. 
• Degenerado: Mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido. 
tRNA: 
• Carrega aminoácido. 
• Possui anticódon complementar ao códon. 
Chaperonas: Dobramento da proteína para forma funcional. 
 
11. Conclusão 
• DNA e RNA são essenciais para a vida. 
• Dogma central explica o fluxo da informação genética. 
• A biologia molecular fundamenta avanços em diagnósticos, terapias gênicas, 
bioengenharia e evolução. 
• Mecanismos de regulação garantem a diversidade de funções celulares mesmo 
com o mesmo genoma. 
 TEMA 3 
1. Propósito e Objetivos 
O conteúdo tem como foco: 
• Entender a estrutura dos genes (codificadora e reguladora). 
• Comparar a organização gênica de procariotos e eucariotos. 
• Estudar sequências reguladoras e estrutura da cromatina. 
 
2. Organização do Genoma Procariótico 
2.1 Estrutura Celular e Genômica dos Procariotos 
• Dominado por bactérias e arqueas. 
• DNA está no nucleoide, sem membrana. 
• Cromossomo circular, fita dupla, essencial à vida. 
• Algumas bactérias como Borrelia têm cromossomos lineares. 
2.2 Gene Procariótico: Estrutura Básica 
• Composto por: 
o Região codificadora (produz RNA). 
o Regiões reguladoras: promotor (início) e terminador (fim). 
• Transcrição → RNA (m, t ou r) → (se mRNA) tradução → proteína. 
2.3 Colinearidade 
• Nos procariotos, a sequência do DNA corresponde diretamente à proteína (sem 
íntrons). 
• Genes semelhantes → homólogos: 
o Parálogos: duplicação e divergência de função. 
o Pseudogenes: não funcionais, mas similares. 
2.4 Tamanho Genômico e Densidade Gênica 
• Variam entre 150 kb a 13 Mb. 
• Genoma compacto, com pouca região intergênica. 
2.5 Replicons 
• Unidade de replicação com origem única (bactérias). 
• Arqueas: até 3 origens. 
• Eucariotos: centenas a milhares de replicons. 
2.6 Plasmídeos 
• DNA circular, replicação independente. 
• Conferem vantagens seletivas (ex: resistência a antibióticos). 
• Epissomos: plasmídeos integrados ao cromossomo. 
• Transmissão via conjugação. 
2.7 Unidades Organizacionais 
• Motivos: pequenas sequências com função reguladora. 
• Sequências repetidas: 
o REP: palindrômicas, espalhadas. 
o Base da tecnologia CRISPR. 
2.8 Ilhas Genômicas 
• Segmentos com composição G+C diferente. 
• Contêm genes não essenciais, mas úteis. 
o Ex: Ilhas de patogenicidade (toxinas, adesinas). 
2.9 Transposons e Integrons 
• Transposons: "genes saltadores". 
o IS: codificam transposase. 
o Tn compostos: dois IS + gene de resistência. 
o TnA: resistência a β-lactâmicos (ampicilina). 
• Integrons: captam e expressam ORFs exógenas (resistência múltipla). 
2.10 Operons 
• Conjunto de genes com função comum, sob controle de promotor único. 
• RNA gerado é policistrônico (mais de uma proteína). 
Operon lac (E. coli) 
• Genes: lacZ, lacY, lacA. 
• Expressão ativada na ausência de glicose e presença de lactose. 
• Regulado por: 
o Repressor lac (sensor de lactose). 
o CAP + AMPc (sensor de glicose). 
• Promotor, operador e sítio CAP compõem a região reguladora. 
 
3. Gene Eucariótico e Suas Funções 
3.1 Genoma Híbrido 
• Mitocôndrias e cloroplastos têm DNA próprio (teoria endossimbiótica). 
• Genomas eucarióticosmaiores e mais complexos. 
3.2 Estrutura do Gene Eucariótico 
• Mais complexo que em procariotos. 
• Contém: 
o Éxons: partes codificantes. 
o Íntrons: partes não codificantes removidas no RNA. 
• Regiões reguladoras podem estar milhares de pares de base distantes. 
3.3 Paradoxo do Valor C 
• Tamanho do genoma não reflete complexidade biológica. 
• Sequências não codificadoras são abundantes. 
3.4 Cromossomos 
• DNA linear, organizado em cromossomos (haploide, diploide, poliploide). 
• Alguns eucariontes têm plasmídeos nucleares. 
3.5 Composição Gênica 
• Genes representam pequena parte do genoma (1% só em éxons no humano). 
• Genes em famílias: rRNA, tRNA, histonas. 
• Genes únicos também existem. 
• Presença de pseudogenes (sem função, mas similares). 
3.6 Sequências Intergênicas 
• Não fazem parte de genes típicos (éxons/íntrons). 
• Incluem: 
o Sequências repetidas simples (microssatélites, DNA-satélite). 
o Elementos transponíveis: 
▪ Transposons de DNA (via intermediário de DNA). 
▪ Retrotransposons (via RNA → DNA reverso). 
▪ Com ou sem LTR. 
 
4. Sequências Reguladoras e Cromatina 
4.1 Sequências Reguladoras 
Regiões UTR 
• 5’-UTR: contém sinais de início da tradução. 
• 3’-UTR: sinaliza finalização. 
Transcrição 
• Fases: iniciação, alongamento, terminação. 
Procariotos 
• Promotor e terminador próximos da região codificadora. 
• Promotores possuem: 
o TATA box (-10). 
o Região -35. 
• Regulados por proteínas ativadoras/repressoras. 
Eucariotos 
• Promotor + fatores de transcrição + RNA polimerase. 
• Enhancers (distais) aumentam transcrição. 
• UAS: sequências de ativação. 
 
5. Cromatina Eucariótica 
5.1 Compactação do DNA 
• DNA de 1,8 metros compactado em núcleo de 6 µm. 
• Estrutura complexa: Cromatina. 
5.2 Componentes da Cromatina 
Histonas 
• Proteínas básicas, ricas em lisina/arginina. 
• Tipos: 
o Centrais (H2A, H2B, H3, H4) → formam o octâmero. 
o Ligação (H1, H5) → entre nucleossomos. 
Proteínas Não Histônicas 
• HMG: alta mobilidade. 
• SMC: manutenção estrutural de cromossomos. 
5.3 Nucleossomo 
• Unidade básica da cromatina. 
• DNA + octâmero de histonas. 
• Uma histona H1 externa estabiliza. 
5.4 Níveis de Compactação 
• Fibras de: 
o 10 nm: linha de nucleossomos. 
o 30 nm: enrolamento adicional. 
o 300 nm: laços de cromatina. 
• Compactação máxima: cromossomos metafásicos. 
Tipos de Cromatina 
• Eucromatina: ativa (menos compacta). 
• Heterocromatina: inativa (mais compacta). 
o Constitutiva: sempre condensada (ex: centrômero). 
o Facultativa: varia (ex: cromossomo X inativado). 
 
6. Conclusão 
O estudo da organização gênica revela: 
• A compactação e regulação do DNA é essencial à funcionalidade celular. 
• Genes não estão apenas para codificar proteínas, mas também regulam sua 
expressão e estruturação. 
• Compreender essas bases é fundamental para biologia molecular, 
biotecnologia e saúde. 
 TEMA 4 
1. PROPÓSITO E OBJETIVOS 
• Propósito: Compreender os mecanismos da manutenção e expressão do 
genoma. 
• Objetivos: 
o Entender a replicação do DNA em eucariotos e procariotos. 
o Distinguir as etapas da transcrição. 
o Compreender a síntese de proteínas. 
o Identificar mutações e mecanismos de reparo do DNA. 
 
2. REPLICAÇÃO DO DNA 
• Semiconservativa: Cada nova fita de DNA é composta por uma fita parental e 
uma nova. 
• Forquilha de Replicação: Forma-se nos locais de origem de replicação, onde a 
dupla hélice se separa. 
• Origem da Replicação: Sequência específica que inicia o processo. 
• Abertura das Fitas: Feita pela helicase, que quebra as pontes de hidrogênio. 
• Estabilização das Fitas Simples: 
o Procariotos: Proteínas SSB. 
o Eucariotos: Proteína RPA. 
• Superenovelamento: 
o Resolvido pelas topoisomerases I e II. 
• DNA Polimerases: 
o Necessitam de fita molde e nucleotídeos livres. 
o Atuam no sentido 5'→3'. 
o Possuem atividade exonuclease (prova-revisão). 
• Primer: 
o Iniciador curto de RNA sintetizado pela DNA-primase. 
• PCNA: Proteína anelar que fixa a DNA polimerase à fita molde. 
• Fitas Filhas: 
o Líder: Síntese contínua. 
o Tardia: Síntese descontínua (fragmentos de Okazaki). 
o DNA polimerase remove primers e DNA ligase une fragmentos. 
• Término da Replicação: 
o Eucariotos: Envolvem telomerase (evita encurtamento dos telômeros). 
 
3. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS E PROCARIOTOS 
• Dogma Central: DNA → RNA → Proteína. 
• Tipos de RNA: 
o mRNA (mensageiro): Leva a informação até os ribossomos. 
o tRNA: Transporta aminoácidos. 
o rRNA: Componente estrutural do ribossomo. 
o snRNA, miRNA, siRNA, lncRNA: Funções reguladoras e estruturais. 
• Regiões do Gene: 
o Promotora: Início da transcrição (contém a TATA box). 
o Codificante: Parte transcrita em RNA. 
o Terminalizadora: Sinaliza o fim. 
• RNA Polimerase: 
o Procariotos: Uma única RNA polimerase + fator sigma. 
o Eucariotos: RNAPI, RNAPII (sintetiza mRNA), RNAPIII. 
• Etapas da Transcrição: 
o Início: Formação da bolha de transcrição. 
o Alongamento: Adição de ribonucleotídeos. 
o Término: 
▪ Procariotos: Terminação intrínseca (grampo) ou dependente de 
Rho. 
▪ Eucariotos: Fosforilação da cauda CDT. 
• Pós-transcrição (Eucariotos): 
o Cap 5': Protege contra degradação. 
o Cauda Poli-A 3': Estabilidade e transporte. 
o Splicing: Remove íntrons e junta êxons (splicing alternativo). 
 
4. TRADUÇÃO E CÓDIGO GENÉTICO 
• Etapas: 
o Início: 
▪ Procariotos: Sequência Shine-Dalgarno. 
▪ Eucariotos: Reconhecimento da região cap 5'. 
o Alongamento: 
▪ Uso dos sítios A, P e E do ribossomo. 
▪ Formação de ligações peptídicas. 
o Término: Códons de parada (UAA, UGA, UAG). 
• Códon: Trinca de bases do mRNA que codifica um aminoácido. 
o Ex: AUG (início/metionina). 
• Anticódon: Complementar ao códon, presente no tRNA. 
• Código Genético: 
o É degenerado: Vários códons para um mesmo aminoácido. 
o É quase universal. 
 
5. MUTAÇÕES E REPARO DO DNA 
• Mutações: Mudanças permanentes na sequência do DNA. 
o Espontâneas: Erros de replicação, tautomeria. 
o Induzidas: Por agentes químicos/físicos (UV, bases análogas). 
• Tipos de Mutação: 
o Com sentido trocado: Troca aminoácido. 
o Sem sentido: Forma códon de parada. 
o Silenciosa: Não altera aminoácido. 
o Mudança de quadro de leitura: Inserção/deleção de bases. 
• Mecanismos de Reparo: 
o Proofreading (DNA polimerase). 
o Reparo por mal pareamento. 
o Reversão direta. 
o Excisão de base e de nucleotídeos. 
o Reparo por recombinação (quebra de fita dupla). 
 
6. CONCLUSÃO 
A manutenção e expressão do genoma requerem um conjunto coordenado de enzimas 
e processos. O DNA é replicado com alta fidelidade, transcrito em RNA e traduzido em 
proteínas, sendo os mecanismos de reparo cruciais para evitar mutações prejudiciais. 
Essa base molecular é essencial para a compreensão da biologia celular, da genética, da 
medicina e da biotecnologia. 
 
 TEMA 5 
 
1. PROPÓSITO E OBJETIVOS 
• Compreender os mecanismos de regulação da expressão gênica em procariotos 
e eucariotos. 
• Entender os conceitos e impactos da epigenética sobre a expressão gênica. 
 
2. REGULAÇÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS 
2.1. Características Gerais 
• Unicelulares; regulação gênica simples e direta. 
• Poucos pontos de regulação: transcrição e pós-tradução. 
2.2. Transcrição: Regulação Principal 
• RNA polimerase se liga ao promotor. 
• Fatores transcricionais modulam a transcrição: 
o Efetores ativam (controle positivo). 
o Repressores inibem (controle negativo). 
• Regulação gênica é geralmente transcricional. 
2.3. Operons 
• Genes organizados em operons (região codificadora policistrônica). 
• RNAm policistrônico: vários genes com função comum. 
• 
2.4. Operon TRP (biossíntese de triptofano) 
• Componentes: promotor (P), operador (O), trpL (líder), trpE, trpD, trpC,trpB, 
trpA. 
• Duas formas de regulação: 
o Por repressor ativado pelo excesso de triptofano (ligado ao operador). 
o Por região líder (trpL): forma grampos 1-2 (pausa), 2-3 (antiterminação) 
ou 3-4 (terminação) conforme a quantidade de triptofano. 
2.5. Operon Lac (metabolismo da lactose) 
• Genes: LacZ, LacY, LacA, regulados por gene I (repressor Lac). 
• Na ausência de lactose: repressor impede transcrição. 
• Com lactose: alolactose inativa repressor. 
• Com glicose: baixa [cAMP] impede formação do complexo CAP-cAMP, inibindo 
o operon. 
 
3. REGULAÇÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS 
3.1. Características Gerais 
• Multicelulares, alto nível de complexidade. 
• Mesma carga genética, mas expressão diferente (diferenciação celular). 
3.2. Pontos de Regulação 
• Transcrição (ativadores/repressores). 
• Modificações epigenéticas (histonas/DNA). 
• Pós-transcrição (splicing, cap 5’, cauda poli-A). 
• Tradução. 
• Pós-tradução (ubiquitina, ativação proteica). 
3.3. Modificações nas Histonas 
• Acetilação (via HAT): descompacta o DNA (ativa). 
• Metilação: compacta o DNA (reprime). 
3.4. Metilação do DNA 
• Citocinas metiladas (CpG) impedem transcrição. 
• Enzima: DNA metiltransferase (DNMT). 
3.5. Splicing Alternativo 
• Forma várias proteínas a partir de um mesmo gene. 
• Padrão celular regula êxons e íntrons. 
3.6. Processamento do RNAm 
• Cap 5’: protege e direciona para exportação. 
• Cauda Poli-A: estabilidade e proteção. 
• Ausência = degradação. 
3.7. miRNA e siRNA 
• miRNA: endógeno, pareamento imperfeito, silencia RNAm. 
• siRNA: viral ou retrotransposon, pareamento perfeito, degrada RNAm. 
3.8. Regulação Pós-traducional 
• Ubiquitina + proteassoma: degrada proteínas. 
• Proteínas inativas até liberação do repressor (ex: tripsina). 
 
4. EPIGENÉTICA 
4.1. Conceito 
• Estudo das modificações reversíveis que afetam a expressão gênica sem alterar 
a sequência de DNA. 
• Influenças ambientais e comportamentais (estresse, dieta, drogas, etc.). 
4.2. Exemplos de Impactos Epigenéticos 
• Fumo: estresse oxidativo aumenta metilação. 
• Gravidez: nicotina atravessa placenta e muda padrões epigenéticos. 
• TTT (Transmissão Transgeracional de Trauma): alterações epigenéticas 
herdadas de eventos traumáticos. 
4.3. Hereditariedade Epigenética 
• Marcações como metilação e acetilação são transmitidas parcialmente durante 
a formação dos gametas. 
4.4. Exemplos em Humanos 
• Gêmeos criados com/sem afeto: padrões epigenéticos diferentes. 
• Descendentes de sobreviventes do Holocausto: maior propensão a distúrbios 
psicológicos. 
• Associação entre fome precoce e menor risco de câncer colorretal. 
 
5. CONCLUSÃO 
• A expressão gênica é regulada de forma complexa em eucariotos e mais direta 
em procariotos. 
• A epigenética oferece uma nova compreensão sobre como o ambiente 
influencia nossa herança biológica. 
• Os avanços nesse campo apontam para terapias futuras personalizadas com 
base em padrões epigenéticos. 
 
 TEMA 6 
1. PROPÓSITO E OBJETIVOS 
• Propósito: Compreender o processo completo do isolamento de ácidos 
nucleicos (DNA/RNA), desde o desenho experimental até a obtenção e análise 
do material. 
• Objetivos: 
o Entender o desenho experimental. 
o Conhecer a coleta, transporte e armazenamento de amostras. 
o Aprender técnicas de extração, purificação e quantificação de DNA/RNA. 
o Compreender a síntese de cDNA. 
 
2. DESENHO EXPERIMENTAL E MÉTODO CIENTÍFICO 
• Etapas do método científico: observação, questionamento, hipótese, 
experimento, análise e conclusão. 
• Hipótese: Proposição testável. 
• Variáveis: 
o Independentes: controladas pelo pesquisador. 
o Dependentes: resultados observados. 
• Hipótese nula (H0): nenhuma relação causa-efeito. 
• Hipótese alternativa (H1): existe relação causa-efeito. 
• Erros: 
o Tipo I: rejeição incorreta de H0 (falso positivo). 
o Tipo II: aceitação incorreta de H0 (falso negativo). 
• Amostragem: 
o Probabilística: aleatória simples ou sistemática. 
o Não probabilística: conveniência ou julgamento. 
 
3. FASE PRÉ-ANALÍTICA: COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO 
• Tipos de amostras: sangue, tecido, cabelo, escarro, líquor, swab oral. 
• Erros frequentes: hemólise, identificação errada, contaminação. 
• Amostras para DNA: 
o Preferîncia por amostras frescas. 
o Coleta com EDTA ou ACD (evitar heparina). 
o Armazenamento: 24h (ambiente), 8 dias (2-8°C), > meses (-20°C). 
• Amostras para RNA: 
o RNA é instável. Deve ser estabilizado com reagentes e congelado. 
o Evitar ciclos de congelamento-descongelamento. 
• Amostras de tecido: 
o Preferîncia por congelamento em nitrogênio líquido. 
o Armazenamento: -20°C (2 semanas), -70°C (2 anos). 
• Swab bucal: 
o Pode ser mantido seco (DNA) ou estabilizado (RNA). 
o Evitar contaminação por alimentos/batom. 
• Líquor (LCR): 
o Armazenar a 2-8°C ou congelar (-20°C ou -70°C). 
 
4. EXTRAÇÃO DE DNA 
• Objetivo: Separar o DNA dos demais componentes celulares. 
• Etapas comuns: 
o Rompimento da membrana celular e nuclear. 
o Inativação de DNases com proteinase e EDTA. 
o Remoção de RNA com RNase. 
• Técnicas principais: 
o Solvente orgânico (fenol/clorofórmio): 
▪ DNA na fase aquosa, contaminantes na fase orgânica. 
o NaCl concentrado: precipita contaminantes. 
o Coluna de adsorção: DNA adere à sílica pela carga. 
• Precipitação: 
o Isopropanol ou etanol. 
o Pellet de DNA lavado com etanol 70%. 
o Ressuspensão em tampão TE ou água. 
 
5. EXTRAÇÃO DE RNA 
• Diferenças: 
o Mais frágil, degradado por RNases. 
o Equipamento RNase-free. 
o pH ácido (4,5-5,5) para manter RNA na fase aquosa. 
o Armazenar sempre a -70°C ou em nitrogênio líquido. 
 
6. QUANTIFICAÇÃO, PUREZA E INTEGRIDADE 
• Quantificação: 
o Fluorometria (fluorescência proporcional à concentração). 
• Pureza: 
o Espectrofotometria: DNA/RNA (260 nm), proteínas (280 nm), fenol (230 
nm). 
o Razões OD 260/280 > 1,8 e OD 260/230 entre 1,8 e 2,2 indicam pureza. 
• Integridade: 
o Avaliada por eletroforese em gel. 
o Bandas bem definidas = material íntegro; arraste = fragmentação. 
 
7. SÍNTESE DE cDNA (DNA COMPLEMENTAR) 
• Finalidade: 
o Avaliar expressão gênica via PCR, construir bibliotecas genômicas, 
detectar RNA viral, SNPs etc. 
• Enzimas e componentes: 
o RNA molde, transcriptase reversa, primers, dNTPs, Mg2+, tampões. 
• Tipos de primers: 
o Oligo dT: se anela à cauda poli-A do RNAm. 
o Randômico: se anela a qualquer RNA. 
o Específico: se anela a sequência conhecida. 
• Processo: 
o Primer se anela ao RNA. 
o Transcriptase reversa forma fita de cDNA. 
o RNase H degrada o RNA molde. 
o DNA polimerase forma a segunda fita de DNA. 
 
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
• O isolamento de DNA/RNA é base de toda a biologia molecular aplicada. 
• Coletas e manuseios adequados garantem qualidade. 
• As análises de pureza, quantidade e integridade são essenciais para o sucesso 
de técnicas moleculares como PCR, clonagem e sequenciamento. 
 
 TEMA 7 
1. PROPÓSITO E OBJETIVOS 
• Propósito: Compreender os princípios, variantes, vantagens, desvantagens e 
aplicações da amplificação de DNA/RNA in vitro. 
• Objetivos: 
o Reconhecer os elementos fundamentais à PCR. 
o Distinguir variações da técnica. 
o Aplicar corretamente cada método em contextos laboratoriais. 
 
2. FUNDAMENTOS DA PCR CONVENCIONAL 
2.1. Estrutura dos ácidos nucleicos 
• DNA: fita dupla, estável, com bases A-T e C-G. 
• RNA: fita simples, instável, com bases A-U, C-G. 
• Nucleotídeos: base nitrogenada + desoxirribose + fosfato. 
• Ligação fosfodiéster entre C5 e C3: forma a cadeia. 
• Bases interagem por pontes de H (duplas A-T; triplas C-G). 
2.2. Princípios da PCR 
• Complementariedade: pareamento específico das bases. 
• Enzima chave: Taq polimerase (termorresistente). 
• Iniciadores (primers): oligonucleotídeosque delimitam a região alvo. 
• Direcionalidade: síntese ocorre sempre no sentido 5'→3'. 
2.3. Componentes da Reação 
• DNA molde. 
• Primers senso e antissenso. 
• Taq polimerase. 
• dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). 
• Mg2+ (cofator da enzima). 
• Tampão e água ultrapura. 
2.4. Etapas da PCR (em termociclador) 
1. Desnaturacão (~95ºC): separa as fitas. 
2. Anelamento (50-65ºC): primers se ligam ao molde. 
3. Extensão (~72ºC): polimerase sintetiza nova fita. 
• Repetição de 30 a 40 ciclos. 
• Resultado: amplificação exponencial (2^n copias). 
2.5. Detecção por eletroforese 
• Gel de agarose: separa DNA por tamanho. 
• Corantes (brometo de etídio, SYBR): intercalam no DNA. 
• Visualização: luz UV + transiluminador. 
 
3. VARIAÇÕES DA PCR 
3.1. RT-PCR (Transcrição reversa PCR) 
• Objetivo: detectar e amplificar RNA. 
• Etapas: 
1. Transcriptase reversa converte RNA+ em cDNA. 
2. PCR convencional amplifica o cDNA. 
• Aplicada para detecção de vírus (ex: HIV, SARS-CoV-2). 
3.2. Nested-PCR 
• Duas PCRs sequenciais: 
1. Primeira com primers externos. 
2. Segunda com primers internos. 
• Aumenta especificidade e sensibilidade. 
3.3. PCR em tempo real (qPCR) 
• Quantifica DNA durante a reação. 
• Requer termociclador com leitura fluorescente. 
• Dois métodos principais: 
a) SYBR Green: 
• Fluoróforo que se liga a qualquer DNA dupla fita. 
• Requer curva de dissociação (controle de especificidade). 
b) TaqMan: 
• Usa sonda com fluoróforo + quencher. 
• Polimerase cliva a sonda liberando fluorescência. 
• Maior especificidade. Detecção de SNPs. 
3.4. Quantificação (qPCR) 
• Ct (cycle threshold): ciclo em que fluorescência ultrapassa o limiar. 
• Quanto menor o Ct, maior a concentração de DNA inicial. 
• Formas de quantificação: 
o Curva padrão (absoluta). 
o ΔΔCt (relativa, compara expressão entre genes). 
3.5. PCR Multiplex 
• Amplifica várias sequências em uma mesma reação. 
• Requer primers específicos para cada alvo. 
• Em qPCR-TaqMan: cada sonda com fluoróforo diferente. 
• Em PCR convencional: produtos com tamanhos distintos. 
 
4. APLICAÇÕES DA PCR 
4.1. Ciências Forenses 
• Identificação de indivíduos por marcadores genéticos (STRs). 
• PCR + eletroforese = perfil genético. 
4.2. Diagnóstico de Doenças Genéticas 
• Detecção de mutações e polimorfismos (ex: Huntington, STRs). 
• PCR multiplex ou convencional. 
4.3. Diagnóstico de Infecções 
• PCR ou RT-PCR detecta material genético do patógeno. 
• Ex: RT-qPCR para Covid-19. 
• Avalia carga viral e resposta a tratamento. 
4.4. Pesquisa Científica e Clonagem 
• Amplifica regiões de interesse para inserção em vetores. 
• Modificação genética de organismos. 
• Uso de plasmídeos em bactérias. 
 
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
• A PCR e suas variantes são ferramentas fundamentais da biologia molecular. 
• Permitem investigação genética, diagnóstico preciso, acompanhamento 
terapêutico e avanços em biotecnologia. 
• Cada método tem aplicação específica conforme o objetivo e a amostra.