Isolamento de Ácidos Nucleicos

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Isolamento de ácidos nucleicos
Isolamento dos ácidos nucleicos: coleta, transporte e armazenamento de amostras; extração e
quantificação de DNA e RNA; síntese de cDNA; desenho experimental.
Prof. Eldio dos Santos, Prof.ª Thaíssa Queiróz Machado
1. Itens iniciais
Propósito
Compreender as etapas para o isolamento dos ácidos nucleicos, a partir do desenho experimental até a sua
extração e quantificação é o primeiro passo para obtenção de amostras de qualidade para a realização dos
métodos moleculares, garantindo, assim, resultados fidedignos.
Objetivos
Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos nucleicos.
Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e RNA e síntese do cDNA.
Introdução
A Biologia Molecular é responsável por estudar as moléculas que realizam a manutenção da vida. São elas:
DNA, RNA e proteínas, que têm como função principal, considerando o dogma central da Biologia, armazenar
informações e enviar essas informações para a síntese das proteínas que realizaram as funções celulares,
respectivamente.
Atualmente, os inúmeros avanços obtidos na área médica, na ciência animal e vegetal, são resultado da
elaboração de técnicas moleculares que nos proporcionaram novas formas de estudar o DNA e o RNA.
Técnicas essas que estão em constante evolução.
No entanto, antes de analisar o material genético propriamente dito, é necessário extrair esse material das
células. Para isso, é essencial que a coleta, o armazenamento, o transporte e o processo extrativo sejam
realizados de maneira satisfatória e que tenhamos uma quantidade de material genético suficiente, de
qualidade, livre de contaminantes e íntegro para realizar a análise.
Você imagina como é feito o processo extrativo? Será que a extração de DNA ou RNA empregam a mesma
metodologia? E o que é cDNA e qual sua importância?
Vamos juntos, ao longo desta jornada, explorar todos esses questionamentos, visitando a coleta, o transporte
e armazenamento do material para análise molecular (fase pré-analítica). Após essa fase, vamos aprender
sobre as técnicas de extração de DNA e RNA, quantificação, análise da pureza e, por fim, a síntese do cDNA.
Além disso, estudaremos o desenho experimental e entenderemos a sua aplicabilidade, etapas e importância
no desenvolvimento e conhecimento científico!
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1. Introdução ao isolamento dos ácidos nucleicos
Desenho experimental
O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em algumas etapas e é uma ramificação
do método científico, que é a ferramenta mais poderosa de todas para o avanço tecnológico da humanidade e
muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia.
Veja a aplicação deste método em uma atividade do nosso cotidiano:
1
Início
Leonardo tem o hábito de assistir ao telejornal todos os dias. Enquanto assistia ao programa, viu que
o prefeito da sua cidade participou de uma pequena entrevista e fez algumas afirmações sobre o
funcionamento da prefeitura naquele trimestre.
2
Passo 1
Primeiro, Leonardo deve parar, pensar sobre tal afirmação e aplicar o método científico, observando
o que foi falado e questionar: “Será que é verdade o que o prefeito falou?"
3
Passo 2
Em seguida, ele estabelecerá hipóteses: “É verdade que tal coisa aconteceu” ou “É mentira que tal
coisa aconteceu”.
4
Passo 3
A próxima etapa é realizar um experimento, que nesse caso é a busca de fontes confiáveis de
notícia, com credibilidade, para identificar se o que o político falou é verdade ou não, analisar o
discurso e, finalmente, Leonardo poderá tomar a sua conclusão baseado no método científico.
5
Passo 4
Pronto! Agora ele pode validar a hipótese “É verdade” ou “É mentira” ao invés de simplesmente
aceitar a afirmação dita.
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que você está
lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de forma
inconsciente, mas temos que ter em mente que ele existe e que devemos pensar sempre de forma criteriosa.
Resumindo, as etapas do método científico são: observação, questionamento, hipótese, experimento, análise
dos resultados e conclusão.
 
Vamos entender melhor algumas dessas etapas:
Método científico.
1 Observação
A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA –, podemos nos
perguntar (questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA para estudar melhor como ele é construído,
tem alguma forma de fazer isso?”.
2
Hipótese
A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um reagente específico e fizer
um determinado procedimento, será que consigo o DNA purificado?”.
3
Experimento
Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da análise dos resultados, as
conclusões são obtidas.
Agora que já entendemos o método científico,
podemos falar sobre desenho experimental. 
 
Ele é um conjunto de etapas que devem ser
realizadas para conduzir uma hipótese
utilizando o método científico, com objetivo de
estabelecer um resultado confiável e
reprodutível. 
 
A reprodutibilidade é um dos pontos mais
importantes da ciência!
Exemplo
Suponha que sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica de quantificação de DNA. Você
deverá escrever sua metodologia passo a passo, com detalhes dos tipos de solventes necessários, as
concentrações, a pressão, a temperatura de incubação etc. Os dados devem ser claros para que,
quando outra pessoa ler essa metodologia (por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos
depois), ela consiga chegar no mesmo resultado, considerando que todas as condições e manipulação
foram realizadas conforme o descrito. 
Vejamos as etapas do desenho experimental!
Definir a relação causa-efeito
Estabelecer o problema existente, os objetivos do trabalho e as metas a serem cumpridas.
Planejamento
Com o projeto estabelecido, preparar a instrumentação e avaliar possíveis problemáticas do
experimento.
Execução
Realizar as medições e técnicas planejadas.
Análise e interpretação
Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e científica.
Formular as conclusões
A partir da análise e interpretação dos resultados, devemos concluir se a relação causa-efeito se
mostrou existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na etapa 1, fechando dessa forma
o ciclo do desenho experimental.
A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou por que o fenômeno é produzido.
Assim, a partir da ideia de relação de causa-efeito em que se acredita que existe uma relação entre a
construção da causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas, temos os vários
tratamentos (variáveis independentes) e executamos o experimento e observamos os resultados (variáveis
dependentes). Se o experimento for bem elaborado e planejado, podemos formular conclusões a respeito da
relação de causa-efeito para a hipótese estabelecida.
Hipóteses
São afirmações provisórias, enunciadas de forma curta e objetiva, que serão verificadas para ser ou não
demonstradas. Seguem teorias já existentes.
Variáveis dependentes e independentes
Mas o que são variáveis dependentes e independentes? Para responder a essa pergunta, aprenderemos
alguns conceitos essenciais para o desenho experimental!
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. Todos os resultados (outputs)
são originados a partir das entradas do experimento (inputs).
Entradas do experimento
A palavra entrada corresponde a todos os valores inseridos em determinado modelo, ou seja, em um
modelo experimental em que valores são dados, as entradas são todos estes valores. 
Considerando a necessidade de se extrair o DNA com
sucesso, o input será o material coletado, por exemplo, o
raspado da face interna da bochecha, e o output será o
DNA extraído desse material.
Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis. Elas são
agrupadas em dois grupos: variáveis dependentes e
variáveis independentes. Vamos conferi-las?O experimento será medir a concentração plasmática do colesterol. As variáveis independentes, ou seja, as
que são possíveis controlar, seriam: “Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos dias?”
Essas perguntas influenciarão diretamente no resultado do colesterol encontrado, ou seja, na variável
dependente, que nesse caso é a concentração de colesterol dosada no soro. 
Hipótese nula e hipótese alternativa
Após os resultados do experimento, baseando-se nos dados coletados e processos realizados, como garantir
que o dado obtido em uma amostra pode ser generalizado para toda a população e verificar se a hipótese
inicial estava correta?
Amostra
Subconjunto de pessoas, itens ou eventos de uma população selecionados para analisar e fazer
inferências. 
Reflexão
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos estatísticos e testes de
hipóteses para analisar os dados e testar a validade desses resultados. Por meio da inferência
estatística, os testes de hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese
estabelecida no início do desenho experimental. 
Existem dois tipos de hipótese: 
Hipótese nula
Indica que não há uma relação causa-efeito.
Hipótese alternativa
Indica que existe uma relação causa-efeito, ou
seja, rejeita a hipótese nula.
Vamos entender melhor a partir de um exemplo:
Para provar que existe um padrão, ou seja, uma relação causa-efeito, vamos estudar se, ao falar com um
papagaio, ele repete exatamente o que nós falamos. Nesse caso, a hipótese inicial, aquela que se deseja
Variáveis independentes 
São aquelas que podemos controlar e
modificar, e possuem certo efeito sobre a
variável dependente.
Variáveis dependentes 
São aquelas que medem o efeito do
que está sendo avaliado e dependem
da variável independente.
provar, é que o papagaio repete o que falamos.
Para isso, o experimento será falar várias vezes para o papagaio a palavra Vasco e observar o que ele diz.
Como resultado, podemos esperar que ele repita a mesma palavra (Vasco) ou não (Flamengo, ou qualquer
outra palavra diferente de Vasco). Assim, teremos duas hipóteses: a hipótese nula (aquela em que não há
relação causa-efeito), que ele não repete o que falamos, ou seja, ao ouvir Vasco, ele diz Flamengo. Quando
isso acontece, dizemos que a H0 é verdadeira; e a hipótese alternativa (aquela que confirma a relação causa-
efeito), em que ele repete o que estamos falando, ao ouvir Vasco, ele repete Vasco. Nesse caso, rejeitamos a
H0 e a H1 é verdadeira.
Hipótese nula
Hipóteses alternativa
Tipos de erros
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de interpretação e/ou do processo
realizado. Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a
rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo). Os erros
podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada.
 A hipótese nula é
verdadeira A hipótese nula é falsa
Decisão
Decidimos rejeitar
a hipótese nula.
Erro tipo 1 (rejeição de
uma hipótese nula
verdadeira)
Decisão correta
Aceita-se a
hipótese nula.
Decisão correta
Erro tipo 2 (não rejeição ou
aceitação de uma hipótese
nula falsa)
Erros do tipo 1 e 2.
Vamos voltar ao exemplo anterior para entender melhor esses erros:
Como aprendemos anteriormente, ao falar para o papagaio a palavra Vasco e ele repetir Flamengo ou
qualquer outra palavra além de Vasco, a hipótese nula é verdadeira (sem relação causa-efeito). No entanto,
quando falamos Vasco para o papagaio e ele repete outra palavra, enviesados para a obtenção de uma
relação de causa-efeito, rejeitamos a H0, mesmo ela sendo verdadeira. Temos um erro do tipo 1 ou falso
positivo. Nesse tipo de erro, a hipótese nula é verdadeira (ou seja, ele não repetiu a palavra Vasco) e nós a
rejeitamos (pois entendemos Vasco).
Vimos também que, quando falamos Vasco, e ele repete Vasco, a H0 é falsa. Qualquer outra palavra dita pelo
papagaio torna a H0 verdadeira, pois ele não repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto, se ao falar
Vasco ele repetir a exata palavra Vasco e nós entendermos “Asco” por engano, vamos entender que a H0 é
verdadeira, porém, nesse caso, a hipótese nula é falsa, uma vez que ele de fato repete a palavra Vasco. Esse é
um erro do tipo 2 ou falso negativo: aceitamos uma H0 verdadeira (pois entendemos que ele disse Asco), mas,
na verdade, a hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse Vasco).
Saiba mais
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área
médica, principalmente em testes de diagnóstico clínico, nos quais kits de diagnóstico demonstram
resultado positivo para uma doença inexistente ou resultado negativo, quando, na verdade, há presença
de doença. 
O desenho experimental
Entenda melhor o desenho experimental.
Conteúdo interativo
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Seleção de participantes
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para termos
menor chance de errar ao generalizar os resultados.
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de amostragem, que pode ser não
probabilística ou probabilística.
A amostragem probabilística pode ser:
Amostragem aleatória simples
Participantes são selecionados aleatoriamente em uma determinada
população. Em uma população de 12 participantes, eu escolho 9 de forma
aleatória, ou seja, ao acaso. Isso poderia ser realizado por sorteio, por
exemplo.
Amostragem não probalística 
Ocorre quando a probabilidade da seleção de
cada participante não é conhecida. A seleção
da amostra depende do julgamento do
pesquisador e esta pode ser feita pela
amostragem por conveniência (o pesquisador
escolhe quem está disponível) ou julgamento
(o pesquisador escolhe quem ele acha
interessante).
Amostragem probalística 
Ocorre quando cada elemento da
população possui a mesma
probabilidade de ser selecionado para
compor a amostra. Nesse caso, a
probabilidade da seleção de cada
participante é conhecida. Por exemplo,
em uma amostra aleatória simples com
10 participantes, a chance de um deles
ser escolhido é 1/10, ou seja, 10%.
Amostragem sistemática
O primeiro participante é selecionado a partir de um número
preestabelecido e os outros participantes são escolhidos seguindo um
mesmo coeficiente. Por exemplo, em uma população com 13
participantes, vamos padronizar um coeficiente de 3. Além disso, vamos
utilizar a fórmula 1 + (K x N), onde K é meu coeficiente e N o número do
participante. Se definimos o primeiro participante como o número 1
(poderia ser qualquer outro), quais seriam os outros participantes?
O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X a
quantidade de participantes já escolhidos, assim teríamos 1 + 3
(coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o participante
seria o número 4.
O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7.
O quarto 1 + 3 x 3 = 10.
O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra.
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos seguir para as próximas
etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico são
valiosos e podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do nosso cotidiano.
Coleta, transporte e armazenamento de amostras
biológicas destinadas aos testes moleculares
Atualmente, o mercado dos testes moleculares está em intensa expansão. O marketing feito pelos
laboratórios, as divulgações promovidas por celebridades, as regulações nos preços dos testes, o
desenvolvimento de marcadores e os kits acessíveis, entre outros fatores colaboram para o crescimento
desse ramo de mercado.
São várias as empresas que fazem testes utilizando material genético para diferentes fins, por exemplo,
indicar a ancestralidade e a origem genética, e apontar marcadores genéticos para doenças, além dos testeslaboratoriais para diversos tipos de infecções (incluindo covid-19).
Saiba mais
Em um passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico era deixado para filmes de
ficção científica, aqueles em que um médico high-tech coleta o sangue do paciente, passa em uma
máquina e depois de alguns segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e quais os
medicamentos utilizar.Hoje, esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com filmes,
pois a população tem acesso aos testes de forma mais fácil e barata. É importante ressaltar que, no
Brasil, existem algumas empresas com esse perfil. 
Sempre que pensamos nos testes moleculares, automaticamente, temos a ideia de perfeição, por se tratar de
tecnologia de ponta, pela propaganda ser sempre bem feita e por ser algo muito misterioso, de entendimento
distante do senso comum. Apesar de muitos acharem que os resultados de testes genéticos são absolutos,
isso não é uma verdade: eles estão sujeitos a erros assim como qualquer teste de laboratório e a maioria
desses erros ocorre justamente na fase pré-analítica, que compreende desde a coleta do material até o
cadastro e armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise propriamente dita.
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Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, como sangue, escarro,
amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos detectar a presença
tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos, conseguindo verificar e quantificar
a presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a predisposição ou o estado de doenças genéticas; e
fazer os famosos testes de paternidade. Além disso, é amplamente utilizado em perícias médicas: o jornalista
Tim Lopes foi identificado com auxílio dos testes moleculares.
Jornalista Tim Lopes
Arcanjo Antonino Lopes do Nascimento, conhecido como Tim Lopes, foi um repórter investigativo
brasileiro. Ele desapareceu em 2 de junho de 2002, porém sua morte somente foi confirmada no mês
seguinte, após exame de DNA dos fragmentos de ossos encontrados em um cemitério clandestino. 
Atenção
É importante destacar que, além das amostras biológicas, os testes moleculares podem ser realizados a
partir de cultura de células e de microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a
fase pré-analítica, para um resultado de qualidade. A coleta e manipulação de todas essas amostras,
assim como na coleta de qualquer material biológico, deve ser realizada seguindo todas as normas de
biossegurança, com utilização dos equipamentos de proteção individual, para evitar contaminação. 
Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta,
assinatura de quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem
identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a
presença de hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas.
Hemólise
Extravasamento de componentes intracelulares das hemácias para o meio extracelular, por conta de um
rompimento das membranas celulares. 
Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de
acordo com o procedimento realizado. É obrigação do
laboratório deixar evidente para os pacientes os critérios de
aceitação e exclusão de amostras para cada tipo de ensaio.
A quantidade de material genético extraído depende
diretamente do local de coleta, do número de células
presentes e pode variar conforme a idade do paciente, além
de depender diretamente das condições de transporte e
armazenamento.
Em algumas ocasiões, um resultado negativo em um exame pode ser resultado de um erro durante a fase pré-
analítica, uma vez que o material genético tem que estar viável para conseguir realizar as técnicas moleculares
que envolvem sua amplificação. É sempre preferível trabalhar com amostras frescas para melhorar o
rendimento.
Vamos conferir alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA:
Extração de DNA
Para extração de DNA, a coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso organismo, existem
moléculas capazes de degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de
íons metal para a sua atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de
agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65°C.
Extração de RNA
A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais cuidados. O RNA é uma molécula altamente
instável e que apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente pela ação de ribonucleases
(RNase). Essas enzimas não precisam de cofator para se ativar, são estáveis, ficando ativas mesmo
após a fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série materiais biológicos e na nossa pele.
É muito importante a adição de agentes estabilizadores (Os agentes estabilizadores de RNA são
reagentes que visam inativar enzimas capazes de degradar o RNA.) de RNA o mais rápido possível e
que o recipiente utilizado seja certificado como Ribonucleases (RNase) free, ou seja, livre de agentes
degradantes de RNA, estéril, e sempre deve ser manipulado com luvas!
Agora é hora de conhecer as peculiaridades de algumas amostras destinadas à extração do DNA/RNA. Vamos
lá?
Sangue e aspirado de medula óssea
Amostras de sangue e aspirado de medula óssea precisam ser armazenados junto a agentes anticoagulantes
para manter a estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a heparina (agente
anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas moleculares, dentre elas o
famoso PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR
É a técnica utilizada para amplificar a quantidade de material genético e que é fundamental para as
análises posteriores ou até pode ser utilizada como ferramenta principal de diagnóstico. 
Saiba mais
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis, sendo
normalmente utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para
essas amostras. A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA, apesar de ser mais utilizada e
indicada para amostras de sangue, também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA
pode inibir drasticamente a atividade da DNA polimerase se estiver em excesso. 
Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até 24 horas em temperatura ambiente. Na
temperatura de 2°C a 8°C, é estável por até oito dias. De forma diferente, o plasma fica estável apenas 5 dias
na temperatura de 2°C a 8°C, suportando tempos maiores se for congelado, e a amostra deve ser
transportada em ambiente refrigerado.
Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de congelamento-descongelamento. Para análise
de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e o plasma transferido para outro tubo estéril e livre de RNases
em até quatro horas da coleta.
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e, após a coleta, o aspirado pode
ser armazenado por até 72 horas na temperatura de 2°C a 8°C. Caso seja necessário maior tempo para o
processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20°C, assim a estabilidade do
material permanece por meses.
Atenção
A amostra só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos! 
Vamos entender um pouco mais a seguir:
Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente em solução estabilizante
de RNA. Caso não tenha essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em gelo seco e
analisada em até 4 horas.
 
O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a reação de PCR, então amostras que
tenham algum tipo de hemólise não são satisfatórias para análise. Além disso, caso haja necessidade
de remoção dos eritrócitos, esta deve ser feita de forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação
do grupo heme e causar problemas nos testes moleculares.Amostra de tecidos
As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão alojados no tecido e/ou o
diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas
amostras são as de escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o DNA
das células tumorais com as normais.
Saiba mais
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1g a 2g de tecido-alvo. No entanto, a
quantidade pode variar de acordo com o tecido. Apenas para termos uma ideia, 10mg de tecido fornece
cerca de 10µg de material genético. Essa quantidade já é suficiente para análise, mas sempre devemos
trabalhar com uma margem de segurança, pois possíveis perdas de material podem ocorrer. 
Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C) ou
manter esse tecido em solução de preservação de ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo de
material em temperatura ambiente por muito tempo.
Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gazes umedecidas com salina para evitar ressecamento, além
da solução de preservação de ácidos nucleicos. Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases e devem
ser processados ou congelados o mais rápido possível!
Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de tecidos para exame
histopatológico não devem ser empregados para os exames de biologia molecular!
A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado.
Observe a estabilidade do DNA nas seguintes condições:
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• 
 
Mantido em banho de gelo triturado ou refrigerado em temperatura entre
2°C e 8°C
Até 24h
Congelado a -20°C
Duas
semanas
Congelado a -70°C Dois anos
Eldio dos Santos.
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a amostra deve permanecer em
ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser rapidamente congelada em
nitrogênio líquido (-196°C) antes de ser congelada a -70°C, processada em no máximo uma hora após a coleta
ou colocada em solução estabilizadora do RNA. No momento da extração, as amostras não podem ser
descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração (chamado agente
de extração, geralmente isotiocianato de guanidina). Os tubos de coleta também devem ser livres de RNases,
estéreis e apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do RNA.
Normalmente, em temperatura de -20°C, as RNases ainda estão ativas, assim, é recomendado manter as
amostras para análise de RNA em temperaturas inferior ou igual a -70°C.
Células bucais
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada por meio de um raspado de
células da parte interna da boca utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames
microbiológicos) ou a partir do bochecho. Para extração de RNA, essa amostra deve ser inserida em um tubo
contendo solução estabilizante de RNA/DNA. De forma diferente, amostras para extração de DNA podem ser
secas ou estabilizadas e transportadas à temperatura ambiente. As amostras estabilizadas dentro do tubo
possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser transportadas sem maiores
cuidados.
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados
para coletar material presente na orofaringe e na
nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em
que o agente infectante colonize as vias respiratórias, como
o novo coronavírus e o vírus influenza.
Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o
paciente realizar o procedimento em casa: o swab deve ser
esfregado na parte interna da bochecha, cerca de 10 vezes
de cada lado e, em seguida, inserido no tubo que vem no kit
contendo a solução estabilizante. Os erros mais comuns que ocorrem nesse tipo de abordagem são: o
paciente descartar a solução estabilizante, a contaminação do swab com restos de alimentos, batom e em
outros casos até mesmo o paciente não identificar corretamente o tubo.
Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão raro encontrar, nas amostras
encaminhadas para o laboratório, o DNA de alimentos, como frango, bovino etc. nos testes onde
supostamente era para ser feita a detecção de DNA de um ser humano.
Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR)
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na
temperatura de 2°C a 8°C e, caso não seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de
-20°C. Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser
congelada. No entanto, caso a amostra tenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do congelamento. 
Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
Hipótese nula e hipótese verdadeira
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
Erro tipo 1 e tipo 2
Conteúdo interativo
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Diferença entre amostra aleatória simples e sistemática
Conteúdo interativo
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Verificando o aprendizado
Questão 1
Estudamos as diferenças entre hipótese nula e hipótese alternativa e os possíveis erros gerados a partir da
interpretação errada dessas análises. O erro tipo 1 consiste em:
A
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.
B
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.
C
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula e a alternativa são falsas.
D
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.
E
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.
A alternativa E está correta.
O erro tipo 1 acontece quando rejeitamos a hipótese nula, sendo esta verdadeira, ou seja, não aceitamos
que não existe relação causa-efeito. Sendo assim, temos um resultado falso-positivo. Um resultado falso-
positivo é quando, por exemplo, assumimos que um paciente tem uma doença, quando na verdade ele não
tem.
Questão 2
O armazenamento de amostras biológicas é fundamental para uma boa análise. Com base no que estudamos,
qual seriam as melhores condições para armazenamento de uma amostra de tecido, por mais de 1 semana,
para a extração de RNA?
A
Após a coleta, manter em temperatura ambiente.
B
Após a coleta, um rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C), seguido do congelamento a -70°C.
C
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C), seguido do
congelamento a -70°C.
D
Após a coleta, manter na temperatura de 2°C-8°C por 24 horas.
E
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C), seguido do
congelamento a -20°C.
A alternativa B está correta.
O RNA tende a uma maior estabilidade quando primeiro congelado em nitrogênio líquido (-196°C), e depois
em -70°C. Na temperatura de -20°C, as RNases que ainda estão presentes no tecido podem degradar o
RNA ao longo do tempo. Além disso, amostras de tecidos para análise de material genético não podem ser
fixadas em soluções fixadoras como o formol!
2. Extração e quantificação do material genético
Extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas
Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos para colocar a mão na massa! Vamos
então estudar de fato como é feita a extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas para a
obtenção do nosso material genético.
No entanto, antes de começarmos a estudar a
extração, é interessante relembrar que qualquer
técnica ou procedimento utilizado no
laboratório – seja ele qual for – é como fazer um
bolo, e por isso devemos seguir determinada
receita.
No laboratório, chamamos a receita de POP
(procedimento operacional padrão) e temos
que ter os ingredientes(os reagentes) e os
utensílios para fazer o bolo (os materiais e
instrumentos).
 
Ler a receita e fazer o bolo é um processo mecânico, qualquer pessoa com um mínimo de conhecimento e que
saiba como manusear os instrumentos consegue seguir o passo a passo, e dependendo da experiência, vai
conseguir ter um resultado satisfatório.
No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou pode ser que não saia. Dessa forma,
percebemos que é importante saber qual é a função de cada componente do bolo para entendermos o
processo como um todo. Caso o bolo saia pequeno, faltou fermento, se ele saiu seco é porque faltou leite, e
assim temos uma noção de causa-efeito. O inverso também é válido: podemos saber tudo sobre como
funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura usada no fermento, a temperatura ideal para assar o
bolo, qual a importância de cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como mexer o
bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não funciona!
Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os conceitos teóricos da extração do
DNA e depois ver como funciona o passo a passo da técnica.
Atenção
Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que, após a obtenção de nossa amostra,
devemos sempre tomar cuidado onde ela será manipulada e com a preparação dos reagentes, evitando,
assim, a contaminação com materiais genéticos de outros organismos, ou até mesmo com enzimas que
podem degradar o nosso material de estudo e gerar resultados falhos. 
Procedimentos de extração de dna
As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma bicamada fosfolipídica, além de
diversos elementos dispersos no citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios e os
elementos minerais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, entre outros). Além disso, a célula eucarionte também
possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA majoritariamente.
Para a extração do DNA, todos os outros
elementos são considerados contaminantes,
até mesmo o RNA. Assim, a estratégia básica
da extração de DNA é, então, separar o DNA de
todos esses outros elementos que não são
DNA. Existem algumas formas diferentes de se
fazer isso, mas alguns procedimentos devem
ser feitos independentemente da forma de
extração. A partir da amostra de células, a
primeira etapa a ser realizada é o rompimento
da parede celular (quando as células são de
origem vegetal ou fungos), da membrana
plasmática e da membrana nuclear, liberando,
assim, o material genético.
 
Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de detergentes específicos de desestabilizar a
membrana celular e nuclear, abrasão física, ação de enzimas capazes de degradar a membrana e/ou parede
celular, pressão osmótica, aquecimento, entre outras.
Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas, é importante adicionar uma enzima
capaz de destruir outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as DNases, impedindo a
degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um contaminante, basta adicionar
RNase no meio. Nessa etapa, já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam os carboidratos e os
elementos minerais.
Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3 principais.
Adição de solvente orgânico
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar que já degradamos lipídeos e
RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a parede celular. Mas o que acontece?
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas insolúveis, assim como os carboidratos e todos os elementos
minerais. Após a adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:
Fase aquosa: DNA
Nesta fase superior, o DNA, que não é
solubilizado nos solventes (fenol ou
clorofórmio), vai permanecer na fase aquosa.
Fase orgânica
Nesta fase, todos os outros elementos irão para
a fase orgânica (inferior), como proteínas,
lipídeos, RNA degradados, carboidratos e
outros elementos minerais solúveis em fenol/
clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para outro tubo.
Saiba mais
O RNA degradado se torna nsolúvel, pois forma reações de complexação com outros elementos do
citoplasma. Se estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico. 
Solução concentrada de NaCl
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados do citoplasma, deixando o
DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado, ou seja,
recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse.
Pellet
Pequena porção precipitada de uma solução.
Coluna de adsorção do DNA
O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato. Assim, podemos adicionar uma coluna com
carga positiva (normalmente é utilizada uma coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa forma, o DNA
vai ficar retido na coluna devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar direto pela coluna,
ficando no fundo do tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de eluição carregado
negativamente em grande quantidade. Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl ou o EDTA. Eles irão
competir com o DNA pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em grande quantidade, ganham a
competição e se aderem à coluna expulsando o DNA. O procedimento é feito também por centrifugação,
porém o material que sairá da coluna será rico em DNA.
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, precisamos eliminar qualquer
resíduo que por um acaso ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que precipita
apenas o DNA. Após centrifugação, como o DNA encontra-se precipitado, nosso DNA puro encontra-se no 
pellet.
Curiosidade
O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 70%, por exemplo, para
remover todos os reagentes e secar o tubo, que o DNA continua aderido ao tubo. 
A etapa final consiste em ressuspender DNA (técnica que possibilita que um pellet volte a ficar em solução),
em água ou em tampão de eluição, basta adicionar um pouco do líquido escolhido e forçar a quebra do pellet,
no final de todo o protocolo, teremos um tubo contendo apenas o DNA puro.
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo geral de extração
de DNA. No entanto, depois da lise da membrana e precipitação das proteínas citoplasmáticas, é
adicionada uma solução de NaOH com pH bastante básico a ponto de desnaturar o DNA
cromossomal e o também o próprio DNA plasmidial. Em seguida, é adicionada uma solução ácida
neutralizadora que regenera o DNA plasmidial, mas não o cromossomal. Assim, podemos então
separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em suspensão enquanto o DNA
cromossomal precipita.
Agora que sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos simular uma situação em que estamos
no laboratório e temos que extrair o DNA de uma amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o protocolo
desenvolvido pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) (OLIVEIRA et al., 2007).
Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de um POP utilizado em uma situação
real. Parece desafiador, mas não se assuste, vamos juntos!
A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São eles:
Tampão de digestão 
No POP da EMBRAPA, o tampão de digestão é formado por NaCl 100 mM; Tris-HCl com pH 8.0 10 mM;
EDTA, com pH 8.0 25 mM; SDS 0,5% (usado como detergente) e proteinase K 0,1 mg/mL.). 
 
Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico - (25:24:1) 
O álcool isoamílico serve para prevenir a formação de espuma quando a mistura é agitada, facilitando a
separação da fase orgânica da aquosa. 
 
Microtubos de polipropileno; frascos e bastões esterilizados. 
 
Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM compH 8.0; tris = hidroximetil aminometano)
Solução em que o pH permanece em uma determinada faixa de pH, mesmo após a adição de
substâncias ácida ou básica, a não ser que o “tamponamento” seja extrapolado). 
 
Etanol 70%; etanol absoluto; acetato de amônio 7,5M; micropipetas de 1mL, 200μL, 100μL e 10μL. 
 
Centrífuga. 
 
Isopor com gelo. 
 
Vidraria de laboratório; banho-maria a 50°C.
Após conferirmos todo o material, vamos começar a extração do DNA de um tecido de origem animal, e que
por isso não apresenta parede celular. 
Dica
Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar armazenada no gelo, para manter a
temperatura entre 2°C a 8°C. 
Vamos entender melhor esse processo:
Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver grande quantidade de
líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o líquido em excesso. Na primeira etapa da
extração, adicionamos o tampão de digestão, na concentração de 1,2mL de tampão para cada 100mg
de tecido.
 
Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por cerca de 8 a 16 horas, para garantir a
digestão completa das membranas plasmáticas e nucleares e proteínas. No final, o material
apresentará um aspecto viscoso. O tempo de incubação no banho-maria varia de acordo com o
tamanho da amostra.
 
A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e precipitação dos compostos indesejáveis. Para isso,
o tubo é retirado do banho-maria e esperamos ele chegar a 37°C para adicionar 5μL de RNase, e
depois incubamos por 15 minutos sob leve agitação. A adição de RNase é opcional e deve ser
empregada quando o RNA é considerado um contaminante.
 
Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico é adicionada na proporção de 1:1 com a
quantidade de amostra do tubo, ou seja, para cada 500μL de material, adicionamos 500μL de solução
de fenol. É importante atentarmos para o pH da solução de fenol, pois em pH abaixo de 7.0 o DNA é
degradado e vai para a interface, região entre a fase orgânica e a fase aquosa, mas é preconizado para
extração de RNA. Resumindo: a solução de fenol com pH em torno de 7.0 é usada para extração de
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DNA e em pH entre 4,5 e 5,5 é usado na extração de RNA.
 
Após a adição do fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por dez minutos a 1.700g. Uma vez
com as fases aquosa e orgânica bem definidas, separamos a fase aquosa contendo o DNA e
descartamos a fase orgânica com todos os contaminantes. Nessa etapa, é importante separar bem as
fases, pois o fenol pode ser um contaminante, então é recomendado centrifugar duas vezes.
 
A terceira fase é a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. Antes de usarmos o etanol
em si, adicionamos meio volume de acetato de amônio 7,5M e dois volumes de etanol absoluto.
Nesse POP do EMBRAPA, o etanol é utilizado como agente precipitante do DNA, entretanto poderíamos
utilizar o isopropanol também.
Saiba mais
A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer sistema, supondo um volume de
500μL de fase aquosa, meio volume significa 250μL e dois volumes significam 1.000μL. 
O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol absoluto, além de concentrar o DNA,
também ajuda a remover os resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a amostra a 1.700g
por cerca dois minutos. Após a centrifugação, será possível visualizar o >em>pellet bem aderido ao fundo do
tubo. Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos ressuspender o pellet em etanol 70%.
Centrifugamos novamente a 1.700g por dois minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é deixar o tubo
aberto por um tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo, a fase final é a adição do
tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA, ou ainda podemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por
algumas horas.
Recomendação
Vale lembrar que, nesse exemplo, estamos extraindo o DNA a partir de amostras de tecidos. No entanto,
existem variações do protocolo. Mesmo que a amostra também seja proveniente de tecido, o protocolo
pode ser modificado, com a utilização de outros reagentes. Entretanto, esse é o procedimento básico e
em geral usado em laboratórios para extração de DNA. 
Procedimentos de extração de RNA
O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o RNA sendo
mais frágil e demandando mais cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra deve ser tratado
com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free. Além disso, a amostra
deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma RNase remanescente.
Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as diferenças entre
a extração do DNA e RNA.
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Fase 1
Quebra da membrana - A quebra pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de
digestão, usando um pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de utilizar energia das ondas
sonoras para agitar partículas. Esta técnica apresenta uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a
chance de degradação do RNA.
Fase 2
Extração do RNA - Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de RNA
deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na interface
(essa fase intermediária só é formada durante a extração do RNA devido ao pH ácido).
Fase 3
Purificação do RNA - A purificação do RNA é muito parecida com a do DNA, a diferença está no
armazenamento: para RNA é preferível utilizar nitrogênio líquido.
Vamos acompanhar o passo a passo a seguir:
Extração de DNA/RNA
Amostra inicial com as células digeridas.
Adição de solução fenol/clorofórmio
Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no
fundo do tubo) e aquosa (em azul acima da fase orgânica). No tubo A, temos
DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no tubo B o DNA degradado fica na
interface.
Separação da fase orgânica por centrifugação
A fase orgânica é descartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo.
Adição de acetato de amônio e etanol absoluto
Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o
líquido restante é descartado.
Ressuspensão e armazenamento do material genético extraído
O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser
armazenado.
Importância do DNA na Biologia Molecular
Confira agora a importância do DNA na Biologia Molecular, entendendo como o material genético obtido será
utilizado.
Conteúdo interativo
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Armazenamento do DNA e do RNA purificados
Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados imediatos. Para o DNA, devemos
armazená-lo em um tubo de plástico (DNA tem afinidade por vidro, por isso o uso de tubos de plástico),
preferencialmente de propileno, vedado a fim de evitar evaporação, em uma temperatura abaixo de 0°C.
Dessa forma, diminuímos a atividade biológica das DNases.
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA nessas condições,
é bastante alta. Confira:
Propileno
Tipo de polímero que não interage com o DNA.
 
Temperatura ambiente Até 26 semanas
Temperaturas baixas de 2°C a 8°C 1 ano
Congelado a -20°C 7 anos
Congelado a -70°C +7 anos
Atenção
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha água, pois a água
quando congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos. 
Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70% congelado na
temperatura de -70°C. Alguns estudos mostram que, após 2 meses, mantido na temperatura de -20°C, o RNA
não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que, na temperatura de -20°C, ainda temos
uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o congelamento em temperaturas de -70°C ou
inferior. Assim como no DNA, os tubos devem ser deplástico estéril e manuseados com luvas limpas por uma
solução de água com dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou então por tubos
com garantia de serem RNase-free.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos suscetível a
agentes degradantes.
Quantificação, análise de pureza e integridade do material
molecular
A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais importantes da Biologia Molecular,
pois esses materiais servem de matéria-prima para diversas outras técnicas da Biologia Molecular, como a
reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento, clonagem, hibridização, entre outras. Uma boa
extração determina a qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de qualidade da extração é dado
pela quantificação, pureza e integridade desses materiais.
Vamos entender melhor esses procedimentos?
Quantificação
Na quantificação, determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra inicial. A técnica mais
utilizada é a fluorometria. Nesta técnica, uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo, onde
é adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e assim
podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja, quanto maior for a
fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
Uma vantagem dessa técnica é que ela é simples e, após a quantificação, sabemos se temos a quantidade de
material suficiente para as próximas etapas. Além disso, podemos utilizar diferentes agentes fluorescentes:
um específico para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o quanto temos de cada um
desses materiais moleculares. 
Quantificação do DNA fluorescente. Na foto, temos o gráfico de duas amostras de
DNA diferentes. Tradução: dsDNA = double-strand DNA; A1= amostra 1; A2=
amostra2
Pureza
Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A pergunta aqui é: será
que com o material extraído temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e algum
reagente residual?
Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena parte de todo o espectro de
radiação eletromagnética existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os
comprimentos de ondas inferiores estão na zona de espectro da ultravioleta (UV) e superiores na zona de
infravermelho. Quando uma luz branca passa por um prisma, ela se decompõe em raios de luz de diferentes
comprimentos de onda, variando do vermelho ao violeta. Em um arco-íris, por exemplo, enxergamos 7
diferentes cores, cada uma dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de onda.
Comprimento de onda no espectro da luz. UV e infravermelho não são visíveis
Além disso, é importante relembrar que todo o composto químico apresenta a capacidade de absorver,
transmitir ou refletir a luz em determinado comprimento de onda.
Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de
absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um
equipamento chamado de espectrofotômetro.
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as biomoléculas apresentam
espectros característicos ao UV, visível ou infravermelho. Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas
absorvem comprimentos de onda de 280nm; o RNA e DNA absorvem no comprimento de onda de 260nm e o
fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230nm.
Saiba mais
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. Na prática, a
quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto
maior for a concentração, maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD). 
Confira o passo a passo para a realização dessa técnica:
Etapa 1 
Nesta etapa, precisamos indicar para o aparelho onde nossa amostra está diluída um procedimento
parecido com a tara da balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é colocado em uma
cubeta transparente e limpa, e no aparelho, ajustamos o comprimento de onda desejado.
Etapa 2
Nesta etapa, quando a luz incide na cubeta, apenas uma quantidade consegue ultrapassar a amostra
e o aparelho consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso gera um valor.
Etapa 3
Nesta etapa, como nesse momento apenas temos o tampão, informamos ao aparelho que esse é
nosso controle e que essa leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.
Etapa 4
Nesta etapa, colocamos a amostra com o material purificado em outra cubeta transparente e limpa e
medimos a luz absorvida, que representa a quantidade da substância analisada.
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos pesquisando (280nm, 260nm ou
230nm). Novamente, aqui, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado material.
Na imagem a seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, mostrando um pico de
absorção da luz no comprimento de onda 260nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.
Resultado de uma análise de espectrofotometria
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da densidade óptica (OD) no
comprimento de onda 260nm pela OD no comprimento de onda 280nm.
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. Valores inferiores a
esse indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de forma correta.
Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260nm OD 230nm, com material genético
considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2.
Integridade
Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a partir da técnica de 
eletroforese. A eletroforese é uma técnica com uma enorme quantidade de variações e desdobramentos e é
utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos nos ater ao princípio básico da técnica e a sua aplicação
no controle da integridade do material que foi extraído.
Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de um
campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e
géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem passar.
Saiba mais
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O DNA/RNA, devido ao grupamento
fosfato, apresenta carga negativa. Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho. 
Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, geralmente a agarose, inerte (que não
reage com a amostra) em um poço (local de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo elétrico
onde um polo do gel fica com a carga negativa (local onde a amostra é aplicada) e outra positiva. Como o
DNA/RNA possui carga negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse gel apresenta
poros, conferindo resistência ao movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e maiores ficarão
presas no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no gel.
Esquema da eletroforese para DNA
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o brometo de
etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento chamado
transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de
eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se apresenta “espalhada”
(arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem diversos fragmentos, ouseja, o DNA/RNA
não está íntegro.
Bandas bem definidas Bandas com arraste
Síntese de cDNA
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, PCR, sequenciamento,
clonagem e hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas técnicas
podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é suficiente para
analisar o que se deseja.
Vamos supor que queremos verificar se a expressão de uma proteína x está alta ou baixa nas células de um
tecido. Para isso, extraímos o DNA e o material purificado representa todo o DNA da célula, incluindo o gene x,
responsável pela expressão da proteína x. Entretanto, a detecção do gene x não indica muito sobre a
expressão da proteína, uma vez que não conseguimos saber se ele foi transcrito, se o Splicing alternativo
 gerou a proteína correta, se o RNAm foi devidamente processado. Nesse caso, o ideal é avaliar o RNAm, já
processado, sem a presença de Íntrons (trechos de RNA retirados do RNAm maduro durante o processamento
do RNA).
Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a amplificação e detecção, como PCR.
Splicing alternativo
Procedimento realizado pelas células para a maturação do RNA mensageiro (RNAm). 
Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem
uma infecção pelo novo coronavírus (Sars-
CoV-2), um vírus de RNA. Nesse caso, a
amostra extraída é o RNA viral, mas é inviável a
sua detecção, pois precisamos de grandes
quantidades de material, preferencialmente de
DNA, por ser mais estável. Logo, o material
precisa ser multiplicado o suficiente para poder
ser devidamente analisado. Para isso, usamos a
técnica do PCR, que consiste em amplificar uma
amostra de DNA.
Então fica uma dúvida: como fazer essa análise? Isso porque, segundo o dogma central da Biologia, o DNA é
transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína.
Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que
revolucionou a Biologia Molecular. Vamos entender como?
Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula-alvo, injeta o RNA viral no citoplasma. Lá, uma
proteína do vírus chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no núcleo e outra
proteína chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-alvo é capaz de
transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que forma outro vírus de
HIV, e assim continua o processo de infecção.
Comentário
Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é capaz de alterar o
dogma central da Biologia, transformando o RNA em DNA. 
E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA a partir de, por exemplo, um RNA
mensageiro (RNAm)? E assim foi feito.
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome pois é
complementar ao RNA molde.
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do cDNA.
 
Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.
 
Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do cDNA.
 
Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o funcionamento da transcriptase
reversa.
 
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Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se complementam ao RNA para dar início à
transcrição reversa.
 
DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos presentes.
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da transcriptase
reversa e início da sua atividade, formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma vez formado o cDNA, o fragmento
de RNA usado como molde é degradado pela RNase H, um domínio do próprio complexo da transcriptase
reversa.
Síntese do cDNA
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a construção do 
primers. Existem três estratégias gerais de construção de primers:
Oligo dt
É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda poli-A do RNAm
maduro. A cauda tem esse nome por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda serve
para proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção em direção
ao ribossomo. A cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o ribossomo. Ele
é preferencialmente utilizado quando queremos fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é importante
que o RNAm esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se o RNAm estiver
fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja não funcional.
Randômico
Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer RNA presente,
incluindo rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para amostras de
sequência desconhecida ou de difícil manipulação.
Específico
É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo utilizado quando se tem um
alvo determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é desenhado de forma
complementar ao RNA viral. Por isso, ao término da reação, só teremos cDNA se o primer encontrar o
seu RNA alvo. Para o primer específico, é fundamental que toda a sequência do DNA/RNA seja
conhecida.
É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser combinados, formando um primer com um
trecho oligo dT e outro trecho específico. Dessa forma, teremos uma transcrição da porção 3’ de um RNA
• 
• 
molde específico ou oligo dT com um randômico, para tentar formar cDNA de qualquer RNAm do material
inicial. A combinação de primers depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de otimizar a
síntese do cDNA.
Nesse ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela transcriptase reversa e uma fita de
RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro, sem a
presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação pela DNA
polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA.
Com isso, temos finalmente a fita dupla de DNA formada.
Formação da fita dupla de cDNA
Na imagem, vemos que o RNAm se liga ao primer oligo dT(1). Em seguida, a transcriptase reversa sintetiza
uma fita de cDNA (sequência de bases representada pela linha azul), a partir do primer oligo dT ligado ao
RNA(2). A RNAse H quebra o RNAm associado ao cDNA recém sintetizado. Os dNTPs presentes no meio
reacional são usados para a construção de uma nova fita de DNA complementar ao cDNA, pela ação da DNA
polimerase(3). Com isso, a fita dupla de cDNA é formada (4).
A construção de cDNA tem como funções principais:
Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica, estabelecendo relações de quais genes podem
expressar determinadas proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração de terapias, estudo de
espécies, doenças etc.
 
Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.
 
Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada proteína no organismo.
 
O cDNA pode ser utilizado na clonagem (formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo),
criação de bibliotecas (responsáveis por identificação e armazenamento de informação gênica), testes
de microarranjo (coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para estudos de genotipagem,
expressão, entre outros), detecção de SNP (do inglês Single Nucleotide Polymorphism, são variações
pontuais encontradas ao longo do DNA, isto é, são diferenças num único nucleotídeo), etc.
Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.
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Quantificação de DNA/RNA
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Entendendo a espectrofotometria
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Entendendo a eletroforese
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Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.O que é cDNA?
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Verificando o aprendizado
Questão 1
Vimos que existem diferentes técnicas para avaliação da qualidade das amostras de DNA e RNA obtidas. Além
disso, vimos que uma das técnicas é a mais utilizada para quantificar as amostras. Sobre esse assunto,
marque a alternativa correta.
A
Espectrofotometria: conseguimos quantificar a partir do valor de luz refratada.
B
Eletroforese: quantificamos a partir do tamanho da banda final gerada.
C
Fluorometria: quantificamos a partir da intensidade da fluorescência.
D
PCR: quantificamos a partir da quantidade de DNA final gerado.
E
Precipitação em NaCl: quantificamos a partir do tamanho do pellet gerado.
A alternativa C está correta.
A técnica mais utilizada para quantificação de amostras de RNA e DNA é a fluorometria, a partir da
detecção da fluorescência, podemos inclusive diferenciar o RNA e o DNA com essa técnica. Também
podemos usar a espectrofotometria, mas esta é limitada, uma vez que RNA e DNA se encontram na mesma
faixa de absorção de luz.
Questão 2
A extração de DNA/RNA é uma importante técnica de biologia molecular a qual pode ser empregada em
amostras clínicas, alimentos, forenses, plantas entre outras. A partir da extração de DNA/RNA, é possível a
realização de outras técnicas moleculares como a quantificação de material genético e reação em cadeia de
polimerase (PCR). Sobre a técnica de extração de DNA/RNA, responda qual desses elementos abaixo é
empregado na extração de DNA/RNA?
A
Transcriptase reversa
B
Nucleotídeos
C
Solução de fenol/clorofórmio
D
RNA molde
E
Mg2+
A alternativa C está correta.
Todos os itens citados são utilizados em algum momento na síntese do cDNA, com exceção da solução de
fenol/clorofórmio. Esta é utilizada na extração de DNA/RNA. A transcriptase reversa faz a fita de cDNA a
partir do RNA, os nucleotídeos são usados para a construção do cDNA, o RNA molde é o que queremos
usar para ter o DNA complementar e o Mg2+ é um cofator da reação da transcriptase reversa.
3. Conclusão
Considerações finais
Ao longo desta jornada, aprendemos que é possível usar o método científico para quase todas as ações do
nosso dia a dia. Vimos também que o desenho experimental é uma ramificação do método científico.
Visitamos todas as suas etapas, variáveis, hipóteses, erros e o tipo de amostragem que devemos utilizar para
chegar a uma conclusão confiável.
Com o desenho experimental em mente, partimos para as etapas pré-analíticas de transporte, coleta e
armazenamento do material biológico seguido da extração de DNA e RNA, e o controle de qualidade do
purificado obtido.
Por fim, entendemos a importância do cDNA e a técnica de construção do cDNA. Esse foi, sem dúvida um
marco que possibilitou o aprofundamento de diversas técnicas da Biologia Molecular. Ao longo dos anos, a
Biologia Molecular está sendo desenovelada, mostrando a sua face e permitindo que você adentre ainda mais
em seus conceitos. Agora cabe a você continuar esta jornada!
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Ouça agora um resumo do tema estudado.
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Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema:
 
Assista:
 
Ao vídeo Como é feito um TESTE DE DNA?
Ao vídeo Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose.
 
Leia:
 
Aprenda a fazer extração de DNA em casa, Hemocentro da FMRP-USP, e conheça a técnica de
extração utilizando cebola e materiais que temos dentro de casa.
O artigo Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular, de Murilo
Rezende Melo e colaboradores (2010).
Referências
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