Aula 07. Regulação da Expressão Gênica

Prévia do material em texto

Rafael Felippe Valverde 
valverde@biof.ufrj.br 
Lab. de Físico-Química Biológica G-37 
 
 
Biologia Celular para Nanociências e Nanotecnologia 
IBCCFº UFRJ 
 
Março 2012 
 
Figure 7-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
células de tecidos diferentes possuem 
caracteristicas estruturais e funcionais 
bastante distintas 
células perderiam genes ao se 
diferenciar? 
Figure 7-2a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
experimento clássico 
 
não há alteração na composição do DNA 
durante a diferenciação 
 
núcleo de célula somática injetado em um ovo 
-> desenvolvimento normal (girino) 
Figure 7-2b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
células vegetais isoladas podem reconstituir 
todo o “indivíduo” 
Figure 7-2c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
mesmo princípio foi demonstrado em 
mamíferos 
 
núcleo de células somáticas inseridos em 
célula sem núcleo (clones!) 
Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Diferenças nas 
Proteínas Expressas 
em Tecidos Humanos 
o quão diferentes são as células 
de um organismo multicelular? 
 
diversos processos são comuns 
a todas as células 
 
algumas proteínas são 
abundantes em algumas células 
e ausentes em outras (ex: 
hemoglobina) 
 
niveis de expressão de proteinas 
comuns varia (diagnóstico!) 
DNA microarray: genes expressos 
de forma distinta em diferentes 
tipos celulares e patologias!! 
Figure 7-5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Expressão Gênica de Eucariotos pode ser Regulada em 
Seis Momentos 
diferença entre tipos celulares 
depende dos genes que elas 
expressam 
 
várias oportunidades para regular a 
expressão!! 
Figure 7-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
proteínas regulatórias gênicas se 
ligam no DNA próximas aos genes 
regulados 
A Estrutura do DNA 
e a Regulação Gênica 
descoberta das proteinas 
regulatórias gênicas em bactérias 
 
repressor lambda: impede 
replicação viral 
 
 falha em responder a 
disponibilidade de nutrientes: 
repressor Lac 
como reconhecem o sítio de ligação? 
 
reconhecem as pontes de hidrogênio 
entre as bases? 
 
precisariam adentrar a dupla fita? 
Diferentes Pares de Base do DNA são Reconhecidos sem 
Abertura da Hélice 
parte externa da dupla fita (major 
groove) pode ser reconhecida por 
proteínas regulatórias!! 
padrões distintivos de doadores 
(azul) e aceptores (vermelho) de 
pontes de hidrogênio além de sitios 
hidrofóbicos (amarelo) para cada par 
de bases 
Figure 7-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Código de Reconhecimento do DNA 
padrões mais distinguiveis nas 
major grooves (contato 
preferencial das proteínas 
regulatórias) 
Table 7-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
sequencias nucleotídicas 
específicas são lidas como padrões 
de cacateristicas moleculares na 
superficie da dupla hélice de DNA 
 
cada uma é reconhecida por uma 
proteína específica 
Figure 7-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Proteínas Regulatórias Gênicas Reconhecem Sequências 
de DNA 
proteína regulatória gênica tem alta 
complementariedade com uma sequencia 
específica de DNA 
 
20 contatos em média entre o DNA e cada 
proteína 
embora cada reconhecimento DNA-
proteína seja único, motivos estruturais de 
contato são semelhantes 
 
α-hélices e folhas-β!! 
Figure 7-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Motivos hélice-loop-hélice 
motivo hélice-loop-hélice é encontrado em 
centenas de proteínas que se ligam ao DNA 
 
duas α-hélices mantidas em ângulo fixo 
contacta o 
DNA 
ajuda a 
posicionar 
Figure 7-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Algumas Proteinas Regulatórias com Motivos hélice-
loop-hélice 
proteínas com domínios hélice-loop-hélice 
podem variar bastante 
 
(cada uma apresenta seu domínio de uma 
forma diferente) (variabilidade!) 
proteínas com este motivo se ligam ao 
DNA formando dímeros separados pela 
distância de uma volta da dupla hélice 
Figure 7-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Sequencia de DNA Reconhecida pela Proteína Cro 
(Bacteriofago ) 
nucleotídeos reconhecidos pela proteina 
reguladora Cro são arranjados simetricamente 
(em verde) 
 
cada metade é reconhecida por um monômero 
de lambda Cro 
Figure 7-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Proteínas com Motivo Dedo de Zinco 
motivos dedo de zinco de dois tipos: 
 
01. estrutura simples onde o Zn mantém 
unidas uma -hélice e uma folha  (proteinas 
que ativam o gene do rRNA) 
enquanto hélice-loop-hélice são compostos 
apenas de aa os motivos dedos de zinco 
possuem um ou mais átomos de zinco como 
componentes estruturais 
Figure 7-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
A Ligação ao DNA por Proteínas Dedo de Zinco 
este tipo de dedo de zinco é encontrado 
in tandem (grupos continuos de -
hélices de varias proteínas contactando o 
DNA) 
Figure 7-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Dímeros de Domínios “Dedo de Zinco” de um 
Receptor Intracelular Ligado ao DNA 
02. outro tipo de dedo de zinco é encontrado em receptores 
intracelulares. duas -hélices são mantidas unidas pelo zinco 
 
formam dímeros permitindo que uma -hélice de cada 
subunidade interaja com o DNA 
Figure 7-19 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
O Motivo Zipper de Leucina 
e a Ligação ao DNA 
proteínas interagem com DNA sob a forma de 
dímeros (especificidade e força) 
 
geralmente domínio de ligação das proteinas 
regulatórias que interage com o DNA é 
diferente do domínio de dimerização 
motivo Ziper de Leucina combina as duas 
funções! 
 
-hélices de monômeros diferentes unidas 
por cadeias laterais de aa hidrofóbicos 
(leucinas) 
Figure 7-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Heterodimerização Expande o Repertório de 
Sequências de DNAs Reconhecidas 
proteínas regulatórias gênicas podem se 
associar em heterodímeros com duas 
subunidades diferentes 
 
especificidades diferentes dos monômeros 
aumentando a capacidade de interação com 
o DNA 
controle combinatório (diferentes proteínas 
atuando no controle de um mesmo processo 
celular) 
Figure 7-25 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Uma das Interações 
proteina-DNA mais Comuns 
superficies proteicas são extremamente 
variáveis 
 
combinação dos 20 aa gerando diferentes 
superfícies que reconhecem sequencias 
nucleotídicas específicas 
existiria um código ligando 
preferencialmente um par de bases a um 
determinado aa? 
Ligação de 
arginina com a 
G-C no DNA é 
comum 
Figure 7-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Interações entre Seis Domínios 
Dedo de Zinco Diferentes e suas 
Sequencias Específicas de DNA 
um mesmo par de bases pode ser 
reconhecido de diferentes maneiras 
dependendo do contexto 
embora aa arginina ligando a G seja comum 
a guanina tambem interage com serinas, 
histidinas, lisinas... 
Figure 7-27a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
bandas eletroforéticas podem ser eluidas e 
proteínas regulatórias separadas (identificação 
dos componentes regulatórios atuantes!!) 
Ensaio de Mudança de 
Mobilidade em Gel 
DNA tem carga negativa e migra quando 
submetido a campo elétrico 
 
mobilidade reduzida quando ligado a proteínas! 
Figure 7-29a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
DNA footprinting 
DNA ligado a proteínas regulatórias é 
resistente a nucleases 
 
tratamento do DNA com nucleases após 
incubação com proteínas regulatórias 
determina que região do DNA é 
contactada 
Figure 7-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Genômica Comparativa Identifica Sequencias 
Regulatórias 
grande conservação entre as espécies 
(identificação comparativade 
sequências regulatórias) 
Figure 7-34 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Os Genes que Codificam para Proteínas de Síntese de 
Triptofano em E.coli 
na presença de triptofano no meio: bloqueio 
da síntese 
genes que codificam enzimas de sintese do 
triptofano se encontram num mesmo operon 
 
sob controle do mesmo promotor (transcritos 
em um mesmo mRNA policistrônico) 
Figure 7-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Ligando e Desligando a Sintese de Triptofano 
operador é reconhecido por proteína da 
família hélice-loop-hélice chamada 
repressor triptofano 
presença do repressor ligado ao 
operador impede a ligação da RNA 
polimerase (transcrição inibida) 
operador (sequencia 
no interior do 
promotor) 
Figure 7-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Mudança de Conformação no Repressor Triptofano 
após a Ligação do Triptofano 
como neste caso a forma ativa da proteina 
serve para desligar um gene: controle 
negativo! 
 
proteina repressora transcricional 
ligação de dois aa triptofano levam a mudança 
conformacional que posicionam motivos de 
interação com o DNA do repressor 
Mudança de Conformação no Repressor Triptofano 
após a Ligação do Triptofano 
algumas seq. 
promotoras tem 
baixa afinidade 
pela RNA 
polimerase 
 
proteinas 
ativadoras 
transcricionais 
auxiliam o 
posicionamento da 
RNA polimerase 
Ex: CAP ativa a transcrição de genes no metabolismo de 
fontes alternativas de carbono (na ausência de glicose) 
Figure 7-38 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Algumas Proteínas Podem 
Atuar como Repressoras ou 
como Ativadoras 
proteínas ativadoras (ex: CAP) e 
repressoras (ex: repressor triptofano) tem 
motivos estruturais hélice-loop-hélice e 
requerem co-fatores para se ligar ao DNA 
algumas proteínas regulatórias podem atuar 
como repressoras ou ativadoras 
 
se a sequência operadora possui interseção 
com promotor, a polimerase não se liga 
Figure 7-39 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Operon Lac controlado por Ativadores e Repressores 
operon Lac: proteínas 
requeridas na 
metabolização de 
lactose (fonte alternativa 
de carbono) 
 
operon Lac é altamente 
ativado unicamente na 
presença de lactose 
(repressor desligado) e 
ausência de glicose 
(CAP ativador ligado 
pelo cAMP) 
na ausência de glicose: 
cAMP 
Figure 7-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Looping do DNA Ocorre Durante Regulação Gênica 
Operon Lac (dentre outros) 
possui mais de uma 
sequencia operadora 
 
operadores auxiliares 
 
repressor se liga a ambas as 
sequências distorcendo o 
DNA (repressão maior ) 
forma mais 
estável 
Figure 7-41a,b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Ligação em Sítios Distantes na Dupla Hélice Aumenta 
a Probabilidade de Interação de Duas Proteínas 
em azul: probabilidade de que proteinas 
representadas estejam interagindo 
maior probabilidade de interação 
com distancias 
intermdiarias/grandes 
Figure 7-42 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Ativação Gênica a Distância 
ex. de importância do looping: proteína 
NtrC quebra ATP e deforma a fita 
interagindo diretamente com a RNA 
polimerase (ativa a transcrição!) 
01. presença dos fatores de 
transcrição 
 
02. transcrição de genes 
individuais 
 
03. regulação por multiplas 
proteínas regulatórias 
 
04. complexo mediador 
 
05. empacotamento 
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos 
Proteínas Regulatórias Promovem a Montagem 
dos Fatores de Transcrição e da RNAPolimerase 
proteínas ativadoras 
atraem, posicionam e 
modificam os fatores 
de transcrição, a RNA 
pol e o mediador 
 
atuação direta ou 
alterando a cromatina 
DNA looping permite 
interação de proteinas 
reguladoras com 
promotor 
estrutura 
modular! 
Figure 7-46 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Proteínas de Ativação Gênica Modificam a 
Estrutura da Cromatina 
fatores de transcrição, 
mediador e RNA pol. não se 
montam ao promotor em 
nucleossomos 
 
proteínas regulatórias atraem 
proteinas de remodelamento, 
chaperonas, proteínas de 
modificação de histonas 
Figure 7-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Proteínas Regulatórias Gênicas atuam de 
Forma Sinérgica 
atuação de multiplas proteínas ativadoras da 
expressão gênica: efeito sinérgico (produto e 
não a soma) 
Proteínas Repressoras Gênicas Inibem a Transcrição 
de Diversas Maneiras 
proteínas repressoras de eucariotos atuam 
em genes individuais utilizando diferentes 
estratégias (não competem diretamente com 
a RNA pol) 
impedindo ligação do ativador 
 
ocluindo sítio de ativação da 
proteina ativadora 
 
Interação direta com 
maquinaria de transcrição 
repressores podem recrutar 
proteínas que tornam a 
expressão gênica mais difícil 
 
metilação, desacetilação, 
recrutamento de histonas 
Proteínas Regulatórias Gênicas Frequentemente 
Formam Complexos 
proteínas regulatórias podem participar de 
mais de um tipo de complexo regulatório 
 
individualmente proteínas regulatórias não são 
necessariamente ativadoras ou repressoras 
cada gene é regulado por um conjunto de 
proteínas cuja função depende da sua 
composição final 
Figure 7-52 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Visão Esquemática de um Complexo de Proteínas 
Regulatórias Ligadas a um Enhancer 
montagem da DNA-bending-protein permite a 
ligação coopperativa de outros componentes do 
complexo e ativação de alguns genes 
 
somente algumas células possuem esta proteina 
necessária para completar este complexo 
um gene só será expresso na 
presença da correta combinação 
de proteínas regulatórias 
(controle combinatório) 
Figure 7-59 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
A Atividade de Proteinas Regulatórias Gênicas é 
Regulada em Eucariotos 
8% do DNA codificante 
corresponde a proteínas 
regulatórias gênicas 
 
estas proteínas estão sujeitas 
a regulação por diversos 
processos biológicos 
Figure 7-62 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
proteinas regulatórias podem se ligar a 
milhares de nucleotideos de distancia dos 
genes 
 
o que impede que um conjunto de proteínas 
regulatórias influencie a transcrição de 
outros genes adjacentes? 
elementos isolantes previnem enhancers de 
ativar genes de forma imprópria 
 
bloqueia a comunicação entre enhancer e 
promotor quando localizada entre os dois 
Figure 7-63 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)