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AULA 05 2. CRESCIMENTO MICROBIANO 2.2 CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS ARA0023- MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA Como controlamos o crescimento microbiano no nosso dia a dia? Qual a importância desses métodos de controle? Processos: Esterilização Esterilização comercial Desinfecção Antissepsia Degerminação Sanitização TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO ESTERILIZAÇÃO • É o processo de destruição de todas as formas de vida microbiana (bactérias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e vírus) mediante a aplicação de agentes físicos e ou químicos. • Toda esterilização deve ser precedida de lavagem e enxague do artigo para remoção de detritos. • Esterilizantes são meios físicos (calor, filtração, radiações, etc.) capazes de matar os esporos e a forma vegetativa, isto é, destruir todas as formas microscópicas de vida. TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO ESTERILIZAÇÃO COMERCIAL • Uso do calor para matar os microrganismos patogênicos sem necessariamente degradar os produtos (alimentos). Ex.: Alimentos enlatados. DESINFECÇÃO • É o processo pelo qual se destroem particularmente os germes patogênicos e/ou inativa sua toxina ou inibe o seu desenvolvimento. • Os esporos não são necessariamente destruídos. • Na prática, o termo é mais comumente aplicado ao uso de uma substância química (desinfetante) para tratar uma superf́ície inerte ou substância. Quando esse tratamento é direcionado aos tecidos vivos, é chamado de antissepsia, e as substâncias químicas são, então, chamadas de antissépticos. TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO DEGERMINAÇÃO • Significa a diminuição, pela remoção de detritos e impurezas depositados sobre a pele, do número de microrganismos patogênicos ou não, após a escovação da pele com água e sabão, por exemplo. • É uma remoção mecânica. • Sabões e detergentes sintéticos, graças a sua propriedade de umidificação, penetração, emulsificação e dispersão, removem mecanicamente a maior parte da flora microbiana existente nas camadas superficiais da pele, também chamada flora transitória, mas não conseguem remover aquela que coloniza as camadas mais profundas ou flora residente. TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO SANITIZAÇÃO Prática destinada a reduzir as contagens microbianas a níveis seguros de saúde pública, e minimizar as chances de transmissão de doença de um usuário para outro. Isso normalmente é obtido por lavagem em altas temperaturas ou, no caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida por imersão em um desinfetante químico. TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO Procedimento ou conjunto de procedimentos que visam impedir a penetração de microrganismos em um local que não os contenha. Terminologia com relação ao efeito sobre os microrganismos Os nomes dos tratamentos que causam a morte direta dos micróbios possuem o sufixo “–cida” (significa morte). GERMICIDA – mata todos os microrganismos FUNGICIDA – mata os fungos BACTERICIDA – mata as bactérias VIRICIDA – inativa os vírus TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO Terminologia com relação ao efeito sobre os micro-organismos Outros tratamentos inibem o crescimento e multiplicação dos micro-organismos – seu nome tem o sufixo “–stático” ou “–stase” (significa parar). BACTERIOSTÁTICO – inibe o desenvolvimento bacteriano, porém uma vez que o agente é removido, o crescimento pode ser retomado. TERMINOLOGIAS DO CONTROLE MICROBIANO FATORES QUE INFLUENCIAM NA EFETIVIDADE DOS TRATAMENTOS MICROBIANOS NÚMERO DE MICRÓBIOS INFLUÊNCIAS AMBIENTAIS TEMPO DE EXPOSIÇÃO CARACTERÍSTICAS MICROBIANAS FATORES QUE INFLUENCIAM NA EFETIVIDADE DOS TRATAMENTOS MICROBIANOS FATORES QUE INFLUENCIAM NA EFETIVIDADE DOS TRATAMENTOS MICROBIANOS NÚMERO DE MICRÓBIOS – quanto mais micróbios existem no início, mais tempo leva para eliminar a maior parte da população. INFLUÊNCIAS AMBIENTAIS – a presença de matéria orgânica (sangue saliva, fezes) inibe a ação dos antimicrobianos químicos; meio em suspensão (com gorduras e proteínas) tende a proteger as bactérias. FATORES QUE INFLUENCIAM NA EFETIVIDADE DOS TRATAMENTOS MICROBIANOS TEMPO DE EXPOSIÇÃO – tratamentos de calor e radiação são muito dependentes do tempo; os agentes químicos necessitam de ação prolongada para que os endósporos sejam afetados. CARACTERÍSTICAS MICROBIANAS – os endósporos são difíceis de eliminar, e mesmo os micróbios em forma vegetativa exibem uma variação considerável em sua sensibilidade aos métodos de controle. FATORES QUE INFLUENCIAM NA EFETIVIDADE DOS TRATAMENTOS MICROBIANOS ALTERAÇÃO DA PERMEABILIDADE DE MEMBRANA A membrana plasmática é alvo de muitos agentes de controle microbiano. Esta membrana regula ativamente a passagem de nutrientes para dentro da célula e a eliminação de dejetos da mesma. A lesão dos lipídeos ou proteínas da membrana por agentes antimicrobianos causa o vazamento do conteúdo celular e interfere com o crescimento da célula. AÇÕES DOS AGENTES DE CONTROLE MICROBIANO DANO ÀS PROTEÍNAS E AOS ÁCIDOS NUCLÉICOS As pontes de hidrogênio (responsáveis pelas ligações químicas que mantém a estrutura tridimensional das moléculas proteicas) são suscetíveis ao rompimento pela ação do calor ou certos agentes químicos. Os ácidos nucléicos (DNA e RNA) são transportadores da informação genética e a lesão a estes pelo calor, radiação ou substâncias químicas é frequentemente letal para a células. Esta não pode ser replicar ou realizar funções metabólicas normais. AÇÕES DOS AGENTES DE CONTROLE MICROBIANO MÉTODOS DE CONTROLE MICROBIANO MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR Uma visita a qualquer supermercado demonstrará que a preservaçã̧o pelo uso de calor em alimentos enlatados representa um dos métodos mais comuns de conservação de alimentos. Meios de cultura e vidrarias de laboratório, assim como muitos instrumentos hospitalares, também são normalmente esterilizados pelo calor. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR Causa a morte microbiana através da desnaturação das proteínas (úmido) ou oxidação (seco). A resistência ao calor varia entre diferentes microrganismos. O calor usado na esterilização pode ser aplicado em duas diferentes formas: - CALOR ÚMIDO: fervura, vapor de fluxo livre, autoclave, pasteurização e UHT. - CALOR SECO: chama direta e ar quente (incubadora). MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR ÚMIDO Fervura (100°C – CNTP): Mata as formas vegetativas dos patógenos bacterianos, quase todos os vírus, fungos e seus esporos em 10 minutos. Vapor de Fluxo Livre (Vapor não pressurizado / temperatura semelhante à fervura): Os endósporos bacterianos e alguns vírus não são mortos, ou necessitam de tempo maior de ação para morte. Exemplo: Alguns endósporos bacterianos podem resistir à fervura por mais de 20 horas. IMPORTANTE! A fervura e o vapor de fluxo livre não são procedimentos confiáveis de esterilização. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR ÚMIDO - AUTOCLAVE A esterilização confiável com calor úmido requer temperaturas mais elevadas que a da água fervente. Essas altas temperaturas são mais comumente atingidas pelo vapor sob pressão em uma autoclave. Método preferencial de esterilização, usada a menos que o material possa ser danificado pelo calor ou umidade. Aumenta a pressão interna, e consequentemente a temperatura: 1 atm e 121 ºC. A esterilização em uma autoclave é mais efetiva quando os organismos entram em contato com o vapor diretamente ou estão contidos em um pequeno volume de solução aquosa. Sob estas condições, o vapor em uma pressão de cerca de 1 atm (15 psi) e 121º C, matará todos os organismos e seus endósporos em cerca de 15 minutos. MÉTODOSFÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR ÚMIDO - AUTOCLAVE A autoclave é um método usado para esterilizar meios de cultura, instrumentos, vestimentas, equipamento intravenoso, aplicadores, soluções, seringas, equipamento de transfusão e diversos outros itens que podem suportar altas temperaturas e pressões. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR ÚMIDO - AUTOCLAVE CALOR ÚMIDO - PASTEURIZAÇÃO Pasteurização lenta: em que se aplicam temperaturas mais baixas durante maior tempo (65°C por 30 minutos). Pasteurização rápida: quando se aplicam temperaturas mais altas (75°C) durante alguns segundos - HTST (High Temperature and Short Time) ou "alta temperatura e curto tempo". Pasteurização muito rápida, quando a temperatura vai de 130°C a 150°C, durante três a cinco segundos – UHT (Ultra High Temperature) ou "temperatura ultraelevada". MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO CALOR SECO CHAMA DIRETA: Usada em laboratório para esterilização da alça de inoculação (bico de Bunsen). INCINERAÇÃO: Método efetivo para esterilizar e eliminar papel, copos, sacos, bandagens contaminadas, material hospitalar. AR QUENTE: Menos efetivo que o calor úmido (vapor). Temperatura utilizada é 170ºC por 2 horas. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO Os materiais indicados para serem esterilizados são instrumentos de ponta ou de corte que podem ser oxidados pelo vapor, vidrarias, óleos e pomadas. FILTRAÇÃO Passagem de líquido ou gás através de um material semelhante a uma tela com poros pequenos o suficiente para reter os microrganismos. Usada para esterilização de materiais sensíveis ao calor: meios de cultura, enzimas, vacinas, antibióticos. • Uso de filtros de membrana. • Composição: ésteres de celulose ou polímeros plásticos. • 0,22 e 0,45 μm de porosidade. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO FILTRAÇÃO Uso de bomba à vácuo. O vácuo é criado para auxiliar a gravidade a puxar o líquido através do filtro. FILTROS DE PARTÍCULAS DE AR DE ALTA EFICIÊNCIA (HEPA – High Efficiency Particulate Air). Uso em salas cirúrgicas e ocupadas por pacientes queimados – redução de infecções. Removem quase todos (99,9%) dos microrganismos maiores que 0,3 μm de diâmetro. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO FILTRAÇÃO BAIXAS TEMPERATURAS O efeito depende do microrganismo e da intensidade da aplicação. Em temperaturas de 0 a 7º C a taxa metabólica da maioria dos microrganismos é reduzida – efeito bacteriostático. Psicrófilos ainda crescem lentamente em temperaturas de refrigerador – alteram o aspecto e sabor dos alimentos. Temperaturas baixas (abaixo do ponto de congelamento) obtidas RAPIDAMENTE tendem a tornar os micróbios dormentes – não necessariamente os mata. O congelamento LENTO é mais nocivo – os cristais de gelo que se formam e crescem rompem a estrutura celular e molecular dos microrganismos. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO RESSECAMENTO AUSÊNCIA DE ÁGUA – os microrganismos não podem crescer ou se reproduzir, mas podem permanecer viáveis por anos... Quando a água encontra-se presente seu crescimento é retomado. LIOFILIZAÇÃO – desidratação realizada em baixas temperaturas. Usado para preservar micro-organismos em laboratório. Alguns alimentos também passam por esse processo (p. ex., cafe ́ e alguns aditivos químicos de fruta para cereais secos). A resistência das células vegetativas ao ressecamento varia com a espécie e o ambiente do organismo. Ex.: a bactéria da gonorreia pode suportar a dessecação somente por cerca de uma hora, porém a bactéria da tuberculose pode permanecer viável por meses. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO PRESSÃO OSMÓTICA Uso de altas concentrações de sais e açúcares. Criam um ambiente hipertônico que ocasiona a saída da água da célula microbiana. Esse princípio é utilizado na conservação dos alimentos. No geral fungos e bolores são muito mais capazes de crescer em materiais com baixa umidade. Essa propriedade combinada com capacidade de crescer em condições ácidas é a razão pela qual as frutas e grãos são deteriorados por fungos. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO RADIAÇÃO Existem vários efeitos sobre as células, dependendo de seu comprimento de onda, intensidade e duração. Há dois tipos de radiação: Ionizante: raios gama, raio X e feixes de elétrons de alta energia. Não ionizante: luz ultravioleta (UV). MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO RADIAÇÃO IONIZANTE E NÃO IONIZANTE MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO MECANISMOS DE AÇÃO MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO PRINCIPAIS GRUPOS: 1. Álcoois; 2. Compostos fenólicos (fenóis); 3. Aldeídos e derivados; 4. Halogênios e derivados; 5. Biguanidas; 6. Agentes de superfície (detergentes); 7. Conservantes químicos de alimentos; 8. Quimioesterelizantes gasosos (gases); 9. Agentes oxidantes (peroxigênios); 10. Metais pesados. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO ÁLCOOIS • Causa desnaturação de proteínas e rompimento de membranas. • Vantagem de evaporação. • Não devem ser aplicados em feridas. • Mais utilizados: etanol e isopropanol. • Álcool puro é pouco efetivo. A concentração ótima de etanol recomendada é 70%. • Destroem efetivamente as bactérias e os fungos, mas não os endósporos e os vírus não envelopados. • Também são usados para aumentar a eficiência de outros agentes químicos. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO BISFENÓIS • pHisoHex - Utilizado em ambiente hospitalar e berçários. - Bem ativo contra estafilococos e estreptococos. • Triclosano - Usado desde a sabonetes a cabos de faca. - Inibe enzimas da biossíntese de ácido graxos. - Eficaz contra gram+ e menos eficaz contra gram- e fungos. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO HALOGÊNIOS E DERIVADOS • Alta Eletronegatividade: Rouba elétrons negativos, principalmente o flúor • Agentes Oxidantes MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO IODO • Um dos antissépticos mais antigos e mais eficazes. Ele é eficaz contra todos os tipos de bactérias, muitos endósporos, vários fungos e alguns vírus. • Disponível na forma de tinturas: solução de álcool aquoso. • Geralmente como iodoforo: combinação de iodo e molécula orgânica. • Usado para tratamento de feridas. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO CLORO • Atua como agente oxidante impedindo a maquinaria celular. • Formas gasosas também podem ser usadas como o dióxido de cloro. Cloro e hipocloritos (formulações): • Gás cloro comprimido (líquido) – desinfecção de água; • Hipoclorito de cálcio - desinfetar equipamentos de fábricas de laticínios e utensílios de restaurantes. • Hipoclorito de sódio - utilizado como desinfetante doméstico e alvejante (Clorox), como desinfetante em fábricas de laticínios, estabelecimentos de processamento de alimentos e em sistemas de hemodiálise. • A indústria de processamento de alimentos usa amplamente as soluções de dióxido de cloro como desinfetantes de superfície, pois não deixam odores ou sabores residuais. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO BIGUANIDAS • Controle microbiano de pele e mucosas (degermante). • Em combinação com detergentes e álcool é usada para preparação cirúrgica. • O seu efeito é causado devido a lesão na membrana plasmática, desnaturação proteica e inibição do metabolismo. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO A biguanida mais conhecida é a clorexidina, frequentemente usada no controle microbiano da pele e das membranas mucosas. Combinada a um detergente ou álcool, a clorexidina é frequentemente utilizada na escovação cirúrgica das mãos e no preparo pre ́-operatório da pele de pacientes. AGENTES DE SUPERFÍCIE • Sabões e detergentes; • Pouco valor como antisséptico e função importantena remoção mecânica - emulsificação das secreções oleosas da pele facilitando a remoção de microrganismos; • Pode romper a membrana plasmática. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO AGENTES SURFACTANTES • Diminuem tensão superficial: contribuem para umidificação e solubilização de substâncias. • Sabões cosméticos: maioria não possui atividade antimicrobiana. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO DETERGENTE ANIÔNICOS • Grupos carregados negativamente na molécula. • São utilizados em lavanderias. MODO DE AÇÃO: • Semelhante aos sabões; • Alguns lisam pneumococos e atuam contra alguns vírus com envelope lipídico. • Não são considerados desinfetantes. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO DETERGENTE CATIÔNICOS • Grupos carregados positivamente • Pouco tóxico MODO DE AÇÃO: • Lise da membrana citoplasmática e desnaturação de proteínas Ex.: cloreto de benzetônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de cetilpiridínio (Cepacol). MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO PEROXIGÊNIOS • São agentes oxidantes. • Desnaturação de proteínas e morte celular. • Peróxido de hidrogênio: Não é um bom antisséptico para feridas expostas, porém desinfeta efetivamente objetos inanimados, e chega a apresentar efeito esporocida. • O3 (ozônio) – Desinfetante (água) • Ácido Peracético - Esterilizante MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO METAIS PESADOS • Prata • Mercúrio • Cobre • Zinco: comum em soluções para bocheco MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO Por que os antibióticos só possuem ação direta contra bactérias e não contra vírus? A resistência bacteriana é uma das maiores ameaças à saúde global. Como surgem as bactérias multirresistentes? Quais são as ações que podem ser tomadas para desacelerar esse processo? ATUAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS • A droga deve atuar especificamente sobre uma estrutura da célula procariótica bacteriana e não ser tóxica para a célula eucarionte. • Os antibióticos e os quimioterápicos interferem com diferentes atividades da célula bacteriana, causando a sua morte ou somente inibindo o seu crescimento. BACTERICIDA BACTERIOSTÁTICO ESPECTRO DE ATIVIDADE Antibióticos podem variar com respeito a faixa de microrganismos que eles matam ou inibem: • Alguns matam somente uma faixa limitada: espectro restrito de atividade. • Outros matam uma larga faixa de microrganismos: amplo espectro de atividade. Por que essa diferença???? ESPECTRO DE ATIVIDADE ESCOLHA DO ANTIMICROBIANO A escolha do antimicrobiano mais apropriado requer o conhecimento: 1) da identificação do microrganismo; 2) da suscetibilidade do organismo com relação a um fármaco em particular; 3) do local da infecção; 4) de fatores do paciente; 5) da segurança do fármaco; 6) do custo do tratamento. Entretanto, alguns pacientes precisam do tratamento empírico (administração imediata do(s) fármaco(s) antes da identificação bacteriana e dos testes de suscetibilidade). MECANISMOS DE AÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS • Inibição da síntese da parede celular • Inibição da síntese proteica • Inibição da síntese de ácidos nucleicos • Destruição da membrana plasmática • Inibição da síntese de metabólitos essenciais RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA Desde que Alexander Fleming descobriu o primeiro antibiótico, a penicilina, em 1928, o homem e a bactéria disputam uma corrida e a liderança da competição vem se alterando o tempo todo. A previsão, porém, é de que os antibióticos terminem vencidos pelas bactérias. O uso indiscriminado (abusivo) dos antibióticos desde sua industrialização promoveu uma seleção natural das bactérias patogênicas (causadoras de doenças). Por isso as populações atuais desses microrganismos são bastante resistentes aos medicamentos. MECANISMOS GENÉTICOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA • Resistência Plasmidial - Certos plasmídeos possuem genes responsáveis por exemplo pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes que ele destrua a bactéria. • Quando dois ou mais tipos de plasmídeos estão presentes em uma mesma bactéria, os genes de um deles podem passar para outro por recombinação gênica. • Resistência Cromossômica - Como a resistência cromossômica depende de mutação espontânea, evento raro, ela é dirigida quase sempre a um só fármaco e os genes são transferidos com frequência relativamente baixa. • Transposons - são segmentos de DNA com grande mobilidade, eles codificam a enzima transposase - responsável por sua transferência para outros segmentos de DNA. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIBIOTICOTERAPIA O objetivo do tratamento antibiótico não é eliminar os sintomas, mas as bactérias. Se o tratamento é interrompido antes do prazo, as bactérias que ainda estão vivas, que são justamente as mais fortes, estão prontas para um novo ataque. Fiocruz Fiocruz O que não me mata me torna mais forte! BACTERIOLOGIA NA PRÁTICA CLÍNICA Foi confirmado que O.G. está com uma infecção urinária através de um exame de cultura de urina. Como saber qual é o melhor antibiótico a ser utilizado? ANTIBIOGRAMA • O teste de disco-difusão em ágar foi descrito em 1966, por Bauer e Kirby. O teste fornece resultados qualitativos. O seu princípio básico é a difusão do antimicrobiano na superfície do ágar, a partir de um disco impregnado com o mesmo antimicrobiano . ANTIBIOGRAMA • O teste é realizado dispensando os discos de papel-filtro, impregnados com antimicrobianos em concentrações fixas, sobre a placa de ágar (normalmente o Mueller-Hinton). • Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento ao redor de cada disco são mensurados em milímetros e relacionados à: sensibilidade da amostra bacteriana e velocidade de difusão do antimicrobiano no ágar. • As amostras bacterianas são categorizadas em sensíveis, resistentes ou intermediárias. Esse é o resultado do exame de O.G. Qual o antibiótico que vocês escolheriam para o tratamento? Amoxicilina Cefalexina Ciprofloxacino A resistência bacteriana é uma das maiores ameaças à saúde global. Como surgem as bactérias multirresistentes? Quais são as ações que podem ser tomadas para desacelerar esse processo?