Cromatografia: Método de Separação

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CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
LaboratLaboratóório rio 
de Qude Quíímica mica 
OrgânicaOrgânica
DefiniDefiniçção Geralão Geral
� A cromatografia é um 
método físico-químico de 
separação que se 
fundamenta na migração 
diferencial dos 
componentes de uma 
mistura devido a diferentes 
interações entre duas fases 
imiscíveis: fase móvel (gás, 
líquido ou um fluido 
supercrítico) e fase 
estacionária (fixa, colocada 
em uma coluna ou numa 
superfície sólida). 
Transporte dos componentes de Transporte dos componentes de 
uma amostra por uma fase muma amostra por uma fase móóvel vel 
atravatravéés de uma fase estacions de uma fase estacionááriaria
�A grande variedade de combinações 
entre fases móveis e estacionárias a 
torna uma técnica extremamente 
versátil e de grande aplicação.
�A cromatografia pode ser utilizada 
para a identificação de compostos, por 
comparação com padrões previamente 
existentes, para a purificação de 
compostos, separando-se as 
substâncias indesejáveis e para a 
separação dos componentes de uma 
mistura.
Histórico
� 1906 o botânico russo Mikhail Tswett 
descreveu suas experiências na 
separação dos componentes de 
extratos de folhas.
� Os termos cromatograma, 
cromatografia, método 
cromatográfico aparecem em dois 
trabalhos descrevendo suas 
experiências para separar pigmentos 
de um extrato de folhas (clorofila e 
xantofila) e gemas de ovo, utilizando 
uma coluna de vidro empacotada 
com CaCO3 finamente dividido (fase 
estacionária) e éter de petróleo (fase 
móvel). A separação dos 
componentes pode ser verificada por 
meio de faixas coloridas na coluna.
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
pigmentos
separados
Cromatografia (grego)
kroma [cor] + graph
[escrever]
� Apesar do estudo de Tswett e 
de outros anteriores que 
poderiam ser considerados 
precursores do uso dessa 
técnica, a cromatografia foi 
praticamente ignorada até a 
década de 30, quando foi 
redescoberta. A partir daí, 
diversos trabalhos na área 
possibilitaram seu 
aperfeiçoamento e, em 
conjunto com os avanços 
tecnológicos, levaram-na a 
um elevado grau de 
sofisticação, resultando no 
seu grande potencial de 
aplicação em várias áreas. Mikhail Semenovich Tswett 
(1872-1919)
ClassificaClassificaçção dos Mão dos Méétodos todos 
cromatogrcromatográáficosficos
Cromatografia
Planar Coluna
Centrífuga
(Chromatotron) CPCCD Líquida GasosaCSC
Clássica CGCLAE CGAR
� Segundo a forma 
física do sistema 
cromatográfico: 
cromatografia 
planar, 
cromatografia em 
coluna e centrífuga.
� Segundo o modo 
de separação:
adsorção, partição, 
troca iônica, 
exclusão ou 
misturas desses 
mecanismos.
Exemplos de fases estacionárias
� Segundo a fase estacionária utilizada: fase 
estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente 
ligadas.
Esqueletos fósseis 
(SiO2 + óxidos 
metálicos) de algas 
microscópicas
� Segundo a fase móvel empregada:
Cromatografia líquida – Na cromatografia líquida 
clássica (CLC), a fase móvel é arrastada através da 
coluna apenas por força da gravidade, enquanto que na 
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) se 
utilizam fases estacionárias de partículas menores, 
sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão 
para eluição da fase móvel.
Cromatografia gasosa - As separações podem ser 
obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por 
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A 
diferença entre as duas reside nos tipos de colunas 
utilizadas. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas 
capilares, nas quais a fase estacionária é um filme 
depositado na coluna.
Cromatografia supercrítica (CSC) - Utiliza-se um 
vapor pressurizado, acima da sua temperatura crítica.
Partição entre 
líquidos e 
superfície ligada
Espécies 
quimicamente 
ligadas a uma 
superfície sólida
Fase líquido-ligado
Partição entre 
fluido supercrítico 
e superfície ligada
Espécies orgânicas 
ligadas a uma 
superfície sólida
Fase móvel fluido 
supercrítico
Cromatografia 
com fluido 
supercrítico
AdsorçãoSólidoGás-sólido
Partição entre o 
gás e superfície 
ligada
Espécies ligadas a 
uma superfície 
sólida
Gás-ligadoCromatografia 
gasosa
Partição entre gás 
e líquido
Líquido adsorvido 
em um sólido
Gás-líquido
Partição ou 
filtração
Liquido em 
interstícios de 
sólido polimérico ou 
gel polimérico
Exclusão por 
tamanho ou gel 
filtração
Troca iônicaResina de troca-
iônica
Troca iônica
AdsorçãoSólidoLíquido-sólido ou 
adsorção
Cromatografia 
Líquida
Partição entre 
líquidos imiscíveis
Líquido adsorvido 
em um sólido
Líquido-líquido ou 
partição
Tipo de 
equilíbrio
Fase EstacionáriaMétodoClassificação
CentrCentríífuga fuga -- CHROMATOTRONCHROMATOTRON
� Chromatotron é uma 
cromatografia em camada 
delgada preparativa e 
acelerada centrifugamente.
� Foi desenvolvida pelos 
autores do Compendium of 
Organic Synthetic Methods. 
Substitue as CCD 
preparativas, pequenas 
colunas e HPLC. Com 
dimensiões ~ 30 cm. 
� US Patent no. 4139458. 
Pendentes em outros 
países
PrincPrincíípio de operapio de operaççãoão
� A amostra a ser 
separada é aplicada 
como uma solução no 
centro do disco giratório 
umedecido com o 
solvente.
� A eluição com solvente 
gera bandas circulares 
de separação dos 
componentes que são 
removidos juntamente 
com o solvente para um 
tubo de recepção. 
� Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total.
� Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata. 
� Solventes: Compatível com todos os solventes comumente 
usados nas outras técnicas cromatográficas, inclusive ácido 
acético. Não apropriada para uso com ácidos minerais.
� Vantagens especiais: 
* Não aplicação de “spot” ou raspagem de bandas. 
* Separações são rápidas, cerca de 20 min. 
* Permite a observação direta por UV ou de compostos 
coloridos durante a eluição. 
* Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade.
* Utiliza-se pouco solvente e a eluição por gradiente é fácil. O 
solvente é regenerado in situ, podendo ser re-utilizado. 
* Atmosfera de nitrogênio previne oxidação das amostras. 
* Compacta (facilmente removida de um laboratório para outro), 
poucos controles e não necessita altas pressões. 
* Baixo preço. Chromatotrons custam menos que um simple 
HPLC preparativo. 
Cromatografia em PapelCromatografia em Papel
� A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de 
partição líquido–líquido, estando um deles fixado a 
um suporte sólido. O suporte é saturado em água e 
a partição se dá devido à presença de água em 
celulose (papel de filtro). Este método, embora 
menos eficiente que a CCD, é muito útil para a 
separação de compostos polares, sendo 
largamente usado em bioquímica.
� Utiliza-se pequena quantidade de amostra 
(microgramas a miligramas). As manchas podem 
ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, 
soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de 
potássio, etc)
� Cromatografia em papel com fase normal (papel é
saturado com a fase estacionária polar, p. ex. 
água) e com fase reversa (papel é tratado com 
outro líquido, p.ex.: acetona e dimetilformamida, 
parafina, óleo, silicone, solventes orgânico).
Cromatografia em Camada DelgadaCromatografia em Camada Delgada
� A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de 
adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação dos 
componentes da mistura ocorre em função da migração 
diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo 
numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um 
líquido ou misturas de líquidos). 
� O fenômeno é principalmente de adsorção (partição ou troca 
iônica), a separação se dá pela diferença de afinidade dos 
componentes de uma mistura pela fase estacionária. Os 
adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina, 
celulose, terra diatomácea e poliamida.
� Utiliza-se pequena quantidade de 
amostra (microgramas a miligramas). As 
manchas podem ser reveladas por meio 
de luz UV, vapores de iodo, soluções de 
cloretoférrico e tiocianoferrato de 
potássio, fluorescências, radioatividade, 
etc.
� A CCD pode ser usada tanto na 
escala analítica quanto na 
preparativa.
� Por ser um método simples, rápido, 
visual e econômico, a CCD é a 
técnica predominantemente 
escolhida para o acompanhamento 
de reações orgânicas, sendo 
também muito utilizada para a 
purificação de substâncias e para a 
identificação de frações coletadas 
em cromatografia líquida clássica.
� O parâmetro mais importante a ser considerado 
em CCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a 
razão entre a distância percorrida pela substância 
em questão e a distância percorrida pela fase 
móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.
Cromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
� A cromatografia em coluna é uma técnica 
usada para a separação de muitos 
compostos orgânicos. Essa técnica 
fundamenta-se basicamente na polaridade 
relativa das moléculas envolvidas. 
� Utiliza-se tubos de vidro compactado com 
um material polar finamente dividido 
(suporte sólido ou fase estacionária), em 
geral, alumina ou silicagel, empacotado com 
um solvente orgânico ou uma mistura de 
solventes. 
� Uma solução contendo o composto que se 
deseja purificar é aplicada na superfície 
superior da fase estacionária, e após 
eluição coletar frações com volume 
predeterminados, as quais muito 
provavelmente conterão os componentes da 
mistura separados.
� Velocidade na qual um composto é
eluido da coluna depende de sua 
polaridade, da polaridade da fase 
estacionária e da polaridade do 
solvente utilizado como eluente. Se o 
composto é mais atraído pela fase 
estacionária do que pelo solvente, ele 
migrará mais lentamente da coluna. 
Caso contrário, se o composto tiver 
maior afinidade pelo solvente ele 
migrará mais rapidamente da coluna, 
gastando menos tempo e solvente. O 
êxito de uma coluna dependerá então 
da escolha de um suporte e solvente 
adequados para a sua realização. 
� Atualmente a técnica mais utilizada 
pelos químicos orgânicos para a 
separação de uma mistura de 
compostos é a cromatografia rápida: 
Coluna Cromatográfica Rápida (flash-
column chromatography) e Coluna 
Cromatográfica Rápida e a Seco (dry-
column flash chromatografy)
Variantes rápidas da 
cromatografia em coluna
Cromatografia Gasosa de Alta Cromatografia Gasosa de Alta 
ResoluResoluçção (CGAR) e Cromatografia ão (CGAR) e Cromatografia 
LLííquida de Alta Eficiência (CLAE)quida de Alta Eficiência (CLAE)
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
� O principal mecanismo de separação da 
Cromatografia Gasosa (CG) está baseado 
na partição dos componentes de uma 
amostra entre a fase móvel gasosa e a 
fase estacionária líquida. A utilização de 
fases estacionárias sólidas, as quais 
levariam à separação por adsorção, 
apresenta poucas aplicações.
� A cromatografia gasosa é uma das 
técnicas analíticas mais utilizadas. Além 
de possuir um alto poder de resolução, é
muito atrativa devido à possibilidade de 
detecção em escala de nano a picogramas 
(10–9 a 10-12 g). 
� A grande limitação deste método é a 
necessidade de que a amostra seja volátil 
ou estável termicamente, embora 
amostras não voláteis ou instáveis possam 
ser derivadas quimicamente.
Modelo de um CG moderno
Funcionamento do CromatFuncionamento do Cromatóógrafo Gasosografo Gasoso
� A amostra é vaporizada e introduzida 
em um fluxo de um gás adequado 
denominado de fase móvel ( FM) ou 
gás de arraste. 
� O fluxo de gás com a amostra 
vaporizada passa por um tubo 
contendo a fase estacionária FE 
(coluna cromatográfica), onde ocorre a 
separação da mistura.
� A FE pode ser um sólido adsorvente 
(Cromatografia Gás-Sólido) ou, mais 
comumente, um filme de um líquido 
pouco volátil, suportado sobre um 
sólido inerte (Cromatografia Gás-
Líquido com Coluna Empacotada ou 
Recheada) ou sobre a própria parede 
do tubo (Cromatografia Gasosa de 
Alta Resolução). 
Esquema de um CG e de um 
cromatograma
Equipamento bEquipamento báásico de um sico de um 
cromatcromatóógrafo a ggrafo a gáás s 
1 - Reservatório de Gás 
e Controles de Vazão / 
Pressão. 
2 - Injetor (Vaporizador) 
de Amostra. 
3 - Coluna 
Cromatográfica e Forno 
da Coluna. 
4 - Detector. 
5 - Eletrônica de 
Tratamento 
(Amplificação) de Sinal. 
6 - Registro de Sinal 
(Registrador ou 
Computador). 
� Na cromatografia gás-líquido (CGL), os dois fatores que 
governam a separação dos constituintes de uma amostra 
são: 
� a solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um 
constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna.
� a volatilidade: quanto mais volátil a substância (ou, em 
outros termos, quanto maior a pressão de vapor), maior a 
sua tendência de permanecer vaporizada e mais 
rapidamente caminha pelo sistema. 
� As substâncias separadas saem 
da coluna dissolvidas no gás de 
arraste e passam por um detector; 
dispositivo que gera um sinal 
elétrico proporcional à quantidade 
de material eluido. O registro deste 
sinal em função do tempo é o 
cromatograma, sendo que as 
substâncias aparecem nele como 
picos com área proporcional à sua 
massa, o que possibilita a análise 
quantitativa 
Exemplo de um cromatograma. 
Constituintes bConstituintes báásicos de um sistema sicos de um sistema 
cromatogrcromatográáfico e cuidados especiaisfico e cuidados especiais
� Reservatório de Gás de Arraste. O gás de arraste fica contido 
em cilindros sob pressão. O parâmetro mais importante para 
escolha do gás é a sua compatibilidade com o detector. Os gases 
mais empregados são H2, He e N2 e a vazão do gás de arraste, que deve ser controlada, é constante durante a análise.
� Sistema de Introdução de Amostra. A a introdução da amostra é
feita no injetor (ou vaporizador). Na versão mais simples, trata-se 
de um bloco de metal conectado à coluna cromatográfica e à
alimentação de gás de arraste. Este bloco contém um orifício com 
um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras
líquidas ou gasosas podem ser injetadas com microseringas 
hipodérmicas. Amostras sólidas podem ser dissolvidas em um 
solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a uma 
temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da 
amostra, para que a amostra se volatilize completa e 
instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a 
temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposição 
da amostra. 
� A quantidade de amostra injetada depende da coluna e 
do detector empregado. Para colunas empacotadas, 
volumes de 0,1 µl a 3,0 µl de amostra líquida são típicos. 
Volumes altos prejudicam a qualidade de injeção 
(alargamento dos picos) ou saturam a coluna 
cromatográfica. Para a cromatografia gasosa de alta 
resolução (CGAR), os volumes de injeção deveriam ser 
da ordem de nanolitros. 
� Coluna Cromatográfica e Controle de Temperatura 
da Coluna. A amostra deve entrar na coluna na forma 
de um segmento estreito, para evitar alargamento dos 
picos. Após injetada e vaporizada, a amostra é
introduzida na coluna cromatográfica, onde é efetuada a 
separação. Na CG a "afinidade" de um soluto pela FM é
determinada pela volatilidade do soluto, sua pressão de 
vapor, que é função da estrutura do composto e da 
temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se 
também a pressão de vapor e, por conseguinte, a 
"afinidade" de uma substância pela FM. O controle da 
temperatura deve ser rigoroso.
� Detector - Um dispositivo que indica e quantifica os 
componentes separados pela coluna. Um grande número de 
detectores têm sido descritos e usados em CG. Existem, 
entretanto, algumas características básicas comuns para 
descrever seu desempenho:
1. Seletividade. Alguns detectores apresentam resposta para 
qualquer substância diferente do gás de arraste que passe por 
ele. Estes são os chamados detectores universais. Por outro 
lado, existem detectores que respondem somente a 
compostos que contenham um determinado elemento químico 
em sua estrutura, que são os detectores específicos. Alguns 
detectores respondem a certasclasses de compostos 
(detectores seletivos). 
2. Ruído. São os desvios e oscilações na linha de base (sinal do 
detector quando só passa o gás de arraste). Pode ser causado 
por problemas eletrônicos, impurezas e sujeiras nos gases e 
no detector, etc. 
3. Tipo de Resposta. Alguns detectores apresentam um sinal 
que é proporcional à concentração do soluto no gás de 
arraste; em outros, o sinal é proporcional à taxa de entrada de 
massa do soluto no detector. 
4. Quantidade Mínima Detectável (QMD). É a quantidade 
de amostra mínima para gerar um sinal duas vezes mais 
intenso que o ruído. É uma característica intrínseca do 
detector. Quanto menor a QMD, mais sensível o detector.
5. Fator de Resposta. É a intensidade de sinal gerado por 
uma determinada massa de soluto, que depende do 
detector e do composto estudado. Pode ser visualizado 
como a inclinação da reta que correlaciona o sinal com a 
massa de um soluto (curva de calibração). Quanto maior 
o fator de resposta, mais confiável a análise quantitativa.
6. Faixa Linear Dinâmica. É a razão entre a menor e a 
maior massa entre as quais o fator de resposta de um 
detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva 
de calibração é linear. Os dois detectores mais 
significativos em CG são o Detector por Condutividade 
Térmica (DCT) e o Detector por Ionização em Chama 
(DIC). 
Detector por Condutividade TDetector por Condutividade Téérmica (DCT)rmica (DCT)
� O funcionamento do DCT é baseado no fato de que a velocidade de 
perda de calor de um corpo quente para um corpo mais frio é
proporcional, dentre outros fatores, à condutividade térmica do gás 
que separa estes corpos. Um filamento metálico muito fino (de W, Au 
ou liga W-Re) é aquecido pela passagem de uma corrente elétrica 
constante. Este filamento fica montado dentro de um orifício em um 
bloco metálico (cela), aquecido à uma temperatura mais baixa que 
aquela do filamento, por onde o gás de arraste proveniente da coluna 
passa continuamente. 
�Quando um componente é eluido da coluna, ele sai 
misturado com o gás de arraste e passa pelo 
detector. Se a condutividade desta mistura for 
diferente daquela do gás de arraste puro, o 
filamento passa a perder calor para o bloco numa 
taxa diferente daquela do equilíbrio. O aquecimento 
do filamento quando a amostra é eluida causa uma 
variação na sua resistência elétrica e a resistividade 
de um metal aumenta com a temperatura. O 
filamento é montado em um circuito de ponte de 
Wheatstone, que converte a variação na resistência 
elétrica do filamento numa variação de voltagem, 
que é coletada em um registrador gerando o 
cromatograma. 
1. Bloco metálico; 2. Entrada de 
gás; 3. Saída de gás; 4. Filamento 
metálico; 5. Alimentação de 
corrente
� O DCT é um detector universal, sensível à concentração do 
soluto no gás de arraste. Geralmente, quando se usa DCT, 
o gás de arraste é He ou H2. Pelo fato destes gases terem 
condutividades térmicas altíssimas, as misturas gás de 
arraste mais o soluto sempre terão condutividades térmicas 
menores que a do gás de arraste puro, o que impede sinais 
negativos, além de se obter maiores fatores de resposta. 
� Entretanto, o DIC é considerado um detector pouco 
sensível. A QMD de um modelo moderno, para propano, é
de 400 pg/ml de gás de arraste, com faixa linear de 106. 
Apesar disso, o fato de ser universal, barato e de operação 
simples, o faz extremamente útil para análises que não 
necessitem de alta sensibilidade. 
� Durante a queima de um composto 
orgânico, são formados diversos íons e 
como conseqüência, a chama resultante 
torna-se condutora de eletricidade. O 
funcionamento do DIC baseia-se neste 
fenômeno. 
� O gás de arraste saindo da coluna 
cromatográfica é misturado com H2 e queimado com ar ou O2. A chama 
resultante fica contida entre dois 
eletrodos, polarizados por uma voltagem 
constante. Como a chama de H2 forma poucos íons, ela é um mau condutor 
elétrico e quase nenhuma corrente passa 
entre os eletrodos. Ao eluir um composto 
orgânico, ele é queimado e são formados 
íons na chama, que passa a conduzir 
corrente elétrica. A corrente elétrica 
resultante, da ordem de pA, é amplificada 
e constitui o sinal cromatográfico.
Cela de um detector por 
ionização de chama
Detector por IonizaDetector por Ionizaçção em Chama (DIC).ão em Chama (DIC).
� Quase todos compostos orgânicos podem 
ser detectados pelo DIC. 
� Apenas substâncias não inflamáveis (CCl4, H2O) ou algumas poucas que não formam íons na chama (HCOOH) não dão sinal. 
Assim, ele é um detector praticamente 
universal. De um modo geral, quanto 
ligações C-H tiver o composto, maior a sua 
resposta (maior sensibilidade). Ele é muito 
mais sensível que o DCT, pois dependendo 
do composto, podem ser detectados entre 
10 pg e 400 pg, com faixa linear dinâmica 
de 107. Provavelmente é o detector mais 
usado em CG. 
Parâmetros fundamentais de um sistema de CGParâmetros fundamentais de um sistema de CG
� Retenção - O tempo de retenção (tr) é definido como o tempo 
transcorrido entre a injeção da amostra e o máximo do pico 
cromatográfico. Porém, mesmo que a substância não interagisse 
de forma alguma com a FE, o seu tempo de retenção não seria 
nulo, pois transcorreria algum tempo entre a sua injeção e a sua 
passagem pelo detector. O parâmetro que realmente reflete as 
características físico-químicas de retenção tempo de retenção 
ajustado (t’r), que é determinado composto é o tempo de 
retenção descontado do tempo morto, tm, (tempo que o gás de 
arraste demora para percorrer a coluna).
� Seletividade - Capacidade de um sistema diferenciar dois 
compostos, é definida por α, sendo uma característica 
que, na CG, é mais associada à coluna cromatográfica.
� Eficiência - A eficiência é expressa pelo número de pratos 
teóricos (n), que é calculada usando-se um parâmetro de 
retenção (o tr) e a largura do pico cromatográfico - no caso, a 
largura de base, wb. A altura equivalente a um prato teórico (h) é
dada pela razão entre o comprimento da coluna cromatográfica 
(L) e n.
� Resolução - A resolução entre duas substância é a razão entre 
a diferença das distâncias de migração e a média das larguras 
das bandas. 
Se as larguras dos picos forem próximas, pode-se utilizar a 
simplificação 
Na CG existe um grande nNa CG existe um grande núúmero de fases estacionmero de fases estacionáárias rias 
llííquidas e squidas e sóólidas disponlidas disponííveis comercialmente, de modo veis comercialmente, de modo 
que a natureza da FE que a natureza da FE éé a varia variáável mais importante na vel mais importante na 
otimizaotimizaçção da seletividade.ão da seletividade.
� As FE líquidas são as mais empregadas em CG. FE sólidas (carvão 
ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são 
aplicadas para separação de gases e compostos de baixo massa 
molar. Em princípio, para um líquido ser usado como FE em CG ele 
deve ser pouco volátil (pressão de vapor até 0,1 mmHg ou 13,332 
Pa na temperatura de trabalho) e termicamente estável. Para esta 
fase ser empregada em uma separação em particular, ela precisa: 
1. ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso 
contrário o efeito será o mesmo de temperaturas de coluna 
excessivamente altas (os compostos ficarão quase que o tempo todo 
no gás de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem 
separação); 
2. ser um bom solvente diferencial, isto é, além de dissolver bem todos 
os constituintes da amostra, fazê-lo com solubilidades 
suficientemente diferentes para que eles possam ser separados; e
3. ser quimicamente inerte em relação à amostra. 
� As FE mais populares são os silicones. Silicones são polímeros 
extremamente estáveis e inertes, o que os torna especialmente 
adequados à CG. Nesta classe, as polidimetilsiloxanas são os 
menos polares. A substituição dos grupos metila na cadeia por 
outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil, etc.) fornece FE com 
polaridades crescentes. Comercialmente, são disponíveis sobdiversas denominações, muitas delas praticamente equivalentes. 
SE-30, OV-1 e DC-200 são nomes comerciais para 
polidimetilsiloxano de fabricantes diferentes. 
� Outra classe de FE importante é a dos poliglicóis. São polímeros de 
etilenoglicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos de 
cadeia polimérica. São FE moderadamente polares, adequadas para 
separação de álcoois, aldeídos, éteres, etc. A denominação 
comercial "Carbowax" designa a série de poliglicóis mais conhecida 
(p.ex., Carbowax 20M é polietilenoglicol com massa molar média de 
20.000.000 g/mol). 
� Um terceiro grupo importante de FE é o dos poliésteres. São obtidos 
por condensação de diácidos com glicóis. São fases altamente 
polares. As fases mais comuns desta categoria são o succinato de
dietilenoglicol (DEGS) e o adipato de dietilenoglicol (DEGA). 
� A coluna cromatográfica é o local onde ocorre a interação entre a 
amostra e a FE. Existem duas geometrias básicas de colunas para 
CG: as colunas empacotadas (ou recheadas), e as colunas tubulares 
abertas (ou capilares). 
� Nas colunas empacotadas, a FE líquida é depositada sob a forma de 
um filme fino e uniforme sobre partículas de um suporte adequado. O 
suporte deve ser um sólido poroso com grande área superficial, 
inerte e de boa resistência mecânica. O tamanho das partículas e 
dos poros deve ser o mais uniforme possível. O material mais 
empregado como suporte é a diatomite, esqueletos fósseis de algas 
microscópicas (diatomáceas), compostos principalmente de SiO2
amorfa e traços de óxidos metálicos. A diatomite preparada para 
suporte de CG é comercializada com o nome de "Chromosorb", 
dentre outros. 
� Para preparar uma coluna empacotada, o material de enchimento 
(FE sobre suporte) é colocado da forma mais uniforme e compacta 
possível ("empacotado") em um tubo de comprimento e diâmetro 
adequados. Os materiais mais usados para os tubos de colunas são
o aço inox e o vidro, sendo o primeiro preferido pelo manuseio mais 
fácil. Se o material de enchimento não for colocado na coluna de 
forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes 
funcionarão como câmaras de diluição para a amostra. O resultado 
serão picos mais largos e menor eficiência. 
� O tamanho da coluna é variável. Tipicamente são usadas colunas 
com diâmetros internos de 1 mm a 4 mm e 1 m a 3 m de 
comprimento. Quanto maior a coluna, maior a eficiência; entretanto, 
também aumenta o tempo de análise. Colunas muito longas 
oferecem uma resistência muito alta à passagem de gás, exigindo 
pressões excessivamente altas. Além da natureza da FE e da 
qualidade do empacotamento, existem duas variáveis importantes 
que influem no desempenho de uma coluna empacotada:
A percentagem de FE no material de enchimento. A 
percentagem de FE sobre o suporte é um parâmetro que deve ser 
rigidamente controlado. Se a quantidade de FE for muito baixa, 
partes da superfície do suporte ficarão expostas à amostra, que 
poderá ser adsorvida. O resultado é o alargamento ou deformação 
dos picos. Quanto mais FE, maior a retenção. A seletividade 
também aumenta, porém às custas de aumento do tempo de análise 
e diminuição da eficiência. 
O diâmetro das partículas do suporte. Quanto menor o diâmetro 
das partículas do suporte, maior a eficiência da coluna. A 
uniformidade das partículas também é importante. Recheios com 
partículas cuja distribuição de tamanho seja muito grande serão 
pouco eficientes. Se for usado suporte com partículas 
excessivamente finas, a resistência à passagem de gás será muito 
alta. 
� A capacidade de processamento de amostra das colunas 
capilares é menor que aquela das empacotadas. Dependendo 
da coluna, ela pode ser saturada com quantidades tão 
pequenas quanto 0,001 µl de amostra. Como a injeção direta de 
volumes de amostra desta ordem de grandeza é inviável, deve-
se recorrer ao artifício da divisão de amostra na injeção. Um 
inconveniente dessa metodologia é ajustar reprodutivelmente a 
razão de divisão (fração da amostra injetada que entra na 
coluna) o que pode acarretar erros na análise quantitativa. Além 
disso, amostras contendo constituintes com volatilidades muito 
diferentes podem ser alteradas pela divisão: a fração da amostra 
que realmente vai para a coluna fica enriquecida com os 
componentes menos voláteis. 
� Dada a grande eficiência das colunas capilares, podem ser 
realizadas separações de misturas extremamente complexas: 
frações de petróleo, essências, amostras biológicas, etc. No 
caso específico de análises de interesse ambiental (poluentes 
em águas e ar, por exemplo), é quase que obrigatório o seu uso. 
A tendência atual é que a maioria das análises seja feita com o 
uso de colunas capilares. Isto não significa que as colunas 
empacotadas estão sendo abandonadas, porém o seu uso deve 
ficar restrito à aplicações específicas. 
Cromatografia LCromatografia Lííquida de Alta Eficiência quida de Alta Eficiência 
(CLAE)(CLAE)
� Em contraste à CG, o principal 
mecanismo de separação da 
cromatografia gasosa está
baseado na partição dos 
componentes de uma amostra 
entre a fase móvel líquida e a fase 
estacionária sólida. 
� A versatilidade desta técnica 
reside no grande número de fases 
estacionárias existentes, as quais 
possibilitam análises e 
separações de uma ampla gama 
de compostos com alta eficiência.
Modelo esquemModelo esquemáático de um equipamento btico de um equipamento báásico sico 
de CLAEde CLAE
a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta
pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; 
e) detector e f) registrador.
Exemplo de cromatogramaExemplo de cromatograma
Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de padrões de 
aminoácidos. Fonte: Lehninger, 1990. 
Funcionamento do cromatFuncionamento do cromatóógrafo lgrafo lííquidoquido
� As fase móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de 
pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo 
filtradas e degaseificadas antes de uso.
� A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos 
com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a 
um fluxo adequado. A necessidade de uma bomba de alta pressão 
para eluição da fase móvel na cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE) tendo sido no princípio denominada de cromatografia líquida 
de alta pressão.
� As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem 
para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, 
uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a 
coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas 
geralmente alças na faixa de 5-50 mL para injeções analíticas e 0,5-
2 mL para preparativas.
� O comprimento das colunas é variável, 
sendo comuns colunas analíticas de 10-
25 cm e preparativas em torno de 25-30 
cm. Essas colunas são reaproveitáveis, 
sendo empacotadas com suportes de 
alta resolução, não sendo necessária 
sua regeneração após cada separação.
� As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de 
aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 
0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 
cm para preparativas. 
� O detector mais utilizado para separações por CLAE é o 
detector de ultravioleta, sendo também empregados 
detectores de fluorescência, de indíce de refração, e 
eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para 
CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos 
quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à
luz plano-polarizada.
Registro de Dados na Cromatografia Registro de Dados na Cromatografia 
LLííquidaquida
� O registro de dados pode 
ser feito através de um 
registrador, um integrador 
ou um microcomputador.
� Tanto na cromatografia 
gasosa (CG) quanto na 
cromatografia líquida 
(comumente de alta 
eficiência, CLAE) e a 
banda é registrada como 
um pico, que idealmente 
deve ter formato 
gaussiano.
Cromatograma mostrando a
separação dos enantiômeros do tetramisol,
princípio ativo de vários medicamentosusados para ascaridíase.
Mecanismos das separaMecanismos das separaçções em CLAEões em CLAE
� As separações em CLAE podem se dar por adsorção, 
partição ou ambos. O suporte mais comumente utilizado é a 
sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um 
suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase 
estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais 
foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, 
possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas 
com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases 
assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.
� As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação 
feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou 
ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária 
é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase 
móvel é mais polar.
� Separações analíticas são predominantemente realizadas 
em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilsílica) a 
mais usada, ao passo que são preferidas fases que 
atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de 
que separações no modo reverso utilizam fases móveis 
aquosas.
� Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque 
deve ser dado às fases estacionárias quirais, as quais 
possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para 
tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como 
parte integrante da fase estacionária.
� Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no 
acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, 
feromônios, no isolamento de produtos naturais e 
sintéticos e na produção e controle de qualidade de 
medicamentos, dentre tantas outras aplicações.
UtilizaUtilizaçção da HPLC acoplado a tão da HPLC acoplado a téécnicas cnicas 
espectroscespectroscóópicas na elucidapicas na elucidaçção estrutural ão estrutural 
de produtos naturaisde produtos naturais
CromatCromatóógrafos acoplados grafos acoplados àà Espectrofotômetros Espectrofotômetros 
de Massa: GCde Massa: GC--MS e HPLCMS e HPLC--MSMS
ESI and APCI HPLC/MS
HPLC - Diagrama esquemático 
Exemplos desenvolvidos no IQExemplos desenvolvidos no IQ
Espectro de massa (CG/MS)Espectro de massa (CG/MS)
OCH3
I
I
C15H31
MM = 570
AnAnáálise quantitativa por cromatografialise quantitativa por cromatografia
� A análise quantitativa em 
cromatografia é baseada em 
estabelecer o valor da área da 
banda cromatográfica. Na 
cromatografia em coluna, isto 
é, gasosa (CG) e em 
cromatografia líquida 
(comumente de alta eficiência, 
CLAE) a banda é registrada 
como um pico que, idealmente 
deve ter formato gaussiano. 
Em cromatografia gasosa de 
alta resolução, onde são 
usadas colunas capilares, não 
é incomum que os picos 
tenham perfil gaussiano. 
� Similarmente ao que 
ocorre na cromatografia 
em camada delgada 
(CCD), onde as 
manchas observadas 
tendem ao perfil 
gaussiano, isto é, 
aumentam das bordas 
para o centro da 
mancha e, 
simetricamente, 
diminuem do centro 
para a outra borda. Isto 
é mostrado na ao lado, 
em que as quantidades 
de analito numa 
mancha foram obtidas 
para secções verticais. 
� Nas correspondentes bandas 
cromatográficas as 
quantidades dos analitos 
tendem ao perfil gaussiano, isto 
é, aumentam das bordas para 
o centro da mancha e, 
simetricamente, diminuem do 
centro para a outra borda. 
� Quando a banda 
cromatográfica é registrada na 
forma de pico, a sua área pode 
ser calculada, como mostrado 
abaixo, como a área do 
triângulo isósceles que 
“engloba” o pico 
cromatográfico.
� Na cromatografia em camada 
delgada a área da mancha é
estabelecida pelo princípio de 
densitometria. A 
densitometria faz a contagem 
do número de pontos de uma 
imagem.
� O procedimento e princípio de 
obter áreas em CCD a partir 
de imagens digitalizadas e 
arquivadas em computador . 
O número de pontos que 
define a mancha (como “vista”
por um densitômetro ou 
computador) é proporcional á
área da mancha. 
O princípio da densitometria
� As placas – no caso com 
manchas visíveis de corantes –
são digitalizadas e com o arquivo 
gerado realiza-se a contagem dos 
pontos (pixeis é o termo usado na 
área de computação) que 
compõem cada mancha. A 
contagem pode ser feita 
manualmente – com muita 
paciência – ou por meio de um 
programa que conte os pixeis. 
� O número de pontos é
proporcional à área da 
correspondente mancha e, 
conseqüentemente, proporcional 
à quantidade de analito nela 
existente. Esta metodologia 
representa o princípio de 
estabelecimento de áreas 
cromatográficas.
Princípio do estabelecimento de área de 
uma mancha de CCD por meio de 
escaneamento da placa cromatográfica. 
� Apesar do método de determinar áreas ser diferente para CG 
e CLAE, o princípio é o mesmo do usado em CCD. O princípio 
básico da quantificação é que a área dos picos registradas no 
cromatograma é proporcional à massa do composto injetada. 
Assim, é fundamental para a confiabilidade da análise que a 
área dos picos seja medida o mais exata e reprodutível 
possível. Existem vários modos de se medir a área de um 
pico cromatográfico:
1. Técnicas Manuais. Quando o cromatograma é coletado por 
um registrador analógico, usualmente a área dos picos 
(~triângulo isósceles) é medida manualmente. O 
procedimento mais empregado consiste em medir a altura do 
pico (h) e a sua largura de base (wb) ou à meia-altura (wh), e 
calcula-se a área pelas fórmulas usadas para cálculo de área 
de triângulo:
ou 
2. Integradores Eletrônicos. Integradores são dispositivos 
baseados em microprocessadores que coletam o sinal 
cromatográfico, digitalizam-no (transformam o sinal elétrico 
em números), detectam a presença de picos e calculam a 
sua área. Integradores são muito mais precisos e rápidos 
que qualquer método manual de medida, desde que 
empregados convenientemente. Embora sejam dispositivos 
caros, quando é necessária rapidez na produção de 
resultados, o seu uso é quase mandatório. 
3. Computadores. O integrador pode ser substituído por um 
computador, desde que este tenha um dispositivo para 
converter o sinal elétrico em números que possam ser 
guardados em memória (conversor analógico-digital), e se 
disponha de programas adequados para fazer a análise do 
cromatograma digitalizado. O custo de um computador com 
os acessórios necessários para coletar e analisar 
cromatogramas é, via de regra, inferior ao de um bom 
integrador. Além disso, com um software e operação 
adequada, pode fornecer resultados mais confiáveis que 
este último. 
� Qualquer que seja o modo usado para medir a área dos 
picos, o procedimento geral de uma análise quantitativa 
por CG envolve a obtenção do cromatograma da amostra, 
a medida da área dos picos de interesse e o cálculo da 
massa correspondente a cada um dos picos. Este cálculo 
deve ser feito empregando uma curva de calibração: um 
gráfico correlacionando a área do pico com a massa do 
composto. 
� A curva de calibração é obtida cromatografando-se 
padrões contendo massas conhecidas dos compostos a 
serem quantificados. Para cada substância, deve ser feita 
uma curva de calibração própria, já que cada composto 
responde de maneira diferente ao detector. 
� O esquema geral proposto acima é chamado de 
padronização externa. Como é muito difícil conseguir boa 
reprodutibilidade entre injeções diferentes, ele é muitas 
vezes sujeito à grande imprecisão e inexatidão. Para 
contornar este problema, pode-se usar a chamada 
padronização interna, onde a cada solução a ser injetada 
adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um 
composto que seja separável dos componentes da 
amostra, e que não exista nela (padrão interno). 
O uso das O uso das ááreas cromatogrreas cromatográáficas ficas ––
A curva analA curva analííticatica
� É medindo-se as áreas 
cromatográficas que se estabelecem 
as quantidades de analitos em 
amostras analisadas e a melhor forma 
de realizar quantificações é a baseada 
numa Curva Analítica. A Curva 
Analítica é a relação entre sinais – nocaso as áreas – e quantidades do 
analito a ser quantificado. 
� Dispondo da equação da curva 
analítica pode-se calcular as 
quantidades do analito em amostras. 
As amostras a serem analisadas são 
preparadas da mesma maneira que as 
soluções-padrão, a corrida é realizada 
sob as mesmas condições usadas 
para o conjunto de padrões e as áreas 
do analito nas amostras são 
determinadas.
Esboço de uma Curva Analítica linear 
(representada pela equação de uma reta). 
ObtendoObtendo--se uma curva analse uma curva analííticatica
� O primeiro passo para obter a curva 
analítica é preparar um conjunto de 
soluções com um padrão do analito que se 
deseja quantificar em amostras. Portanto, é
necessário conhecer a identidade do 
analito e dispor dele na forma de padrão 
(puro ou, se isso não for possível, com 
pureza exatamente conhecida e 
determinada independentemente).
� Dispondo dos dados aplica-se a eles uma 
Regressão Linear para obter a equação da 
curva analítica, isto é, a relação funcional 
entre Sinais e Quantidades. Para o caso 
dos dados da Tabela, a equação de reta 
que relaciona as áreas com as 
concentrações do analito é:
Concentrações preparadas e 
áreas obtidas para as 
correspondentes sinais 
cromatográficos
� Suponhamos que para uma amostra 
esta área foi estabelecida como de 
184 pixeis. Este valor é substituído 
na equação da curva analítica e 
obtém-se a quantidade do analito na 
amostra (no caso a sua 
concentração). 
� Note-se que a curva analítica é
definida como a relação entre sinais 
e quantidades; no entanto, na 
equação as quantidades são 
representadas pelas concentrações 
das soluções. Isto implica que os 
volumes de amostra aplicados na 
placa cromatográfica foram iguais, 
pois, C = Q / V (C= concentração; Q 
= quantidade; V =volume).
� Numa curva analítica interpolam-se 
resultados. As extrapolações não 
refletem resultados efetivamente 
quantitativos.
Gráfico da curva analítica obtida para os 
dados da tabelado. 
Exemplos desenvolvidos no IQExemplos desenvolvidos no IQ
SeparaSeparaçção de mistura de oão de mistura de o-- e pe p--nitrofenol por CGnitrofenol por CG
� A separação do o- e p-nitrofenol por CG constitui-se um bom 
exemplo do efeito das interações intramoleculares sobre as 
propriedades físicas dos compostos. No isômero orto, os 
grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio 
de ligações hidrogênio, transformando-se no componente 
menos polar. 
OH
HNO3-H2O
OH
NO2
OH
NO2
+
SeparaSeparaçção de mistura de oão de mistura de o-- e pe p--nitrofenol por CGnitrofenol por CG
Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2. (a) 
CH2Cl2 puro. (b) o-Nitrofenol padrão dissolvido em 
CH2Cl2.
SeparaSeparaçção de mistura de oão de mistura de o-- e pe p--nitrofenol por CGnitrofenol por CG
Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2: (a) p-
Nitrofenol padrão dissolvido em CH2Cl2. (b) Mistura de o-e 
p-nitrofenol dissolvido em CH2Cl2 obtida por meio da 
reação de nitração (HNO3-H2SO4).
Exemplos desenvolvidos no IQ Exemplos desenvolvidos no IQ 
Acompanhamento de reaAcompanhamento de reaçção por anão por anáálise lise 
cromatogrcromatográáfica no CGfica no CG
H2SO4
AcOH, H2O2
HO
OH
O
HO
O
OH
+
O
O
OAntibiótico 
macrolídeo
IBX,
AcOEt,
80oC
O
I
O OH
OÁc. iodóxibenzóico
IBX
Acompanhamento de reaAcompanhamento de reaçção por anão por anáálise lise 
cromatogrcromatográáfica no CGfica no CG
HO
OH
O
HO
O
OH
+
Acompanhamento de reaAcompanhamento de reaçção por anão por anáálise lise 
cromatogrcromatográáfica no CGfica no CG
HO
OH
O
O
O
O
IBX,
AcOEt,
80oC
ExercExercíício de CLAE cio de CLAE -- ProvãoProvão
� A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos 
cromatográficos mais modernos utilizados em análise (CLAE 
analítica) e separação/purificação de misturas (CLAE preparativa). 
No próximo slide são dados os cromatogramas X, Y e Z de uma 
mistura de compostos presentes em analgésicos: aspirina (A), 
cafeína (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando três fases 
móveis diferentes, no modo isocrático, em uma mesma coluna. 
Avaliando esses cromatogramas, responda às perguntas abaixo.
(a) Qual a fase móvel mais apropriada para ser utilizada em 
escala preparativa, e a fase móvel mais adequada para utilização 
em escala analítica, considerando um grande número de amostras 
a serem analisadas? Justifique sua resposta.
(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o 
composto de maior tempo de retenção? Justifique sua resposta.
(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada 
nestes três experimentos? Justifique sua resposta. 
ReferênciasReferências
� COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a 
métodos cromatográficos.5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 
1993.
� DEGANI, A. L. G.; QUEZIA , B. C.; VIEIRA, P. C. Cromatografia 
– Um breve ensaio. Química Nova Na Escola. 1998, No. 7, 21.
� Pereira, A. S.; Radler, F. A. N. Estado da arte da cromatografia 
gasosa de alta resolução e alta temperatura. Química Nova, 
2000, 23, 
� ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, 
S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDÃO, A.M. Determinação de 
cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta 
eficiência (CLAE). Química Nova, 1995, 18, 379.
� Antônio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e 
Cássio Ricardo Fares Riedo - ANÁLISE QUANTITATIVA POR 
CROMATOGRAFIA Universidade Estadual de Campinas, 
Chemkeys.com.
� http://www.chromatotron.com/chromatotron/specs.html