Atividade Fitoquimica

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
	
	COMPONENTE CURRICULAR: Fitoquímica
	
	PROFESSOR: Harley da Silva Alves
	
	ALUNO: 
Exercício de avaliação
1. Em um estudo de uma amostra vegetal foi utilizado cromatografia em camada delgada com eluição em gradiente para tentar identificar a presença de uma determinada substância na amostra A, sendo que na amostra P é utilizado um composto conhecido puro. Cite exemplos de fase móvel que podem ter sido utilizados na ordem de eluição. Observando a imagem abaixo, o que você tem a dizer comparando A com P? Numere as substâncias como quiser e explique quem tem menor Rf e qual a mais lipofílica.
Pode ter sido usado, Fase móvel: 1,2 Dicloroetano e ácido acético. Na imagem 1.1 (a) Tem-se a aplicação em uma placa de cromatografia de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) apresentando um padrão em A e P; A figura 1.2 (b) é possivel notar os eventos que ocorreram, é possível observar que a mistura entra em eluição ascendente e se separam, cisso ocorre após o contato com a fase móvel representada pela cor azul e também com a fase estacionária. Existe diferenças de velocidade de eluição.Tendo uma eluição lenta, outra rápida, já o terceiro observa-se um tempo médio de velocidade. O padrão relaciona-se a substância pura relacionada apenas a uma mancha, vendo que os compostos são coloridos é possível notar que a imagem 1.3 (c) tem-se o resultado da cromatografua, assim tem-se a composição da amostra por no mínimo 3 substâncias, pode-se afirmar que uma delas é a mesma substância padrão, é possível essa conclusão, uma vez que a mancha da segunda amostra tem altura equiparada de eluição que amancha da substância padrão.
	Utilizando o fator de retenção (Rf) é possível ter todos os resultados do cromatograma, o Rf à altura de aluição da mancha até o ponto de aplicação (m) dividido pela altura entre a linha de chegada e o ponto de aplicação na cromatoplaca (at). É utilizado o centro de cada mancha como refer~encua para medir valores de altura.
	A figura abaixo identifica as alturas utilizadas para calcular o Rf da mancha padrão. 
Cálculos de fator de retenção de todas as manchas do cromatograma: 
Rf(A3) = 2,6/3,2 = 0,81; Rf(A2) = 1,6/3,2 = 0,50; Rf(A1) = 1,2/3,2 = 0,37; 
Rf(P) = 1,6/3,2 = 0,50
Ordem: A1>A2>A3
Devido a similaridade da amostra A2 e P, é possívelque corresponda a mesma substância. 
Caso as substâncias fossem incolores, seria necessário utilizar algum revelador químico (reagentes) ou físico para tornar as manchas visíveis e, assim, obter o cromatograma desejado. Há reveladores universais como a aplicação da solução aquosa de ácido sulfúrico, seguida de aquecimento, e reveladores específicos como a radiação UV (254 ou 365 nm) (compostos aromáticos) ou ao iodo sublimado (compostos insaturados).
2. Liste duas fases estacionárias comuns usadas em cromatografia em coluna. Qual(is) fase(s) móvel(is) pode(m) ser usada(s)?
Fases estacionárias: sílica e alumina. 
Fases móveis: Compostos orgânicos como: éter de petróleo, clorofórmio, etanol e hexano.
3. Qual o principal pré-requisito de uma amostra para uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência?
A amostra utilizada tem que ser solúvel na fase móvel. 
4. Explique o que é cromatografia de fase de fase normal e de fase reversa. Qual a diferença na eluição dos componentes?
Cromatografia de fase normal: fase estacionária mais polar que a fase móvel.
Cromatografia de fase reversa: fase estacionária menos polar que a fase móvel.
	
5. Quais as principais características da fase móvel em CLAE?
As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso, devem dissolver a amostra sem interação química entre ambas, e apresentar polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra. 
6. Explique a diferença de eluição isocrática e por gradiente de solvente em uma análise de CLAE.
Na eluição isocrática  a composição da fase móvel ocorre com uma eluição de um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante. Já na eluição por gradiente de solvente a composição da fase móvel é variada durante a eluição, a fase móvel é formada por dois ou mais solventes onde a razão entre estes é variada durante o processo de eluição. 
7. Na imagem abaixo existe uma representação de um cromatógrafo líquido de alta eficiência. Fale sobre os componentes e os principais cuidados que o analista deve ter para preservar a vida útil deste equipamento.
Reservatório de solvente ou fase móvel:  Recipiente contendo fase móvel que será bombeada dentro do sistema analítico. As características ideais da fase móvel possuir alto grau de pureza ou fácil purificação, não podendo conter partículas para evitar danos a bomba, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel no reservatório, onde a escolha do filtro é em função da natureza na fase móvel, usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m). A fase móvel deve dissolver a amostra sem decompor os seus componentes, não decompor ou dissolver a fase estacionária, possuir baixa viscosidade e deve ser desgaseificada para evitar a formação de bolhas no processo de separação o que pode interferir no desempenho da análise. Além disso, deve ser compatível com o detector utilizado, ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. 
Bomba: Sistema de bombeamento para que a fase móvel consiga migrar com vazão constante para a fase estacionária. A pressão máxima de operação na faixa de 600 bar, a vazão pode ser contínua sem pulsos ou se pulsando, com amortecedor de pulsos, o intervalo de vazões entre 0,01 e 10 mL/min para aplicações e não deve ser corroído pelas fases móveis empregadas. Logo, são construídas com material nobre: sede de safira, esfera de rubi. Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. É necessária alta pressão para impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase estacionária. 
Injetor: Realiza a injeção da amostra no sistema com  precisão e exatidão adequada. A injeção da amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20l. A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção
Coluna cromatográfica: O equipamento usa colunas de aço de material polimérico,com um comprimento de 5 a 30 cm e um diâmetro interno de 1 a 5 mm. Essas colunas têm custo elevado e se degradam com facilidade pela ação de poeira ou de partículas sólidas presentes na amostra e no solvente e pela adsorção irreversível de impurezas, também provenientes da amostra ou do solvente.  A entrada da coluna principal é protegida por uma pequena pré coluna contendo a mesma fase estacionária presente na coluna principal.  O dispositivo de alocação da coluna é termostatizado. 
Detector: O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico, gerando um cromatograma, cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado. Há vários tipos de sistemas de detecção, como ultravioletas, índice de refração, eletroquímico, evaporativo com espalhamento de luz, espectrometria de massa, dentre outros. 
8. Por que a cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas e qual sua principal limitação?
	Porque apresenta alto poder de resolução, sendo possível realizar a análise de muitos componentes de uma única amostra, inclusive a partir de pequenas quantidades de amostra; pode também ser usada como técnica de identificação, em alguns casos. Utilização limitada a separação e análise de misturas cujos constituintessejam substâncias voláteis e estáveis termicamente.
9. Em cromatografia gasosa, explique a função do gás de arraste e quais as características desse gás para uma separação adequada.
O gás de arraste é utilizado para transportar a amostra através da coluna da cromatografia gasosa. Para sepação adequada o gás não deve interagir com a fase estacionária nem com a amostra, deve está adequado ao detector, ter custo acessívrl e estar disponível no mercado, ter pureza.
10. Cite as principais características das amostras utilizáveis em cromatografia gasosa e fale como ocorre a separação cromatográfica em um cromatógrafo a gás.
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS. CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC. O princípio da técnica de cromatografia gasosa: uma solução de amostra é inserida no injetor do equipamento e transportada por um gás através de um tubo de separação chamado de “coluna” (Hélio ou nitrogênio podem ser utilizados para este transporte e são chamados de gases de arraste). Os diversos componentes presentes na amostra são separados dentro da coluna. Para quantificação de uma amostra de concentração desconhecida, um padrão conhecido deverá ser injetado no equipamento. O tempo de retenção do padrão e sua área serão comparados com os da amostra e utilizados para o cálculo da concentração.
11. Em uma análise de uma amostra por cromatografia gasosa foi observado a presença de cinco picos, como podemos observar no cromatograma abaixo:
Explique como o ajuste da temperatura do forno pode melhorar a separação cromatográfica.
A temperatura do forno com variação de 0,1 °C em.  Em análises isotérmicas a temperatura da coluna permanece constante durante a análise , as misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas isotermicamente, se a temperatura determinada da coluna for baixa os componentes mais voláteis são separados e componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo com picos mal definidos, quando a temperatura da coluna é alta os componentes mais voláteis não são separados e os componentes menos voláteis eluem mais rapidamente. O aumento de temperatura aumenta a pressão de vapor e a velocidade de migração das moléculas, e o analito passa a eluir mais rapidamente. Ao se aumentar a temperatura, os picos têm um tempo de retenção menor. Se o forno é configurado a uma temperatura muito alta, pode haver sobreposição dos picos, dificultando a identificação de cada amostra. A programação de temperatura do forno pode ser feita para que varie linearmente, iniciando a baixas temperaturas e aumentar aos poucos, para que os compostos sejam volatilizados gradativamente. 
12 - Durante a caracterização de compostos fenólicos presentes no pó da erva mate, um pesquisador obteve um cromatograma com sete compostos identificados (Tabela 2). O mesmo realizou as análises com Alíquotas (10 μL/amostra), as quais foram injetadas em cromatógrafo líquido (Shimadzu LC- 10), equipado com coluna de fase reversa (Shim- pack C18, 4,6 mm x 250 mm, 5μm), termo-estabilizada a 40°C, detector UV-visível (Shimadzu SPD 10A, λ = 280 nm) e sistema com processador de dados. Como fase móvel, uma solução de água:ácido acético:η-butanol (350:1:10, v/v/v) foi utilizada com fluxo de 0,8 mL/min (VIEIRA et al., 2009). Diante da análise do método utilizado e correlacionando com os dados da tabela 2, indique quais os compostos com maior e menor polaridade (de acordo com o tempo de retenção)? E justifique o uso da coluna de fase reversa para tal 
	Ácido gálico, ácido clorogênico, ácido p-cumárico, ), ácido siríngico, ácido caféico (3,4 dihidroxicinâmico), ácido ferúlico, Ácido 4,5 dicafeoilquínico. Foi utilizada a fase reversa para tal análise, devido se tratar de um método mais rápido, onde se tem o equilíbrio do sistema e que permite a eluição de composto diversos (hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas). O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel e diminui com a introdução de solventes, mas hidrofóbicos.