Método de difusão em disco

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TSA - Método de difusão em disco 
(modificado de Bauer e Kirby - 1966) 
 
Preparo do inóculo bacteriano 
Para obter uma turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Equivalente a 
aproximadamente 1,5x108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. 
1. Com uma alça de platina ou swab, transferir 3 a 4 colônias com a mesma morfologia e 
inoculá-las em 3 a 4 mL de solução fisiológica a 0,9% em um tubo de ensaio; 
2. Agitar vigorosamente os tubos para ter uma suspensão (turvação) uniforme, pois em 
repouso tende a precipitar; 
3. Comparar a olho nu o tubo com a escala de McFarland (comprado comercialmente) com 
o tubo da suspensão bacteriana na solução fisiológica a 0,9%. 
 
Inoculação da placa 
1. Introduzir um swab estéril na suspensão bacteriana ajustada a 0,5 da escala de 
McFarland; 
2. Comprimir o swab contra a parede interna do tubo para retirar o excesso do inóculo; 
3. Semear a superfície do ágar em três direções diferentes; (Não ultrapassar 15 minutos 
desde a preparação do inóculo até a semeadura). 
4. Deixar a placa semeada secar por 5 minutos à temperatura ambiente, para que o 
inóculo seja completamente absorvido pelo ágar antes de aplicar os discos. (Não 
ultrapassar 15 minutos entre a semeadura e a colocação dos discos). 
** O meio de cultura mais utilizado é o Ágar Mueller-Hinton; 
*** Todos os procedimentos devem ser feitos em capela microbiológica ou de fluxo laminar, 
com o auxílio de um bico de Bunsen. 
 
Aplicação dos discos 
Placas de 150 mm: colocar no máximo 12 discos; Placas de 90 mm: colocar 5 discos; 
1. Retirar os discos da geladeira ou do congelador uma a duas horas antes de sua 
utilização. 
2. Após colocar o disco, pressionar levemente com um auxílio da pinça sua superfície; 
3. Distribuir os discos, uniformemente, na placa de Petri; 
4. Uma vez colocado, não remover os discos do lugar, pois a difusão da droga é imediata. 
 
Incubação das Placas 
1. Colocar as placas (invertidas) dentro da estufa, no máximo 15 minutos após a colocação 
dos discos; 
2. A temperatura máxima da estufa deve ser 35 ± 2ºC; 
3. O tempo de incubação deve ser de 16 a 18 horas, salvo exceções. 
 
Leitura das placas 
1. Após o período de incubação, ler as placas; 
2. O diâmetro do halo de inibição é lido em milímetros (mm) com auxílio de uma régua ou 
halômetro sobre o fundo da placa; 
3. Colônias pequenas dentro dos halos devem ser verificadas se são clones resistentes ou 
eventual contaminação, antes de serem liberadas como cepas resistentes a estes 
antimicrobianos; 
4. Considere os halos de inibição a partir do ponto, onde não foi observado o crescimento 
bacteriano a olho nu. 
 
Interpretação dos Resultados 
Os halos de inibição para cada antimicrobiano testado devem ser interpretados como sensível, 
intermediário ou resistente, de acordo com os critérios estabelecidos pelo Clinical and 
Laboratory Standards Institute (CLSI) mais atual.