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ELETROFORESE Renata Helena M. Sindeaux Introdução A eletroforese é uma técnica usada para separar, e algumas vezes, purificar macromoléculas – especialmente proteínas e ácidos nucléicos – que se diferem em tamanho, carga e conformação. É uma das técnicas mais usadas em laboratórios de bioquímica e de biologia molecular. Variedade de uso Verificação de produtos de PCR Comparativo de paternidade Rastros de amostras biológicas em cenas de crimes Procura de mutações Análise de proteínas plasmáticas Análise de expressão protéica (Western Blotting) Princípio da técnica-‐ Diferença de potencial elétrico Separação de fragmentos protéicos ou de ácidos nucléicos sobre uma matriz de gel; Moléculas carregadas são colocadas sob uma campo elétrico migram para pólo positivo (ânodo) ou negativo (cátodo), de acordo com a sua carga; DNA tem carga negativa (grupos fosfato) e migrará para o polo positivo; Proteínas podem ter carga total positiva ou negativa. Velocidade de migração depende: -‐ Tamanho do fragmento; -‐ Conformação da molécula; -‐ Carga total da molécula; -‐ Corrente elétrica aplicada (intensidade da diferença de potencial elétrico) Princípio da técnica-‐ Velocidade de migração das cargas ÂNODO CÁTODO Matrizes para eletroforese GEL DE AGAROSE: -‐ Polissacarídeo extraído de algas marinhas; -‐ Normalmente é usada em concentrações entre 0,5 a 2,0%; -‐ Faixa de separação ampla, porém com baixo poder de resolução; -‐ Fragmentos de DNA de 200 pb a 50000 pb 1 Kb Matrizes para eletroforese GEL DE POLIACRILAMIDA: -‐ Polímero ramificado de acrilamida; -‐ Normalmente utilizada nas concentrações entre 3,5 a 20%. -‐ Mais trabalhoso para preparar do que a agarose; -‐ Faixa pequena de separação, porém com alto poder de resolução (fragmentos com diferença de até um pb); -‐ Bastante usados na separação e caracterização de proteínas; -‐ Neurotóxica Materiais e aplicação das amostras Materiais e aplicação das amostras Corrida da amostra no gel Corante de corrida: para monitorar a corrida; Voltagem: quanto maior a voltagem mais rápida será a migração; Tampão de eletroforese: mantêm o pH e fornecem os íons para permitir a condutividade na cuba de eletroforese. Os mais usa: TBE (Tris-‐ Borato-‐ EDTA) e TAE (Tris-‐Acetato-‐EDTA). Revelação das amostras-‐ Brometo de E;dio (EtBr) É um corante fluorescente, cujas moléculas que se intercalam entre as bases de DNA permitindo a visualização sob luz ultravioleta (590nm); É um sal (não volátil), mutagênico e cancerígeno de ação tópica (contato). Transiluminador SYBR Green® > Molecular Probes 1995 Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100x quando se liga ao DNA. Consegue-‐se ver picogramas de DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: É muito menos mutagênico e pode ser adicionado diretamente àamostra antes da eletroforese. 6b 9 4 14 22 16 23 C1 C5 7b 9 4 14 22 16 23 C1 C5 9b 9 4 14 22 16 23 C1 C5 2652 bp 800 bp 350 bp Eletroforese de proteínas plasmáLcas γ β α2 Albumina α1 : Orosomucoide, α1 Antitripsina : Haptoglobina, α2 Macroglobulina, α Lipoprotéina, Ceruloplasmina : Transferrina, Hemopexina, Complemento C3, β Lipoproteína : Imunoglobulinas Eletroforese de proteínas plasmáLcas Eletroforese de proteínas séricas em gel de agarose, (1) hipergamaglobulinemia em processo inflamatório; (2) e (3): fracionamento normal; (4) gama monoclonal no mieloma múltiplo.
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