RFLP - Polimorfismo no Comprimento de Fragmento de Restrição

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RFLP - Restriction 
Fragment Length 
Polymorphisms 
Renata Sindeaux 
Introdução 
 RFLP (do inglês Restriction Fragment Length 
Polymorphisms)  Polimorfismo no Comprimento 
de Fragmento de Restrição. 
Digestão do DNA por enzimas de restrição. 
 A técnica baseia-se na utilização de enzimas de 
restrição  reconhecem sequências específicas 
de dupla hélice de DNA e clivam ligações 
fosfodiéster na dupla-fita do DNA; 
 Permite a análise de polimorfismos de acordo com 
o tamanho dos fragmentos resultantes da digestão. 
RFLP - História 
 1969 - Descoberta das enzimas de restrição por 
Herbert Boyer; 
 1970 – Smith e Wilcox – Purifica-se a primeira 
enzima de restrição  Hind II; 
 
 
 
 
 
 Primeiro marcador molecular a detectar as 
diferenças entre indivíduos diretamente do DNA. 
 
 
Enzimas de Restrição 
(Endonucleases de Restrição) 
 As endonucleases reconhecem uma sequência 
específica: 
 de bases do DNA (4 a 8 nucleotídeos); 
 sequências palindrômicas – Ambos os filamentos 
têm a mesma seqüência de nucleotídeos mas em 
direções opostas: 
“Socorram-me, subi no ônibus em Marrocos” 
Apresentam reconhecimento de sequências específicas – excelentes 
ferramentas de manipulação do DNA 
Purificadas de bactérias função de proteção 
(degrada DNA invasor - evitando que ele se 
replique e parasite a célula invadida) 
 
Enzimas de Restrição 
 Atualmente  mais de 3500 enzimas; 
 
 A nomenclatura - abreviação do nome do 
microrganismo - enzima foi isolada. 
 
 
 
 
 
Enzimas de Restrição 
 Especificidade  reconhece e cliva 
apenas uma determinada sequência de 
nucleotídeos; 
 
 Reprodutibilidade  moléculas idênticas 
de DNA tratadas com determinada 
endonuclease são clivadas no mesmo 
ponto. 
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/bio37.swf 
 Enzima reconhece seu alvo  cliva a dupla fita gerando 
dois tipos de extremidades dentro da sequência de DNA. 
Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Terminação cega 
Terminação coesiva 
Técnica - RFLP 
Amostra DNA 
Amostra biológica 
Extração do DNA 
PCR 
Amplificação do fragmento de DNA a ser analisado 
Digestão do Produto de PCR pela 
Enzima de Digestão 
•Incubação 
a 37ºC em 
B.M. 
•Overnight. 
+ 
+ 
Tampão 
Digestão do Produto de PCR pela 
Enzima de Digestão 
CUIDADOS: 
 Armazenamento da enzima de restrição a -20ºC. 
 DNAs devem estar livres de contaminantes como 
fenol e etanol para que ocorra a digestão com a 
enzima de restrição. 
 Excesso de sal também interfere na atividade de 
muitas enzimas. 
 Conferir a necessidade de cada enzima e usar 
tampão apropriado. 
Não usar enzimas demais  1 U de enzima cliva 
1ug de DNA 
Gel de Agarose 
 DNA é inserido nos 
poços; 
 
 Primeiro poço  
ladder (marcador) – 
vários fragmentos 
DNA com tamanhos 
conhecidos 
Análise da Digestão por Eletroforese em 
Gel de Agarose 
Aplica-se corrente elétrica 
 
A separação dos 
fragmentos gerados pela 
digestão das enzimas é 
detectada por eletroforese 
em gel de agarose. 
Movimentação dos 
fragmentos 
-Os fragmentos migram em 
função de seus pesos 
moleculares sendo que os 
menores migram mais 
rapidamente. 
 
- O corante de corrida mostra 
quanto o DNA já migrou. 
Fotodocumentador 
 Cora-se o gel com 
Brometo de Etídio. 
 
 Os fragmentos são 
visualizados sob luz 
UV. 
Revista CIÊNCIA HOJE – vol:29 – nº169 – pág:24-30 
Se... 
 
 
 
 
http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp16/16020
01.html 
 
http://www.biostudio.com/d_%20Detecting%20RFLPs.htm 
 
 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/bio20.swf 
 
Variedade de Uso 
 Testes de paternidade 
 Investigações criminais 
 Genotipagem 
 Rastreamento epidemiológico de diversas 
enfermidades humana e animal 
Teste de Paternidade 
 
• No teste de paternidade são comparados os alelos da 
mãe (M), de seu filho (F) e do suposto Pai (P); quando o 
alelo paterno do filho coincide com um dos alelos do 
suposto pai, a paternidade é confirmada 
 Para investigar a identidade de um assassino  
preciso comparar o padrão de polimorfismo de amostras 
de DNA obtidas na cena do crime (E) com padrões de 
vários suspeitos (S1, S2, S3) para buscar alelos 
idênticos 
PCR-RFLP 
 AA AG GG 
 
 
 
861pb 
615pb 
492pb 
 
369pb 
 
 
246pb 
 
 
 
123pb 5’ ... C C A T G G ... 3’ 
3’ ... G G T A C C ... 5’ 
 
 
 
 
 
782pb 
 
586pb 
 
 
 
 
 
 
196pb 
+252 
5’ 3’ 
ENZIMA RESTRIÇÃO: NcoI 
(NEB) – 2U 
Gene: LTA 
Fig.1- Gel em matriz de agarose 2% após digestão por enzima NcoI 
Status da doença 
 Fibrose Cística (CF)  doença recessiva - qualquer indivíduo com 
CF deve ter 2 alelos predispondo a doença; 
 Existem : 
 Indivíduos sem doença - Homozigotos para não digestão , por 
exemplo(AA) 
 Indivíduos que possuem 1 alelo de predisposição a doença, mas 
sem ela – Heterizigotos (AB) 
 Indivíduos doentes – Homozigotos para digestão (BB) 
 Se uma família procura um teste genético  RFLP com DNA do 
casal 
 
 
 
 
 
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/RFLP.html 
AA AB BB 
 Casal  teste  sem CF homozigotos, filho? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ambos pais heterozigotos (AB)  filhos ? 
 
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/RFLP.html 
AA AA