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1 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 1 – Tópico 1: Introdução a bacteriologia clínica Microrganismos: A maioria é benéfica, e apenas uma pequena parcela é patogênica. Estima-se que existam cerca de 10 milhões de bactérias, mas apenas algumas centenas são patogênicas. Microbioma: As bactérias estão presentes em todos os ambientes, incluindo o corpo humano, onde compõem o microbioma, essencial para a saúde. Aplicações das Bactérias: Produção de alimentos (queijos, iogurtes), bebidas (cervejas, vinhos), antibióticos (penicilina) e vacinas. Desequilíbrio do Microbioma: Pode levar a infecções endógenas (causadas por microrganismos já presentes no corpo) ou exógenas (introduzidos externamente). Seres microscópicos: Bactérias, fungos, vírus e parasitos. Bactérias São seres procariontes (unicelulares simples, não possuem membrana nuclear, mitocôndrias, complexo de Golgi e sem retículo endoplasmático), reprodução é assexuada por divisão binária; São classificadas conforme a morfologia (cocos, bacilos, flageladas, espiroquetas, vibrios) e técnicas de coloração, como a Coloração de Gram (que diferencia bactérias Gram-positivas e Gram-negativas) e a Coloração de Ziehl-Neelsen (usada para identificar bactérias álcool-ácido-resistentes, como as micobactérias causadoras de tuberculose e lepra). Morfologia Bacteriana Cocos: são arredondados, podendo apresentar arranjos variados, como: isolados, diplococos, tretacocos, sarcinas, estreptococos e estafilococos. Dicas para diferenciar: Cocos: únicos e simples Diplococos: cocos em dupla Tétrade: cocos em grupos de quatro Sarcinas: grupos de oito cocos que formam um cubo Estreptococos: cocos em cadeia Estafilococos: cocos agrupados como cachos de uva Bacilos: se apresentam em formato mais alongado, se assemelhando a um bastão ou bastonetes, possuem menor número de agrupamentos, comparado aos cocos. Dicas para diferenciar: Bacilos: únicos e simples Diplobacilos: bacilos em dupla Estreptobacilos: bacilos em cadeia 2 Resumo feito por Wanessa Mello Outras: Ainda existem as bactérias em formato de espirilos. Não são retas, apresentam uma ou mais curvaturas. Dicas para diferenciar Vibrião: são bastões curvos, lembra uma vírgula Espirilo: se assemelham a um saca-rolhas, apresenta corpo rígido. Um apêndice externo permite sua locomoção Espiroquetas: formato helicoidal flexível, se movimentam a partir de filamentos axiais Estrutura Bacteriana Cápsula: Revestimento polipeptídico, gelatinoso, que dificulta a fagocitose e permite maior aderência às células do hospedeiro Fímbrias e pilus: São tipo "pelinhos" mais curtos que os flagelos que facilitam a aderência das células às superfícies. Presentes principalmente nas bactérias gram-negativas. Não estão relacionados a motilidade Flagelo: Responsável pela mobilidade da célula, as bactérias que tem um único flagelo são chamadas monotríquias e as com inúmeros flagelos são denominadas peritríquias Parede celular: Envolve a membrana plasmática, apresenta peptideoglicano Membrana plasmática: Reveste o citoplasma, é seletivamente permeável e possui enzimas para reações metabólicas Citoplasma: Componente líquido presente no interior da membrana plasmática, composto principalmente de água Nucleoide: É onde está contido o DNA do cromossomo bacteriano Ribossomos: Pequenos corpos granulares onde ocorre a síntese proteica, formado por rRNA e proteína 3 Resumo feito por Wanessa Mello Difença da Pede Celul das Bactérias Gram-Positivas vs Gram-Negativas Passo a passo da técnica de Coloração de Gram: 1°) Consiste em fixar a bactéria na lâmina. Para isso, adiciona-se uma gota de solução fisiológica a 0,85% e mistura-se com uma amostra de bactéria coletada com uma alça bacteriológica. Em seguida, a lâmina é passada na chama até a solução secar, preparando-a para a coloração. 2°) O cristal violeta é o primeiro corante utilizado, aplicado na lâmina por 1 minuto e depois lavado com água corrente. Ele se liga aos peptidoglicanos da parede celular, colorindo intensamente as bactérias Gram positivas, que possuem uma camada espessa desse composto. 3°) O segundo corante, o lugol, é aplicado na lâmina por 1 minuto para fixar o cristal violeta na parede bacteriana, sendo em seguida lavado com água corrente. 4°) A descoloração é realizada com álcool etílico (99,5º GL), aplicado várias vezes até que o corante não se desprenda mais. As Gram positivas permanecem roxas, enquanto as Gram negativas, com menos peptidoglicano, perdem a coloração. Na etapa final, utiliza-se Safranina ou fucsina para colorir as Gram negativas. 5°) O último corante, Safranina ou fucsina, é aplicado na lâmina por 30 segundos, seguida de lavagem com água corrente e secagem natural. As lâminas devem ser observadas com a objetiva de 100x, utilizando uma gota de óleo de imersão para melhor clarificação. O que permite a diferenciação entre Gram positivas (Gram +) e Gram negativas (Gram -) é a permeabilidade na parede das bactérias. As bactérias Gram positivas retêm o cristal violeta devido à espessa parede de peptidoglicanos (mureína) (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) e por esta razão as bactérias deste grupo coram de roxo. 4 Resumo feito por Wanessa Mello Gram Positivas As bactérias Gram positivas possuem diversas camadas de peptidoglicano, de forma que a estrutura apresenta-se rígida e espessa. Além disso, as bactérias Gram-positivas incluem ácidos teicoicos, que são constituídos principalmente de álcool e fosfato. Por conta dos grupos fosfatos presentes nos ácidos teicoicos, que possuem carga negativa, é possível ligar e regular o movimento de íons positivos para dentro e para fora da célula. Esses ácidos também podem impedir a fissura extensa da parede e a provável lise celular. As bactérias Gram positivas são geralmente mais suscetíveis a antibióticos que atuam na parede celular, como as penicilinas, devido à sua estrutura espessa de peptidoglicano. Exemplos de bactérias Gram positivas incluem Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Enterococcus faecalis. Gram Negativas Diferente das Gram-positivas, as camadas de peptidoglicano das bactérias Gram- negativas são poucas, podendo ser até só uma, e estão localizadas entre a membrana externa e a membrana plasmática. O peptidoglicano fica ligado a lipoproteínas na membrana externa e é encontrado no periplasma (região entre a membrana externa e plasmática). A membrana externa é formada por lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídios, que possuem variadas funções, dentre elas podemos citar: a sua forte carga negativa, que é de grande importância na evasão (escape) da fagocitose, atuando como uma barreira (porém não em todos os ambientes). Parte da permeabilidade da membrana externa é garantida pelas porinas, que são proteínas na membrana que formam canais específicos por onde as substâncias podem atravessar para o espaço periplasmático e, posteriormente, para o interior da célula. 5 Resumo feito por Wanessa Mello As bactérias Gram negativas não conseguem reter o cristal violeta durante o processo de descoloração. Assim, ao serem coradas pela safranina, ficarão coradas de vermelho. Exemplos de bactérias Gram negativas incluem Escherichia coli, Salmonella e Pseudomonas aeruginosa. O quadro abaixo mostra as principais bactérias que compõem os grupos das Gram positivas e Gram negativas. No entanto, nem todas as bactérias coram adequadamente pelo método de Gram. O método de Ziehl-Neelsen é essencial para classificar bactérias em álcool-ácido- resistentes (AAR) e as não álcool-ácido-resistentes. Essa coloração é utilizada para detectar os bacilos álcool-ácidos-resistentes (BAAR), que possuem alta concentraçãosendo esse o momento adequado para a realização da técnica. Importância do Procedimento: O passo a passo da técnica deve ser seguido rigorosamente, com revisão de todos os passos antes do início. Escolha dos Antimicrobianos: Deve ser feita com base na realidade do ambiente hospitalar e nas condições do paciente. Considerações sobre Administração: É fundamental saber se o medicamento é oral ou injetável, pois isso afeta a farmacocinética do fármaco. Cuidado na Leitura de Resultados: É importante reportar resistências intrínsecas com atenção, pois erros nas medições e na execução da técnica podem afetar os resultados. Atualização Contínua: É fundamental estar sempre atualizado com os manuais das Organizações Internacionais sobre grupos microbianos, seus halos e interpretações. Amostras As colônias devem ser cultivadas entre 18 a 24 horas e permanecem viáveis para o teste por até 24 horas. Se o teste não for realizado dentro desse período, é necessário semear em novo meio de cultura para obter colônias jovens e puras. A pureza da amostra é crucial; em caso de contaminação, o microrganismo deve ser re-isolado para evitar erros na medição dos halos e na avaliação do microrganismo envolvido no processo patológico. 52 Resumo feito por Wanessa Mello Métodos Existem métodos convencionais e automatizados. Métodos Convencionais: Disco-Difusão em Ágar (Kirby- Bauer): Qualitativo, com discos individuais ou adaptáveis. Diluição (CIM): Quantitativo. Teste de Gradiente de Concentração: Exemplo: E-Teste®. Microdiluição em Ágar. Microdiluição em Caldo. Métodos Automatizados: Destaca-se a Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Teste p Difusão em Ág: Método de Kby-Bau A técnica inicia com a preparação de uma suspensão de bactérias de cultivo recente, que deve ser semeada em uma placa com Ágar Mueller-Hinton. Discos de papel contendo antimicrobianos são adicionados com uma pinça, que deve ser flambada a cada troca de disco. A placa é incubada em estufa, e o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco é analisado. Após a análise, os halos de inibição são medidos e os valores são comparados a tabelas apropriadas conforme a espécie bacteriana testada. Procedimento: Preparação Inicial: Retirar as placas e discos do refrigerador 20 a 30 minutos antes do teste para que atinjam a temperatura ambiente. Passo a Passo do Teste: 1. Utilizar colônias recentes. 2. Com uma alça bacteriológica, colher a colônia a ser testada. 3. Suspender a colônia em salina estéril (NaCl 0,85%) até obter turvação conforme a Escala 0,5 de Mac Farland (1x10^8 UFC/mL). 4. Umedecer um swab estéril na suspensão bacteriana, comprimindo-o para remover o excesso. 5. Semear suavemente em 5 direções na placa, cobrindo toda a superfície. 6. Aguardar 10 a 15 minutos para a superfície do ágar secar. 7. Colocar os discos de antibiótico sobre a superfície do meio inoculado com uma pinça flambada e resfriada, aplicando leve pressão. 8. Incubar a placa em estufa bacteriológica a 36 °C por 18 a 24 horas. 9. Realizar a interpretação dos resultados. 53 Resumo feito por Wanessa Mello Interpretações dos Resultados Os resultados devem ser medidos com uma régua ou paquímetro para determinar o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco. É necessário consultar a tabela apropriada para avaliar a sensibilidade ao antimicrobiano testado. Categorias de Resultados: Sensível (S): A infecção pode ser tratada com a dosagem recomendada do antimicrobiano. Resistente (R): O antimicrobiano não inibe o microrganismo, resultando em ineficácia clínica. Intermediário (I): Antibióticos que alcançam níveis sistêmicos e teciduais, mas com resposta baixa. Susceptibilidade Dose Dependente (SDD): A suscetibilidade depende do regime de dose utilizado; doses mais altas são necessárias para uma maior eficácia. Diluição ou Concentração Inibitória Mínima (CIM): Método Quantitativo Além do antibiograma em discos, existe o método de diluição em tubos. Este método foi um dos primeiros desenvolvidos e ainda é considerado o método de referência atualmente. Fornece resultados qualitativos e quantitativos. Desvantagens: Dificuldade na detecção de contaminação em testes com materiais clínicos. Aumento no tempo de preparo para execução. Geração de grande quantidade de resíduos. Interpretação dos resultados baseada na densidade da turbidez causada pelo crescimento microbiano. 54 Resumo feito por Wanessa Mello Teste de Gradiente de Concentração (E-Teste ®) Realizada com uma tira plástica que contém quinze concentrações de antibióticos, baseada na difusão do gradiente antimicrobiano no ágar para determinar a sensibilidade da amostra bacteriana. A amostra com 1 a 2 x 10^8 UFC/mL é semeada na superfície da placa de Ágar com um swab. Após 15 minutos, as fitas de Etest® são colocadas sobre o ágar. Em placas de 150 mm, aplicam-se no máximo 5 fitas; em placas de 90 mm, 2 fitas. As placas são incubadas, e a Concentração Inibitória Mínima (CIM) é determinada pelo ponto de intersecção entre a fita de Etest® e a zona de inibição do crescimento, que assume uma forma elíptica, originando o nome "Episilometer test". Miodiluição em Ág Consiste na adição de concentrações seriadas de antimicrobianos em placas de meio de cultura, com cada placa contendo apenas uma concentração. Uma desvantagem é a necessidade de preparar de 6 a 12 placas para avaliar a sensibilidade de um antimicrobiano. As amostras são inoculadas simultaneamente na superfície do ágar usando um multi-inoculador, que dispensa de 1 a 3 microlitros com um inóculo final de aproximadamente 1 x 10^4 UFC/mL. O multi-inoculador pode ter de 32 a 96 pinos, permitindo a inoculação de várias amostras em placas de 90 e 150 mm. As placas devem ser incubadas por 16 a 20 horas a 35±2 ºC, dependendo do gênero bacteriano e do antimicrobiano testado. Após a incubação, a Concentração Inibitória Mínima (CIM) é determinada como a concentração que previne o crescimento macroscópico bacteriano. 55 Resumo feito por Wanessa Mello Miodiluição em Caldo A técnica é de baixo custo, utiliza poucos materiais, é rápida e trinta vezes mais sensível do que outros métodos, permitindo a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Podem conter antimicrobiano liofilizado ou congelado e são inoculadas com um dispositivo plástico para obter uma concentração bacteriana final de aproximadamente 5 x 10^4 - 10^5 UFC/mL por poço. Os painéis de microdiluição devem ser incubados a 35±2 ºC por 16 a 20 horas, dependendo do gênero bacteriano e do antimicrobiano testado. Após a incubação, a leitura da placa e a determinação da CIM são realizadas visualmente, preferencialmente com o auxílio de um espelho parabólico para amplificar a imagem e facilitar a leitura. Detminação da CIM (Automatizado) Métodos Automatizados para Determinação da CIM: Os aparelhos utilizados incluem Vitek®, Vitek-2® (bioMérieux), Walk-Away® (DADE) e BD Phoenix®. Permite uma execução mais rápida, com detecção óptica que identifica alterações discretas no crescimento bacteriano. Esses equipamentos podem identificar simultaneamente bactérias Gram-positivas e Gram- negativas e consolidar os resultados de identificação e do teste de sensibilidade em um único relatório. Rapidez na emissão de resultados, padronização intra e interlaboratorial e redução do trabalho manual. Os sistemas não fornecem valores exatos de CIM, o que pode gerar problemas, conforme resumido em um quadro específico. 56 Resumo feito por Wanessa Mello 57 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade3 – Tópico 3: Noções Gerais sobre a Ação dos Antimicrobianos O analista clínico deve ter um bom entendimento sobre antimicrobianos, pois os testes de susceptibilidade são essenciais para orientar a prescrição médica. Compreender a farmacocinética e a farmacodinâmica é crucial para diferenciar as diversas classes de antimicrobianos. Além da farmacocinética e farmacodinâmica, é importante entender outros conceitos básicos relacionados ao uso de antibióticos. Principais Antimiobianos de Uso Clínico Incluem penicilinas (naturais e semissintéticas), cefalosporinas (de primeira a quinta geração), carbapenêmicos, monobactâmicos e associações com inibidores da betalactamase. Todos os antibióticos betalactâmicos atuam interferindo na síntese da parede bacteriana e, em geral, são bactericidas. A resistência aos betalactâmicos pode ocorrer devido a alterações nas proteínas ligadoras de penicilina, degradação por betalactamases ou redução da permeabilidade da membrana bacteriana externa. O anel betalactâmico é crucial para a estabilidade do grupo e é o local de ação das enzimas que conferem resistência (betalactamases). 58 Resumo feito por Wanessa Mello Penicilinas As Penicilinas atuam contra bactérias Gram-positivas não produtoras de penicilinase, cocos Gram-negativos, anaeróbios e espiroquetas. Penicilinas Naturais: Penicilina G: Amplamente utilizada para meningite (Streptococcus pneumonie, Neisseria meniingitidis) e sífilis neurológica, Procaína: Uso intramuscular, indicada para infecções menos graves (faringoamigdalite, erisipela, gonorreia) e Benzatina (Benzetacil®): Uso intramuscular, de meia-vida de 21 a 28 dias, indicada para profilaxia de febre reumática, tratamento de faringoamigdalite e sífilis (exceto a forma neurológica, visto que não atravessa a barreia hematoencefálica) Penicilinas Semissintéticas: Oxacilina: Resistente a penicilinases, indicada para infecções por Staphylococcus aureus sensíveis e Meticilina: Não utilizada rotineiramente. Aminopenicilinas: Ampicilina: Eficaz contra várias bactérias, apresenta estabilidade tanto para utilização oral quanto parenteral, com meia-vida de 50 a 60 minutos. Indicada para infecções respiratórias, urinárias e meningites. Amoxicilina: Melhor absorção oral, indicada para Helicobacter pylori e doença de Lyme. Mais utilizada para infecções da cavidade oral e trato respiratório. 59 Resumo feito por Wanessa Mello Cefalosporinas: Parte do grupo dos betalactâmicos, inibem a síntese da parede celular bacteriana. Primeira Geração: Eficazes contra Staphylococcus aureus meticilina sensível e algumas enterobactérias. Segunda Geração: Maior ação contra cefalosporinases e algumas bactérias anaeróbias. Terceira Geração: Usadas para infecções do sistema nervoso central, mas com baixa atividade contra Pseudomonas. Quarta Geração: Melhoram a atividade contra Gram-positivos e bacilos Gram- negativos. Betalactâmicos Inibidores de Betalactamase: Apresentam atividade antibacteriana mínima, mas são potentes e associados a penicilinas para ampliar o espectro antimicrobiano. Carbapenêmicos: Têm o espectro mais abrangente entre os antibióticos. Resistência pode ocorrer pela produção de carbapenemases e metalobetalactamases, especialmente por enterobactérias e Pseudomonas. Aminoglicosídeos Os aminoglicosídeos se ligam ao ribossomo bacteriano. Inibem irreversivelmente a síntese proteica. Tratamento de enterobactérias e bacilos Gram-negativos (com atenção ao padrão de sensibilidade). Terapia combinada para endocardites ou infecções graves por cocos Gram- positivos (não usar dose única diária). Nefrotoxicidade e ototoxicidade, afetando a função vestibular. Podem causar bloqueio neuromuscular e miopatias em pacientes com miastenia ou em uso de bloqueadores neuromusculares. Atenção à função renal durante o uso. Insuficiência renal associada a aminoglicosídeos pode aparecer após uma semana e é não oligúrica. Potencializam o efeito de outros antimicrobianos, especialmente betalactâmicos. Podem ser a única droga sensível em infecções por produtores de carbapenemases, como KPC resistente à polimixina. Maolídeos Inibem a síntese proteica, impedindo a fixação do RNA transportador ao ribossomo. Bloqueiam a disponibilidade de aminoácidos. Podem ser bactericidas ou bacteriostáticos. Náuseas, diarreia, dor abdominal, dispepsia e tonturas. Azitromicina: melhor posologia. Claritromicina: amplamente utilizada. 60 Resumo feito por Wanessa Mello Quilononas Derivadas do composto quinoleína, presente em alcaloides e drogas antimaláricas. Ação bactericida por inibição da DNA- girase. Efeitos Adversos: Náuseas, vômitos, dispepsia e outros efeitos gastrintestinais. Aumento de transaminases. Primeira Geração: Representada pelo ácido nalidíxico. Ação bactericida contra Gram- negativas, sem atividade contra Pseudomonas aeruginosa. Alta concentração em vias urinárias, baixa concentração tissular e liquórica. Principal indicação: infecções urinárias baixas por enterobactérias. Pouco utilizada atualmente devido à resistência e posologia a cada 6 horas. Segunda Geração: Ativas contra Pseudomonas aeruginosa. Norfloxacino é o principal representante, disponível apenas para uso oral. Excelente concentração em vias urinárias, indicada para infecções urinárias baixas. Espectro de ação inclui vários bacilos Gram-negativos e algumas bactérias como Haemophilus e Neisseria. Terceira Geração: Ação contra enterobactérias, Staphylococcus, Neisseria e Pseudomonas. Pouca eficácia contra S. pneumoniae e baixa penetração no trato respiratório. Administração por via oral ou parenteral, eliminação renal. Principais representantes: Ciprofloxacino e Ofloxacino. Indicações incluem infecções urinárias, salmoneloses, shigeloses e osteomielites. Quinolonas Respiratórias: Exemplos: Levofloxacino, Moxifloxacino e Gemifloxacino. Levofloxacino: espectro de ação contra Gram-positivos e Gram- negativos. Indicado para infecções respiratórias, trato urinário, gastrointestinal e de partes moles. Não indicado para meningites bacterianas devido à baixa concentração no líquor. 61 Resumo feito por Wanessa Mello Sulfonamidas Principais Agentes Sulfadiazina e a Associação de sulfametoxazol (SMX) com trimetoprima (TMP). As sulfas fazem o tratamento de doenças oportunistas. Utilizadas em pacientes imunodeprimidos, especialmente o SMX. Cocos Gram-positivos (sensibilidade variável), Fungos com Pneumocystis jirovecii, Protozoários como Isospora belli, micobactérias como Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium scrofulaceum. Espécies como Nocardia asteroides. SMX-TMP Medicação de escolha para pneumocistose, isosporíase e nocardiose. Usado para infecções urinárias baixas não complicadas. Tratamento de donovanose, legionelose, salmonelose e doença de Whipple (terapia combinada). Alternativa para toxoplasmose e infecções por Stenotrophomonas maltophilia. SMX-TMP pode ser opção para infecções por Staphylococcus MRSA, se a sensibilidade for identificada em cultura. Glicopeptídios Inibem a síntese e o agrupamento do peptidoglicano da parede celular. Alteram a permeabilidade da membrana citoplasmática. Afetam a síntese do RNA. Principais Drogas: Vancomicina e Teicoplanina. Indicações clínicas da Vancomicina: Infecções por MRSA, Enterococcus resistente à ampicilina, Pneumococo resistente à penicilina, Clostridium difficile (colite induzida por antimicrobianos) e Staphylococcus epidermidis (em pacientes com dispositivos intravasculares, próteses e imunossuprimidos). Associação com Aminoglicosídeos usada em infecções por Enterococcus em casos graves (gentamicina/estreptomicina). Via intravenosa para a maioria das infecções. Via oral apenas para colite por C. difficile. Atravessa a barreira hematoencefálica somente em meninges inflamatórias. Teicoplanina: Mecanismo de ação e espectro semelhantes à vancomicina. Meia-vida mais longa, permitindo dose única diária intramuscular. Indicações semelhantes à vancomicina. Pode ser administrada ambulatorialmente. Alternativa para reações de hipersensibilidade à vancomicina. Não atravessa a barreira hematoencefálica, mesmo em meninges inflamadas. Licosamidas Inclui lincomicina e clindamicina. Clindamicina é a única medicação utilizada atualmente. Inibe a síntese proteica ligando-se à subunidade 50S ribossomal (efeito bacteriostático). Bactérias aeróbias Gram-positivas. Bactérias anaeróbias (exceto Clostridium difficile). Infecções comunitárias por Staphylococcus aureus (celulite, furunculose). Infecções de cavidade oral. Osteomielite. Infecções por bactérias anaeróbias. Alternativa no tratamento de toxoplasmose e pneumocistose. Boa opção para cobertura de estafilococos sensíveis à meticilina e, ocasionalmente, MRSA. Risco de colite pseudomembranosa. 62 Resumo feito por Wanessa Mello Clanfenicol Inibe a síntese de proteínas bloqueando os ribossomas bacterianos na subunidade 50S. Bactérias Gram-positivas: Streptococcus (pneumococo, Enterococcus, grupo viridans), Staphylococcus aureus (meticilinossensível) e epidermidis, Listeria monocytogenes e Corynebacterium diphtheriae. Bactérias Gram-negativas: Haemophilusinfluenzae, Salmonella, Shigella spp., Escherichia coli, Proteusmirabilis, Citrobacter spp. e Klebsiella spp. Anaeróbios: Clostridium e Bacteroides fragilis. Outros Patógenos: Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia e Bartonella. Resistência: Naturais: Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Providencia spp. e Proteus rettgeri. Secundária: Algumas enterobactérias, como Haemophilus, Streptococcus, Staphylococcus e Bacteroides fragilis. Indicações Clínicas Abscesso cerebral (boa penetração liquórica e atividade contra anaeróbios). Salmonelose. Meningite por Haemophilus em crianças. Tratamento de rickettsioses (febre Q, febre maculosa, tifo epidêmico). Bartoneloses e infecções por anaeróbios (apendicite, pelviperitonite, aborto séptico, perfuração de vísceras, abscessos). Tetraciclinas Antimicrobianos com anel tetracíclico. Ação bacteriostática, inibindo a síntese proteica. Ligam-se reversivelmente à subunidade 30S do ribossomo, bloqueando a ligação do RNA transportador. Principais Tetraciclinas: Tetraciclina (ação curta) e Doxiciclina (ação longa). Inclui diversas bactérias aeróbias e anaeróbias, Surgimento de resistência e toxicidade limitam as indicações clínicas. Indicações Clínicas: Doença de Lyme (Borrelia burgdorferi). Brucelose (terapia combinada). Granuloma inguinal (Calymmatobacterium granulomatis). Infecções por Chlamydia trachomatis (linfogranuloma venéreo, tracoma). Chlamydophila pneumoniae (pneumonias). Helicobacter pylori. Doença inflamatória pélvica aguda. Rickettsioses. Espiroquetas (leptospirose e sífilis). Cólera. Efeitos Adversos: Comuns (dispepsia, náuseas e vômitos), Possíveis (pancreatite, retardo no desenvolvimento ósseo e escurecimento dentário em crianças), Hipoplasia do esmalte dentário (desaconselhada para menores de 8 anos) e Interferência na ação renal do hormônio antidiurético. Imidazólicos Principal medicamento é Metronidazol, derivado do 5- nitroimidazólico. Inibição da replicação do DNA. Ativo contra a maioria dos anaeróbios Gram-negativos (incluindo Bacteroides e Clostridium sp.). Eficaz contra protozoários e parasitas: Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia e Entamoeba histolytica. Indicações Clínicas: Perfuração intestinal. Peritonites e pelviperitonites. Apendicite perfurada. 63 Resumo feito por Wanessa Mello Aborto séptico Abscessos (hepático, cerebral, etc.). Colite pseudomembranosa. Tratamento combinado da úlcera por Helicobacter pylori. Polimixinas Antimicrobianos polipeptídicos com mecanismo de ação distinto. Baixa possibilidade de resistência cruzada com outros antimicrobianos. Ativas contra muitas bactérias multirresistentes. Interagem com a molécula de polissacarídeo da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Retiram cálcio e magnésio, essenciais para a estabilidade da membrana. Aumentam a permeabilidade da membrana, resultando em perda rápida do conteúdo celular e morte bacteriana. Representantes: Colistina e Polimixina B. Restrito e deve considerar o custo- benefício. Efeitos Colaterais: Nefrotoxicidade é um efeito colateral importante. Oxazolidinonas Nova classe de drogas introduzida no Brasil em 2000. Opção para tratamento de infecções por cocos Gram-positivos resistentes à vancomicina. Representante: Linezolida. Inibe a síntese proteica ao se fixar na subunidade 50S do ribossomo. Bacteriostática contra a maioria dos microrganismos sensíveis. Eficaz contra: Staphylococcus aureus (incluindo cepas resistentes à meticilina), Staphylococcus coagulase negativo, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis. Sem ação contra a maioria dos patógenos Gram-negativos. Estreptograminas Composição: combinação de quinupristina e dalfopristina. Inibem a síntese proteica agindo sobre o ribossomo. Bacteriostáticas quando usadas isoladamente. Sinérgicas e bactericidas quando usadas em combinação. Eficazes contra: Enterococcus faecium (incluindo cepas resistentes à vancomicina). Staphylococcus spp. Streptococcus pneumoniae. Limitada atividade contra Enterococcus faecalis. Indicações Clínicas: Alternativa terapêutica para infecções por agentes sensíveis em pacientes com intolerância a outras drogas. Útil contra agentes resistentes a glicopeptídios e penicilina. Glicilciclinas Único representante: tigeciclina. Derivada da minociclina. Gram-positivos: Eficaz contra MRSA e Enterococcus multirresistentes. Gram-negativos: Eficaz contra KPC e Acinetobacter multirresistentes. Outros Patógenos: Mycoplasma pneumoniae e Anaeróbios como Bacteroidesfragilis e Peptostreptococcus. Sem ação contra Pseudomonas sp. 64 Resumo feito por Wanessa Mello Lipopeptídeos Tricíclicos Nova classe de antibióticos representada por daptomicina. Eficaz contra bactérias Gram- positivas, incluindo: MRSA (Staphylococcus aureus resistente à meticilina) e Enterococcus resistentes à vancomicina. Indicações Clínicas: Aprovada para tratamento de endocardites por S. aureus em câmaras cardíacas direitas. Uso off label para endocardites causadas por Gram-positivos em geral.de ácidos micólicos, dificultando sua coloração com corantes aquosos devido à sua hidrofobicidade. As micobactérias são um importante grupo de bactérias AAR, neste grupo incluem os agentes causais da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) e da lepra (Mycobacterium leprae), são um importante grupo de AAR. 6 Resumo feito por Wanessa Mello Algumas bactérias não são coloridas pelas técnicas tradicionais, portanto, sua classificação é feita com base em seu formato ou em características específicas, como o crescimento dentro de células hospedeiras ou em culturas laboratoriais. Bactérias em espiral Bactérias intracelulares obrigatórias Campylobacter Rickettsia Helicobacter Orientia Treponema Ehrlichia Borrelia Anaplasma Leptospira Chlamydia 7 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 1 – Tópico 2: Relação Bactéria x Hospedeiro Termos Importantes: Patologia: é o estudo das doenças. Patogênese: é maneira pela qual a doença se desenvolve. Infecção: invasão e colonização de microrganismos patogênicos. Doença: processo que altera o estado de saúde. Miobioma Formação do Microbioma: - Início no nascimento. - Influência do tipo de parto na colonização bacteriana. Tipos de Parto: Parto Cesáreo: - Contato inicial com a pele da mãe. - Colonização por gêneros: Staphylococcus, Corynebacterium, Propionibacterium. Parto Normal: - Contato inicial com a microbiota vaginal. - Colonização predominantemente por Lactobacillus. Aquisição do Microbioma ao Longo da Vida: - Influências: respiração, introdução alimentar, gatinhar e andar. Papel dos Microrganismos: - Permanência no corpo humano durante a vida. - Funções protetoras e potencial para causar doenças em situações desfavoráveis. Células no Corpo Humano: - Aproximadamente 1x10¹³ células humanas. - Aproximadamente 1x10¹⁴ células bacterianas. - Relação: 10 vezes mais células bacterianas do que células humanas. Fatores que Determinam a População de Microrganismos: - Nutrientes. - Fatores químicos e físicos. - Defesas do hospedeiro. - Fatores mecânicos. Benefícios da Microbiota: - Impede o crescimento de microrganismos patogênicos. - Previne o surgimento de infecções. - Fenômeno conhecido como antagonismo microbiano. Interações entre Microbioma e Hospedeiro: Simbiose: Interação onde pelo menos um organismo depende do outro. Comensalismo: Um organismo é beneficiado; o outro não é afetado. 8 Resumo feito por Wanessa Mello Mutualismo: Ambos os organismos são beneficiados. Parasitismo: Um organismo obtém nutrientes à custa do outro; muitas bactérias patogênicas são parasitas. Amensalismo: - Um organismo libera substâncias tóxicas que inibem o crescimento ou reprodução de outros. - Exemplo: ação de antibióticos como a penicilina. Microrganismos Oportunistas: - Parte do microbioma normal, mas podem causar doenças sob certas condições. - Exemplo: Escherichia coli - normalmente na microbiota intestinal, mas pode causar doença se mudar de sítio. Doenças Infeiosas: como surgam? Algumas doenças como tuberculose e pólio possuem suas etiologias conhecidas, conquanto, isso não ocorre com todas as doenças, como é o caso de muitos tipos de câncer. Vale ressaltar que nem toda doença é provocada por microrganismos, como ocorre com a Anemia Falciforme, que é uma doença genética. A doença acontece quando há alterações dos sistemas e das suas funções, com isso, o paciente começa a apresentar sinais e sintomas que demonstram que algo de errado está acontecendo em seu corpo. Lembrando que os sintomas se enquadram em tudo aquilo que o paciente relata que está sentindo, já os sinais podem ser observados pelo médico através de uma anamnese. Através desta junção de sinais, sintomas e exames laboratoriais, podemos chegar a um diagnóstico confiável. Alguns termos são de extrema importância para um amplo entendimento, vejamos: Doença comunicável: é aquela em que uma pessoa infectada transmite um agente infeccioso, de forma direta ou indireta. Ex: gripe. Doenças contagiosas: são facilmente transmissíveis e com rápida disseminação. Ex: catapora. Doença não comunicável: não é disseminada de um hospedeiro para o outro. Ex: tétano. Doença esporádica: é aquela que ocorre ocasionalmente. Ex: febre tifoide nos Estados Unidos. Doença endêmica: é aquela que está presente constantemente em uma determinada população. Ex: a dengue em algumas regiões do Brasil. Doença epidêmica: quando há um aumento relativo de casos de uma doença, não delimitando uma região específica. Ex: a gripe suína em 2009 teve caráter epidêmico no início. Doença pandêmica: é uma determinada doença com aumento significativo de casos em vários países e continentes. Ex: coronavírus (COVID-19). Para que uma doença se instale em um indivíduo, é necessário que ocorra um passo a passo do processo: 1. Deve-se ter um reservatório, ou seja, uma fonte da infecção. 2. O patógeno entrará em contato com um hospedeiro suscetível, seja ele por contato direto, indireto ou por meio de vetores. 3. Após a transmissão, o microrganismo deve se instalar em uma determinada região e iniciar o seu processo de multiplicação. 4. Os danos irão se iniciar nas células do hospedeiro, este processo é denominado patogênese. O grau de danos causados por microrganismos depende da virulência do patógeno e da resposta imune do hospedeiro. Compreender a interação entre esses dois fatores é essencial para entender como o corpo reagirá a uma invasão. 9 Resumo feito por Wanessa Mello Se o sistema imunológico não conseguir responder de forma eficaz, é importante conhecer os mecanismos que os patógenos utilizam para contornar as defesas do organismo e desencadear a doença. Essa compreensão é fundamental para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento. Predisposição e seus Fates A predisposição para doenças é influenciada por diversos fatores que tornam um hospedeiro mais suscetível a desenvolver certas patologias. Esses fatores incluem: Sexo: Diferenças anatômicas podem predispor a certas doenças. Por exemplo, mulheres têm maior incidência de infecções urinárias devido à proximidade entre o ânus e a vagina, o que facilita a invasão de microrganismos. Genética: Aspectos genéticos do hospedeiro são determinantes na instalação e evolução de doenças. Um exemplo é a Talassemia, um distúrbio sanguíneo que pode variar de leve a grave, necessitando de transfusões ou transplantes de células-tronco em casos mais sérios. Condições Climáticas: O clima pode influenciar a incidência de doenças. No inverno, por exemplo, há um aumento de doenças respiratórias devido à maior umidade, baixas temperaturas, poluição ambiental e o hábito de permanecer em ambientes fechados e pouco ventilados, o que favorece a circulação de microrganismos. Outros Fatores: Nutrição, idade, meio ambiente, estilo de vida, ocupação laboral, doenças preexistentes e tratamentos prolongados (como quimioterapia) também desempenham um papel significativo na evolução e desfecho de muitas doenças. Esses fatores, em conjunto, contribuem para a predisposição e a suscetibilidade do hospedeiro a diversas patologias. 10 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 1 – Tópico 3: Mecanismos de Patogenicidade Como um Miganismo infecta um hospedeo? Patogenicidade x virulência: Patogenicidade é a capacidade de um organismo causar doença, ou seja, é a forma que ele consegue ultrapassar as barreiras de defesas para causar um dano. Virulência seria o grau da patogenicidade, isto é, o quanto este microrganismo pode causar dano ao hospedeiro. É muito importante entender como os patógenos invadem nosso corpo. As primeiras etapas desse processo envolvem a quebra de barreiras ou portasde entrada, como a pele e as mucosas. Quando uma bactéria consegue ultrapassar essa barreira inicial com sucesso, ocorre uma infecção, que pode ou não progredir para uma doença. Certos microrganismos têm acesso ao hospedeiro pelas mucosas, trato respiratório, gastrointestinal, urogenital e/ou conjuntiva.. Pele e via Pental A pele é o maior órgão do corpo humano. Se a pele estiver íntegra, é difícil ocorrer invasão. Infecções causadas por bactérias ou fungos precisam ter uma abertura da pele para se instalar. Para os fungos, algumas doenças são denominadas de implantação. Algumas espécies de tais bactérias fazem parte da microbiota da pele, mas em situações de quebra de barreiras, sejam elas causadas por cortes ou danos gerais, como arranhões ou queimaduras, podem provocar infecções. Via parenteral: Quando os microrganismos se depositam diretamente em tecidos ou em membranas mucosas; perfurações, cirurgias e edemas podem desencadear nesta via. Bactérias que causam tétano e gangrena podem ser transmitidas por esta via. No caso do tétano, por exemplo, as bactérias podem ser introduzidos nos ferimentos através de perfurantes (como pregos). Ao entrarem no ferimento, as bactérias se multiplicam e produzem duas toxinas: a tetanolisina e a tetanopasmina, esta última é uma neurotoxina que quando disseminada pelo sistema circulatório causa as manifestações clínicas da doença, induzindo a contraturas musculares intensas Vale ressaltar que o fato de um microrganismo entrar em nosso corpo não é um veredito para que a doença se desenvolva. A ocorrência da doença depende de muitos fatores, a porta de entrada é apenas um deles. Quantidade de Miganismos Ao iniciar uma invasão em um hospedeiro suscetível, a quantidade de microrganismos agressores é crucial para o desenvolvimento da doença. O sistema imunológico é ativado e produz uma resposta eficiente, eliminando parte dos invasores. No entanto, se o número de patógenos for alto e conseguirem entrar com sucesso, eles podem superar as defesas imunológicas, aumentando as chances de a doença se estabelecer. 11 Resumo feito por Wanessa Mello Adência Os microrganismos possuem estruturas que facilitam a sua invasão. Praticamente, todos os microrganismos possuem um mecanismo de adesão aos tecidos dos hospedeiro e para a maioria dos patógenos, esta capacidade é denominada aderência ou adesão. Este recurso ocorre porque o microrganismo tem a capacidade de se ligar a moléculas presentes nas superfícies celulares de seus hospedeiros. As Adesinas são constituídas de glicoproteínas e lipoproteínas. Podem ter variações em suas estruturas, como também diferentes receptores, podem ser encontradas em diferentes células do hospedeiro. As Bactérias têm a capacidade de se ligarem em massa - Biofilmes: comunidade de bactérias envoltas por substâncias, principalmente açucares, produzido pelas próprias bactérias envolvidas que conferem proteção contra a falta de nutrientes, uso de antibióticos e agentes químicos. Formação de Biofilme: 1) As bactérias precisam aderir a uma superfície; 2) Passam a secretar substâncias que serão responsáveis pela manutenção do biofilme; 3 e 4) Ocorre a formação de microcolônias que serão responsáveis por criar a forma do biofilme; 5) É quando o ambiente se torna desfavorável e o biofilme se desloca em forma de agregados celulares para a formação de um novo biofilme. Vale ressaltar que quando um biofilme é formado, não necessariamente teremos nesta biomassa apenas um tipo de microrganismo, o que pode levar à resistência a antibióticos e a desinfetantes. Estima-se que em cerca de 65% das infecções bacterianas em humanos, os biofilmes estejam presentes. Exemplos: Streptococcus mutans nos dentes que leva as cáries. No intestino através de Escherichia coli enteropatogênica, causa a diarreia, que acomete principalmente crianças menores de dois anos, associada a uma alta taxa de mortalidade (cerca de 10% a 40%). Cápsulas Algumas bactérias podem produzir cápsulas ou glicocálice. Parede Celular - impedir que a bactéria seja fagocitada pelas células de defesa do hospedeiro. Hospedeiros pode produzir anticorpos contra a cápsula. 12 Resumo feito por Wanessa Mello Enzimas Bactianas Coagulases: possuem a capacidade de coagular o fibrinogênio do sangue. Algumas bactérias do gênero Staphylococcus produzem esta enzima. Cinases: degradam a fibrina e digerem coágulos. Uma das cinases mais conhecida é a fibrinolisina, que é produzida por algumas bactérias do gênero Streptococcus. Hialuronidase: capacidade de hidrolisar ácido hialurônico, um tipo de polissacarídeo que tem a função de unir as células do corpo. Sabe-se que esta enzima pode estar envolvida na necrose de ferimentos, auxiliando na dispersão das bactérias a partir do sítio inicial de infecção. Colagenase: Produzida por diversas espécies do gênero Clostridium. Acredita-se que sua função é a disseminação da gangrena gasosa, quebrando proteínas de colágeno que formam os tecidos conectivos. Proteases IgA: Capacidade de destruir anticorpos IgA, os responsáveis por não permitir a aderência das bactérias nas células do hospedeiro. Agentes causais da gonorreia e da meningite produzem este tipo de enzima. Plasmídeos São moléculas de DNA circular menores que o cromossomo. Não são ligados ao cromossomo bacteriano. São autoduplicáveis. Ficam espalhados pelo hialoplasma. Apresentam genes adicionais, que podem auxiliar na sobrevivência das bactérias (não são essenciais). Costumam conter os genes para resistência a antibióticos. Os plasmídeos R são responsáveis pela resistência de algumas bactérias frente a alguns antibióticos. Por terem este tipo de capacidade, podem carregar também fatores de patogenicidade de uma bactéria. Bactérias resistentes a antibióticos e com a presença de plasmídeos na sua grande maioria, que consequentemente podem aumentar os casos de infecções persistentes no ambiente hospitalar e falha do tratamento. 13 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 1 – Tópico 4: Patogênese Bacteriana Invasão e Patogênese Quando o sistema imune não consegue ser eficaz em destruir os invasores, estes iniciarão o processo de dano celular, que está resumido na figura abaixo. Na primeira etapa ocorre a transmissão do microrganismo ao invadir o local da lesão; este passará pelo processo de colonização e multiplicação. Após este processo, as bactérias já em maior número iniciam o processo de dano celular que consequentemente dão início aos sinais e sintomas no hospedeiro. Utilizando os Nutrientes do Hospedeo O ferro é um importante nutriente tanto para o hospedeiro quanto para o patógeno. A Echerichia coli uropatogênica é o principal agente causador de infecção do trato urinário. Esta bactéria quebra o ferro para sua sobrevivência, mantendo a sua permanência no hospedeiro. Danos no Local da Invasão Algumas bactérias possuem a capacidade de causar danos diretos à célula e isso é possível pois conseguem induzir as células epiteliais a promoverem um processo parecido com a fagocitose. O microrganismo inicia o processo de multiplicação, seguido do rompimento da célula, onde novas bactérias serão liberadas e estarão prontas para infectarem novas células e assim dar continuidade ao processo de patogênese. Outras bactérias também conseguem realizar este processo através da excreção de enzimas e também pela sua mobilidade, no qual o processo de penetração também acaba causando danos diretos às células. 14 Resumo feito por Wanessa Mello Toxinas Bactianas Algumas bactérias produzem toxinas que são consideradas venenosas. São um fator de patogenicidade e podem ser letais quando transportadas pelo sangue e linfa. Algumas toxinas podem desencadear febre, diarreia, distúrbios cardiovasculares,choque e podem inibir a síntese proteica, destruir vasos sanguíneos e provocar danos ao sistema nervoso central. Até o momento são conhecidas aproximadamente 220 toxinas e 40% destas causam danos às células eucariontes. É importante ressaltar que as intoxicações são causadas pela presença da toxina e não pela multiplicação bacteriana. São classificadas em exotoxinas e endotoxinas. As exotoxinas são produzidas dentro da célula bacteriana como parte do seu metabolismo. “Exo” significa fora, o que quer dizer que as exotoxinas são produzidas dentro da célula bacteriana e excretadas para o meio externo após sua lise, ou seja, a bactéria morre e depois libera a exotoxina. Suas bactérias produtoras podem ser tanto gram positivas quanto gram negativas. As exotoxinas são classificadas em três tipos: toxinas A-B, toxinas danificadoras de membrana e superantígenos. A do tipo A-B são denominadas desta forma pois são divididas em duas partes, sendo a porção A o componente ativo e a B o componente de ligação. As endotoxinas diferentemente das exo, são produzidas apenas pelas bactérias gram- negativas e estão localizadas no interior da célula. Outra diferença é que as endotoxinas são lipopolissacarídeos e as exotoxinas são proteínas. As endotoxinas estão presentes na porção externa da parede celular e são denominadas como porção LPS (lipídeo A + polissacarídeo O). 15 Resumo feito por Wanessa Mello Induzindo Reações de Hipsensibilidade O sistema imunológico tem um papel muito importante no controle de disseminação dos microrganismos no nosso corpo. Em contrapartida, o sistema pode sofrer algumas deficiências, tanto na imunidade inata – com disfunções em células fagocíticas, como no sistema imune adaptativo –, com deficiência na produção de anticorpos ou falha de função das células T. Isso está fortemente associado com o aumento da susceptibilidade a infecções. Algumas evidências têm sido levantadas a respeito da resposta imune ao agente agressor; e o que se tem notado é que em muitas doenças, os principais aspectos patológicos não estão relacionados com uma ação direta do patógeno, e sim com uma resposta imune anormal. Neste contexto entram as reações de hipersensibilidade, que nada mais é do que uma resposta exacerbada do sistema imune e, como consequência, acaba causando dano celular no hospedeiro. 16 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 1 – Tópico 5: Resposta Imune contra Bactérias Mecanismos de Sobrevivência da Bactéria no Hospedeo Bactérias Intracelulares: possuem um mecanismo de penetração em macrófagos, que constitui uma estratégia de sobrevivência, pois conseguem escapar da ação do sistema imune. Ex.: Mycobacterium tuberculosis, o Mycobacterium leprae e a Listeria monocitogenesis. Dentro dos macrófagos, as bactérias estimulam a imunidade celular por meio das células TCD4+ e TCD8+. As TCD4+ secretam IFN-γ, aumentando a produção de óxido nítrico (NO) pelos macrófagos, resultando na destruição da bactéria. As TCD8+ destroem os macrófagos infectados via citotoxicidade. Bactérias Extracelulares: grupo que mais frequentemente causa infecções bacterianas. Com relação à formulação da resposta imunológica contra elas, estão envolvidas neste processo as barreiras naturais, a resposta imune inata e a resposta imune humoral. As barreiras naturais são cruciais na defesa do organismo, sendo as primeiras a serem ativadas para impedir a entrada e a infecção por patógenos. Exemplos incluem: - Integridade da pele e mucosas, que bloqueiam a aderência e penetração de bactérias. - Movimento mucociliar do trato respiratório. - pH ácido do estômago, que destrói bactérias no trato digestivo. - Substâncias antimicrobianas presentes na saliva e secreções prostáticas. 17 Resumo feito por Wanessa Mello Resposta Imunológica Hospedeo A resposta imune inata conta com a participação de todas as suas células. Sistema complemento: ativa o complexo de ataque a membrana e facilita a opsonização das bactérias. Quimiocinas: atraem as células de defesa para o sítio da lesão. Citocinas: pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-6) são produzidas no início da infecção e são responsáveis pela febre e inibição da multiplicação bacteriana, além de estimularem neutrófilos e macrófagos a produzirem NO. Células fagocitárias: neutrófilos e monócitos/macrófagos. Na imunidade adaptativa, a produção de anticorpos desempenha um importante papel na defesa contra bactérias. Suas principais ações são: 1) opsonização; 2) ativação do sistema complemento; 3) promoção da neutralização de bactérias, ou de seus produtos. Os anticorpos podem destruir as bactérias a partir da ativação do complemento através da via clássica. Os anticorpos, principalmente o IgA, ligam-se às bactérias e impedem a adesão delas às células do hospedeiro. Além disso, os anticorpos podem se ligar a toxinas, neutralizando-as, impedindo a sua ação no corpo do hospedeiro. As principais características entre a resposta imune inata e adaptativa estão presentes na tabela: Imunidade Inata Imunidade Adaptativa Independente do agente Depende do Agente Resposta imediata e rápida Período de latência Não específica a antígeno Específica a antígeno Sem memória imunológica Memória imunológica No entanto, em algumas situações, as infecções provocadas por bactérias gram negativas podem deixar seu sítio primário e acometer outros sítios, o que resultaria em uma septicemia e choque séptico, ambas são situações graves e estão associadas a uma alta taxa de mortalidade. 18 Resumo feito por Wanessa Mello O choque é desencadeado pela LPS que está presente na parede celular bacteriana. Assim, um processo exacerbado de produção de citocinas (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8) é iniciado através de neutrófilos, macrofágos e células endoteliais. Após isso, ocorre a diminuição do tônus muscular e débito cardíaco, que resulta na hipotensão e má perfusão tecidual, provocando morte celular. No entanto, experimentos realizados em camundongos por Caille e colaboradores (2004) têm demonstrado que há como modular essa resposta exacerbada através da administração concomitante de IL-10 e LPS, o que mostrou uma proteção aos camundongos da morte por choque séptico, por inibir a produção de IL-12 e a síntese de IFN-γ e TNF-α. 19 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 2 – Tópico 1: Estrutura e Biossegurança no Laboratório de Microbiologia Clínica Estrutura Básica e Claificação de Risco na Miobiologia Clínica Segundo a ANVISA a estrutura física do laboratório deve atender aos requisitos da RDC/ANVISA, nº50, publicada em 21 de fevereiro de 2002. O laboratório de microbiologia é responsável por caracterizar e também identificar os microrganismos presentes em vários tipos de amostras. Esta área pode ter diversos segmentos, tais como: saúde, indústria alimentícia e cosméticos. Na bacteriologia clínica, o laboratório tem a função de receber amostras biológicas de pacientes para que possam ser processadas e realizadas a identificação das bactérias envolvidas nos processos patológicos. O principal risco de um laboratório nesta área seria a contaminação do manipulador com as amostras biológicas, portanto, faz-se necessária a utilização de equipamentos de Biossegurança, como luvas, máscaras, óculos de proteção e jaleco para a segurança do analista. Os equipamentos mínimos para funcionamento de um laboratório de microbiologia estão sumarizados no quadro 1: No entanto, devemos lembrar que diferentes tipos de microrganismos exigem diferentes abordagens em biossegurança, uma vez que possuem variados graus de patogenicidade, logo, os tipos de equipamentos e estrutura utilizados devem ser diferentes.No quadro 2 podemos verificar a classificação dos microrganismos com base no seu risco apresentado. Classe de Risco 1 Risco individual e para a comunidade é ausente ou muito baixo – São organismos que não causam doenças ao homem ou aos animais. Ex.: microrganismos usados na produção de cerveja, vinho, pão e queijo (Lactobacillus casei, Penicilliumcamembertii, S. cerevisiae etc). Classe de Risco 2 Risco individual moderado e risco limitado para a comunidade –São patógenos que causam doenças ao homem ou aos animais, porém, seu potencial de propagação é limitado, onde medidas terapêuticas e profiláticas eficazes estão disponíveis. Exemplo: bactérias - Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; vírus - EBV, herpes, dengue (sorotipos 1, 2, 3 e 4); fungos - Candidaalbicans; parasitas – Plasmodium sp. e Schistosoma mansoni. Estufa bacteriológica Banho-maria de pequena dimensão Estufa de esterilização Destilador para água Autoclave Balança analítica Microscópio binocular Bico de Bunsen Centrifugador de baixa rotação Geladeira + Congelador Homogeneizador Capela de fluxo laminar 20 Resumo feito por Wanessa Mello Classe de Risco 3 Elevado risco individual e risco limitado para a comunidade – Os patógenos geralmente causam doenças graves ao homem ou aos animais e podem representar um sério risco a quem os manipulam. Podem propagar-se de individuo para individuo, mas usualmente existem medidas de tratamento e de prevenção. Exemplos: bactérias - Bacillus anthracis, Brucellaspp, Chlamydophilapsittaci, Mycobacterium tuberculosis; vírus - HTLV 1 e 2, HIV, Vírus Influenza A (H5N1); fungos – Coccidioidesimmitis, Rhinocladiellamackenziei. Classe de Risco 4 Elevado risco individual e para a comunidade –Incluem patógenos que representam grande ameaça para o ser humano e para os animais, representando grande risco a quem o manipula e tendo grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro. Até o momento, não existem medidas preventivas e de tratamento para esses agentes. Exemplos: Vírus de febres hemorrágicas, Febre Lassa, Machupomammarena vírus, vírus Ebola, Arena vírus e vírus da varíola. Estes critérios de classificação levam em consideração os parâmetros dos agentes biológicos e a patologia em si, como: Patogenicidade Modo de transmissão Estabilidade do agente Capacidade de disseminação Gravidade da infecção Endemicidade Profilaxia terapêutica Cabines de Segurança Biológica As CSB são usadas para minimizar a exposição ao trabalhar com agentes de risco biológico. Muitos agentes de risco biológico requerem o uso de substâncias químicas e radioisótopos em suas análises. A estrutura da CSB pode precisar de modificações, como filtros de carvão, dependendo do volume de substâncias químicas e radioisótopos utilizados, já que filtros HEPA não retêm vapores químicos. Existem três tipos de CSB, cada uma adequada ao nível de risco biológico, com sistemas de exaustão, filtração e laminaridade do fluxo de ar para reter contaminantes microscópicos. 21 Resumo feito por Wanessa Mello É importante lembrarmos que um laboratório de microbiologia clínica exige boas práticas, assim como em um laboratório clínico. Vamos relembrar aqui quais são elas: É expressamente proibido o consumo de bebidas e alimentos, a aplicação de cosméticos e o fumo na área técnica. Em todos os procedimentos, é recomendado prender os cabelos e evitar o uso de bijuterias e maquiagens. É proibido o uso de calçados abertos (chinelos e sandálias). Toda amostra biológica deve ser considerada potencialmente contaminada. É obrigatório o uso de EPI dentro na unidade técnica. É proibido pipetar com a boca. Antes de iniciar a rotina, é obrigatória a descontaminação das bancadas de trabalho antes e após o desenvolvimento das atividades. É proibido reencapar e entortar agulhas após o uso. Nunca processar materiais não identificados. Depositar todo material contaminado em recipientes apropriados para autoclavagem. Higienizar sempre as mãos antes e após os procedimentos. 22 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 2 – Tópico 2: Coleta , Transporte e Conservação de Amostras em Microbiologia Clínica Fases em que uma amostra deve passar: Pré analítica: que envolve preparo do paciente e coleta do material; Analítica: período em que a amostra será processada no laboratório; Pós analítica: validação e liberação dos resultados. Coleta e Transpte de Matiais Biológicos A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o crescimento de outros microrganismos da microbiota (contaminante), induzindo a um tratamento inapropriado. Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um “falso” agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada. O material precisa ser destinado o mais brevemente possível ao laboratório. Amostras inadequadas devem ser devidamente rejeitadas, uma vez que o critério de recebimento implica diretamente na correlação clínico/laboratorial. 23 Resumo feito por Wanessa Mello Como é realizado tal procedimento das principias amostras trabalhadas em um laboratório de microbiologia. São elas: Lesões, Abscessos e Exsudatos Material Genital Fezes Urina Escarro Hemocultura Todas as instruções descritas abaixo estão em conformidade com Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde descrito pela ANVISA. Instruções pa Coleta: Lesões, Absceos e Exsudatos A origem do material precisa ser especificado, por isso, “secreção de ferida” é um termo que não deve ser utilizado, pois o local da coleta deve ser descrito quanto ao sítio anatômico, estas informações são extremamente importantes para o laboratório uma vez que auxilia na interpretação dos resultados. 24 Resumo feito por Wanessa Mello Instruções pa Coleta: Matial Genital Secreção Vaginal: Secreção uretra: Instruções pa Coleta: Fezes As amostras devem ser coletadas no início ou na fase aguda, pois, nesta fase o patógeno está presente em maior número. É importante que a coleta seja realizada antes da antibioticoterapia. Instruções pa Coleta: Urina A amostra deve ser, preferencialmente, a primeira micção do dia. Caso não seja possível, deve-se orientar o paciente a fazer retenção vesical de duas a três horas e só então realizar a coleta. 25 Resumo feito por Wanessa Mello 26 Resumo feito por Wanessa Mello Instruções pa Coleta: Esco 27 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 2 – Tópico 3: Procedimentos Laboratoriais na Microbiologia Clínica Identificação e Proceamento das Amostras A Técnica de coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes (Gram-positivas ou Gram-negativas). No laboratório de microbiologia clínica acontece teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, mas que acaba exigindo a atuação de profissionais capacitados e experientes para sua correta realização e interpretação. Também pode ser utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada. As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram levam em consideração características relacionadas à coloração, ao tamanho, à forma e ao agrupamento das células, sendo as mesmas influenciadas por diversos fatores, como: a idade da cultura, o meiode cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a presença de substâncias inibidoras. Conforme o Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, publicado pela ANVISA (BRASIL, 2004), sua utilização é bastante ampla, porém, podemos destacar algumas das situações mais pertinentes para o emprego da técnica: Bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios sólidos ou líquidos. Análise de amostras de culturas jovens de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas – por fornecerem os melhores resultados. Verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo. Observe que o que precede a técnica do gram é a confecção do esfregaço. Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para indicar as características do agrupamento. Lâminas limpas e novas deverão ser utilizadas de preferência. Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso. Nome e registro do paciente Leito ou ambulatório e especialidade Material colhido Data, hora e quem realizou a coleta 28 Resumo feito por Wanessa Mello Uma vez preparado o esfregaço, o próximo passo é a fixação. Todo o esfregaço, antes de ser submetido a coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando (50 ºC). No entanto, uma fixação excessiva e um superaquecimento irão distorcer a morfologia celular, enquanto uma fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Após a fixação, a lâmina deve esfriar e, em seguida, a etapa de coloração poderá ser iniciada. Em alguns casos, a fixação pode ser feita utilizando o metanol ou etanol. Ela é recomendada quando se tem interesse em preservar algumas estruturas celulares ou quando o método de secagem ao calor não fixa corretamente aquele tipo de amostra. Seguidamente, as lâminas coradas podem ser submetidas à visualização microscópica. Inicialmente, deve ser realizada a inspeção do esfregaço como um todo utilizando objetiva de 10X ou 40X. Em sequência, para verificar a morfologia e coloração bacteriana, usa-se objetiva de 100X em imersão. 29 Resumo feito por Wanessa Mello As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração azul/violeta, enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam vermelha/róseas. A técnica de Gram, apesar de aparente simples, requer uma realização minuciosa de cada passo, uma vez que, se não realizada corretamente, pode levar a erros graves. Se uma bactéria verdadeiramente gram-positiva for caracterizada como gram- negativa, todas as etapas subsequentes de identificação estarão comprometidas. As técnicas morfológicas e de coloração são limitadas e, em muitos casos, não é possível identificar a espécie em questão. A principal forma de contornar essa situação é utilizando técnicas de cultura, que permitem uma avaliação morfológica de colônias e possibilita a realização de provas bioquímicas. Tais métodos ampliam a possibilidade de avaliação e, por conseguinte, permitem uma identificação precisa do microrganismo relacionado. Meios de cultura, ou cultura microbiológica, é um método que permite o crescimento e isolamento de microrganismos através da sua inoculação em preparados especiais, em condições de laboratório. Em geral, os microrganismos são cultivados em recipientes como placas, tubos, frascos. Os meios de cultivo contêm substâncias exigidas pelas bactérias e que são úteis ao seu crescimento e sua multiplicação. Quimicamente, devem conter substâncias que favoreçam a síntese de sua própria matéria nutritiva e devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento. 30 Resumo feito por Wanessa Mello Os principais objetivos na utilização de meios de cultura são: • Crescimento bacteriano. • Isolamento bacteriano. • Estudo da morfologia colonial. • Pesquisa de patogenicidade. • Pesquisa das características bioquímicas. Os meios de cultura utilizados em microbiologia clínica podem ser classificados em duas principais formas: (a) quanto à característica física e (b) quanto à função. 31 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 2 – Tópico 4: Principais Bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas de Importância Médica: Isolamento e Identificação Cocos Gram-Positivos Considerando os cocos gram-positivos (CGP), três gêneros têm importância clínica, uma vez que são encontrados na ampla maioria dos casos. Cocos gram-positivos (Gêneros) Principais espécies Staphylococcus sp. S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. lugdunensis Streptococcus sp. S. pyogenes S. pneumoniae S. agalactiae Streptococcus do grupo viridans Enterococcus sp. E. faecalis E. faecium Microscopicamente são distintos, variando em suas morfologias em estafilococo (“cacho de uva”), estreptococo (“em cadeia longa”) e diplococos (“em dupla”), sendo esse último característico da espécie S. pneumoniaie. A: S. aureus (Morfologia típica de estafilococos em “cacho de uva”); B: S. pneumoniae (Morfologia em diplococos); C: E. faecalis (Morfologia típica de estreptococos “Em fileira”). Imptância Clínica Os Staphylococcus spp. estão entre os agentes mais frequentes nas principiais afecções humanas. De maneira geral, esse gênero é composto por 37 espécies, sendo que 17 delas podem ser isoladas em amostras biológicas humanas. São anaeróbias facultativas e catalase positivas. No entanto, rotineiramente, boa parte dos laboratórios não faz a distinção de todos os membros dos grupos, diferenciando apenas estafilococos coagulase positiva (S. aureus) dos estafilococos coagulase negativa (todos as demais espécies). O Staphylococcus aureus é um agente de variado poder patogênico, que causar desde simples infecções (furúnculos e espinhas) até infecções mais graves (endocardite, septicemia, síndrome do choque tóxico). Possui uma elevada importância na saúde pública, principalmente por ser o responsável por inúmeras infecções relacionadas à Assistência à Saúde. Nas últimas décadas, houve um significativo aumento na prevalência de cepas multirresistentes a alguns antibióticos, como os Staphylococcus aureus Meticilina-Resistentes (MRSA). Essa bactéria chama a atenção frente as outras do grupo pela alta capacidade virulenta. 32 Resumo feito por Wanessa Mello Principais processos infecciosos relacionados ao gênero Staphylococcus spp: Pneumonias Bacteremias Infecções de pele e tecidos moles Infecções relacionadas ao uso de próteses e cateteres venosos Infecções do trato urinário Meningites Bactérias x Doenças As doenças causadas pelo S. aureus são classificadas em dois grupos: (1) Piogênicas localizadas ou “produtoras de pus”, que são caracterizadas por destruição tecidual, provocada por enzimas hidrolíticas e citotoxinas; e (2) Causadas por toxinas, que funcionam como superantígenos que provocam manifestações sistêmicas. 33 Resumo feito por Wanessa Mello Os Streptococcus spp. podem ser classificados por meio de vários critérios – padrão sorológico, padrões hemolíticos e propriedades fisiológicas. No entanto, a mais amplamente utilizada na literatura e na prática clínica é em conformidade com o grau de hemóliseem ágar sangue. Dessa forma, são então classificados em alfa-hemolíticos (α), beta-hemolíticos (β) e gama-hemolíticos (γ). Outra forma de classificá-los foi descrita, segundo Procop et al. (2018), por Rebeca Lancefield, em 1918, e foi baseada na composição antigênica da parede celular dos Streptococcus spp. Conforme essa classificação, eles estão dispostos em 20 grupos sorológicos designados por letras maiúsculas do alfabeto (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V). 34 Resumo feito por Wanessa Mello Entre os Streptococcus spp., as espécies que mais chamam atenção na rotina clínica são o Streptococcus pyogenes, o Streptococcus agalactiae e o Streptococcus pneumoniae. Considerando o S. pyogenes, as doenças causadas por este microrganismo são subdivididas em supurativas (caracterizadas pela formação de pus) e não supurativas. As doenças supurativas variam de faringite a infecções localizadas da pele e de tecidos moles, até fascite necrosante (também conhecida por gangrena estreptocócica hemolítica) e síndrome estreptocócica do choque tóxico. As doenças não supurativas são complicações autoimunes que ocorrem após a faringite estreptocócica (febre reumática e glomerulonefrite aguda) e infecções piodérmicas (apenas lomerulonefrite aguda). Nas doenças não supurativas, anticorpos dirigidos contra proteínas M específicas reagem cruzadamente com tecidos do hospedeiro. As infecções por S. agalactiae são mais comuns em recém-nascidos, adquiridas durante a gestação ou durante o trabalho de parto, e estão associadas a uma alta mortalidade ou sequelas neurológicas importantes (MURRAY et al., 2018). Meningite, pneumonia e sepse neonatal são infecções graves que podem acometer os neonatos nascidos de mães que são colonizadas por esse tipo de estreptococo. O S. pneumoniae (pneumococo) é o membro mais importante dos alfa-hemolíticos porque é uma das causas mais comuns de um espectro de doenças: pneumonia, meningite, otite e sinusite. É importante destacar que o homem é o reservatório e o hospedeiro exclusivo de S. pneumoniae, cujo habitat é o sistema respiratório. Praticamente, todas as pessoas já foram colonizadas por esta bactéria em algum estágio da vida. Uma vez que essa bactéria tem forte relação com a microbiota humana; todas as faixas etárias, gêneros e 35 Resumo feito por Wanessa Mello etnias são susceptíveis às doenças por pneumococo. Entretanto, são altamente vulneráveis os indivíduos com imaturidade ou alguma forma de comprometimento do sistema imunológico, como bebês, crianças e os idosos. Os Enterococcus são bactérias amplamente distribuídas na natureza, fazem parte da microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointestinal. São cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaeróbios facultativos e de catalase negativa. Existem 14 espécies, mas somente duas são clinicamente de maior importância: E. faecalis e E. faecium. A associação deste gênero com endocardite bacteriana é classicamente conhecida. Por outro lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactérias em diversos sítios, causando infecções relacionadas à assistência à saúde, como infecções do trato urinário, infecções da corrente sanguínea e infecções de sítio cirúrgico e intra-abdominais. Infecções por esse gênero chamam bastante atenção devido à frequência de resistência à antimicrobianos. Isolamento e Identificação Os isolamentos dos cocos gram-positivos não apresentam muitas dificuldades, crescem bem em ágares não seletivos, como Ágar sangue de carneiro e Ágar chocolate. Somente em relação aos Streptococcus, algumas cepas requerem meios ricos para o crescimento in vitro e algumas cepas dependem do CO2 para o seu isolamento a partir do material clínico. A diferenciação entre estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que apresentam em meios líquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. No entanto, a identificação baseada somente na morfologia é um tanto arriscada e em muitos casos pode ser duvidosa. Para contornar tal situação, provas bioquímicas são utilizadas a fim de confirmar as etapas de identificação. A principal prova para diferenciar os cocos gram-positivos é a prova da catalase. Com a alça bacteriológica ou com um palito, coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lâmina de vidro. Em seguida, coloca-se sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observa-se se há formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos), a prova é geralmente positiva, enquanto que para a família Streptococcacea (estreptococos), é negativa. 36 Resumo feito por Wanessa Mello 37 Resumo feito por Wanessa Mello Bacilos Gram-Negativos Fmentades-Entobactiaceae Neste subitem, iremos abordar a maior família de bactérias clinicamente importantes. Este grupo heterogêneo compreende microrganismos responsáveis por praticamente todos os tipos de infecções que são observadas na prática clínica. As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae são microrganismos ubiquitários encontrados em diversos ambientes, como no solo, na água e na vegetação. Elas fazem parte da microbiota normal da maioria dos animais, incluindo o homem. Atualmente, essa família é composta por cerca de 51 gêneros e 279 espécies, sendo destes, 26 gêneros causadores de infecções humanas. No entanto, menos de 20 espécies são responsáveis por 95% das infecções em humanos. Sua importância clínica está fundamentada na sua representatividade em mais de 80% de todos os bacilos Gram-negativos de importância médica isolados na rotina microbiológica, sendo seu isolamento possível em qualquer amostra clínica. São agentes causais de infecções hospitalares e na comunidade. Uma boa parte de suas espécies são patogênicas ao homem, causando diarreias, infecções geniturinárias, infecções respiratórias e em feridas e queimaduras. Cerca de 70% das infecções urinárias e de 50% das septicemias são causadas por suas espécies. Algumas são consideradas enteropatogênicas por causarem infecções no Trato Gastrointestinal (TGI), ocorrendo transmissão através de água e alimentos contaminados (Salmonella sp., Shigella sp., E. coli e Yersiniaenterocolitica). Cactísticas da Família Entobactiaceae Os bacilos gram-negativos não esporulados apresentam motilidade variável, oxidase negativos e crescem em meios básicos (caldo peptona), meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED) e meios seletivos (Mac Conkey, EMB). São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos e reduzem nitrato a nitrito. Umas das características mais importante das bactérias gram-negativas é a presença de uma endotoxina que compõe a parede celular desses microrganismos, sendo o protagonista de uma manifestação clínica potencialmente letal: o choque endotóxico. A endotoxina é um lipopolissacarídio (LPS) farmacologicamente ativo, 38 Resumo feito por Wanessa Mello contido na parede celular das espécies gram-negativas. Os efeitos biológicos das endotoxinas foram demonstrados experimentalmente: quantidades pequenas injetadas por via intravenosa nos animais causam febre, leucope nia, hemorragia capilar, hipotensão e colapso circulatório – sinais e sintomas que, em grande parte, são praticamente iguais aos observados nos seres humanos com sepse gram-negativa. O LPS também tem importância laboratorial uma vez que tem função antigênica e varia entre as diferentes espécies no polissacarídeo O. Outros antígenos amplamente empregados são o antígeno capsular (K) e as proteínas flagelares (H). Em cerca de 99% dos isolados relativos a enterobactérias de importância clínica, podemos encontrar em ordem de probabilidade a: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providenciaspp.,Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. Porém em casos atípicos podemos observar também a presença das espécies: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. Essa família tem muita relevância clínica devido aos seus fatores de virulência. Imptância Clínica Escherichia coli E. coli é o mais comum e importante membro das enterobactérias, uma vez que está associada a maior parte das infecções por membros dessa família, incluindo gastroenterite e infecções extraintestinais, como infecções do trato urinário, meningites e sepses. Uma variedade de cepas pode causar doenças, sendo alguns sorotipos associados à maior virulência (ex.: E. coli O157 é a causa mais comum de colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica). Uma variedade de fatores de virulência está associada a E. coli, sendo adesinas e exotoxinas as que estão presentes nas cepas mais virulentas, ocasionando as doenças clinicas mais comuns dessa espécie: as gastroenterites e as infecções do trato urinário. 39 Resumo feito por Wanessa Mello 40 Resumo feito por Wanessa Mello Klebisiella pneumoniae A espécie mais importante do gênero Klebsiella é a K. pneumoniae, que é uma autora bem conhecida de pneumonia. Bactérias desse gênero apresentam, em sua superfície, uma cápsula mucoide bem evidente (bacilos grandes envolvidos em uma cápsula abundante), o que torna sua identificação pela coloração de Gram e por cultura relativamente fácil. As bactérias desse gênero causam pneumonia, adquirida tanto na comunidade quanto no ambiente hospitalar, com destruição de espaços alveolares, formação de cavidades e marcada porprodução de escarro contendo sangue. Ademais, podem provocar infecções no trato urinário, sepse, artrites e enterites. Fazem parte da microbiota, podendo colonizar a pele, o TGI e a nasofaringe dos seres humanos. 41 Resumo feito por Wanessa Mello Proteusmirabilis O membro mais comum do gênero Proteusé o P. mirabilis, constituinte do microbioma humano (TGI), é causa importante de infecção do trato urinário em adultos normalmente saudáveis. O P. mirabilis produz grande quantidade de urease, uma enzima que quebra a ureia em dióxido de carbono e amônia. Esse processo aumenta o pH da urina, produzindo magnésio e cálcio na forma de cristais de estruvita e apatita, respectivamente, levando à formação de cálculos renais. Outras bactérias que infectam o trato urinário e produzem urease que podem causar o mesmo efeito são os Staphylococcus saprophyticus. Salmonella spp. São descritos mais de 2.500 sorotipos de Salmonella, geralmente considerados como espécies individuais, sendo que as mais comuns são: Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis e Salmonella typhi-murium. As espécies de Salmonella podem colonizar todos os animais, particularmente as aves, e são capazes de provocar doenças em vários hospedeiros, incluindo o ser humano. Seu habitat natural pode ser dividido em três categorias: altamente adaptadas ao homem (S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C), altamente adaptadas aos animais (S. Dublin – bovinos, S. Choleraesuis – suínos) e salmonelas zoonóticas (responsáveis por surtos frequentes em diversas partes do mundo, sendo os alimentos seu principal veículo de transmissão). As principais doenças clínicas humanas são a gastroenterite, sepse, infecções no sistema nervoso central e febre entérica, além das infecções assintomáticas. A S. typhi é um patógeno exclusivamente de humanos, que pode causar doenças graves e sobreviver na vesícula biliar, estabelecendo-se o estado de portador crônico. 42 Resumo feito por Wanessa Mello Shigella spp. As espécies do gênero Shigella são, na realidade, variantes bioquímicas (biogrupos) de E. coli; entretanto, mantém-se em um gênero separado por razões históricas. Provavelmente é mais fácil imaginar as Shigella como variantes de E. coli Enteroinvasora (EIEC) e a produtora da toxina shiga (STEC). São conhecidas quatro espécies de Shigella, sendo que a Shigellasonnei é responsável pela grande maioria das infecções em países desenvolvidos, enquanto que a Shigellaflexneri predomina em países em desenvolvimento. O homem é o reservatório primário das shigellas. Sua transmissão é por via fecal- oral, principalmente através de água e alimentos contaminados. Sua maior incidência é em países em desenvolvimento, principalmente por conta das condições precárias de saneamento. Em países desenvolvidos podem acontecer surtos esporádicos. Comumente, 10 a 20% das doenças entéricas e 50% das diarreias com sangue ou disentéricas, em crianças menores de cinco anos, são causadas pela Shigella spp. 43 Resumo feito por Wanessa Mello Isolamento e Identificação As Enterobactérias, já detalhadas anteriormente, é um grupo bastante amplo de gêneros e espécies, logo, a sua identificação é relativamente extensa e depende de variadas provas bioquímicas. Iremos discutir aqui algumas das alternativas utilizadas na rotina, seja na triagem ou na identificação presuntiva. O esquema inicial para identificação de Bacilos Gram-negativos abaixo. Como via de regra, a principal prova para a diferenciação desses microrganismos é em relação à 44 Resumo feito por Wanessa Mello capacidade de fermentar glicose. Existem várias formas de verificar essa característica química, que vai desde da utilização do Caldo OF até a utilização do Caldo TSI. Uma vez identificado a capacidade de fermentação, o próximo passo é a realização da prova da oxidase (discutida adiante). Enterobactérias são fermentadoras e oxidase negativas. Bacilos Gram-Negativos Não Fmentades Os bacilos Gram-negativos não fermentadores são patógenos oportunistas de plantas, animais e humanos. São aeróbios, não esporulados e se caracterizam por serem inábeis na utilização de carboidrato como fonte de energia mediante da fermentação. Todos eram originalmente incluídos no gênero Pseudomonas, com base na incapacidade de fermentar carboidratos e na morfologia das células bacterianas – pequenos bacilos geralmente agrupados em pares. As Pseudomonas foram divididas, com o acréscimo de novos gêneros, dentre os quais a Burkholderia e a Stenotrophomonas são os patógenos humanos mais comuns. Membros desses gêneros são encontrados no solo, na matéria orgânica em decomposição e água, assim como em áreas úmidas do ambiente hospitalar. Essas bactérias podem utilizar vários compostos orgânicos como fonte de carbono e nitrogênio, de modo que elas podem sobreviver e replicar em ambientes onde a disponibilidade de nutrientes é reduzida. Essas bactérias, em particular, as Pseudomonas, produzem uma variedade impressionante de fatores de virulência e todas são resistentes aos antibióticos mais frequentemente utilizados. Não chega a surpreender o fato de essas bactérias serem patógenos oportunistas em pacientes hospitalizados. Sua identificação laboratorial apresenta-se como um grande desafio até mesmo para os microbiologistas mais experientes. Isso se deve ao fato da complexidade dos testes utilizados, do elevado custo que os kits completos possuem, além de possuírem baixa incidência em amostras clínicas. Cabe destacar que muitos laboratórios de microbiologia não realizam a sua identificação. 45 Resumo feito por Wanessa Mello Imptância Clínica Pseudomonas aeruginosa Esta bactéria corresponde ao bacilo Gram-negativo mais frequentemente associado a infecções oportunistas em pacientes hospitalizados. A P. aeruginosa produz vários tipos de adesinas, toxinas e enzimas capazes de destruir tecidos, de modo que seja surpreendente o fato desta bactéria não causar doenças, mas que tais doenças sejam mais comuns no ambiente hospitalar. Uma explicação para isto é o fato de os fatores de virulência da bactéria não serem suficientes para causar doença (a suscetibilidade do hospedeiro e a probabilidadede contato com a bactéria é o que definem o risco de se adquirir a doença). 46 Resumo feito por Wanessa Mello Burkholderiacepacia B. cepacia é um complexo de várias espécies estreitamente relacionadas, que colonizam e causam doenças em determinados grupos de pacientes: portadores de fibrose cística, pacientes com doença granulomatosa crônica (DGC – uma imunodeficiência primária na qual os leucócitos têm deficiência na capacidade de eliminação de microrganismos intracelulares), ou cateteres vasculares ou do trato urinário. Diferentemente da P. aeruginosa, a B. cepacia apresenta relativamente poucos fatores de virulência. Stenotrophomonas maltophilia Do mesmo modo que a B. cepacia, a S. maltophilia é um patógeno oportunista de pacientes imunossuprimidos. 47 Resumo feito por Wanessa Mello Isolamento e Identificação As provas para identificação de Bacilos Gram-negativos não fermentadores, assim como as enterobactérias, exigem uma sequência de provas bioquímicas. Constatada a presença de incapacidade de fermentar glicose, seguimos para a prova da oxidase. Essa prova é crucial para diferenciar os bacilos não fermentadores, pois a maioria deles é oxidase positiva, enquanto as Enterobacteriaceae são oxidase negativas. 48 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 3 – Tópico 1: Micobactérias O gênero Mycobacterium sp. é constituído por espécies como M. tuberculosis, M. leprae, e outras denominadas micobactérias não causadoras de tuberculose. Focaremos esse tópico na espécie M. tuberculosis causadora da tuberculose. Imptância Clínica das Micobactérias Dados sobre Tuberculose (TB): TB é a doença infecciosa que mais mata no mundo, superando a AIDS. Coincidência de 10% dos casos de TB em pacientes com AIDS. Em 2016, estimativa de 10,6 milhões de casos, com 87% concentrados em 30 países. TB no Brasil: Tendência de redução da incidência na última década. Entre 2016 e 2017, cerca de 69 mil novos casos e 4.500 óbitos. Brasil está entre os 30 países com alta ocorrência de TB, segundo a OMS. Coinfecção TB-HIV e multirresistência não são alarmantes em relação ao total de casos. Bactérias Álcool-Ácido Resistentes: Doenças causadas por essas bactérias resultam da resposta imune do hospedeiro. Importância clínica de cinco gêneros: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordonia e Tsukamurella. Mecanismo de Infecção pelo M. tuberculosis: Transmissão interpessoal por aerossóis infecciosos. Patógeno intracelular que pode causar infecção persistente. Relação delicada entre crescimento bacteriano e controle imunológico do hospedeiro. Interação do M. tuberculosis com o Hospedeiro: M. tuberculosis entra pelas vias respiratórias e é fagocitado por macrófagos alveolares. Bactérias evitam a morte pelos macrófagos, que secretam citocinas IL-12 e TNF-α. Essas citocinas recrutam células T e natural-killer, ativando macrófagos e estimulando a morte intracelular. Formação de Granulomas: Agrupamento de células necróticas (granuloma) contém a infecção. Permite a sobrevivência de algumas bactérias, que podem causar doença posteriormente quando a resposta imune falha. 49 Resumo feito por Wanessa Mello Identificação e Isolamento das Micobactérias O diagnóstico da TB envolve avaliação clínica pelo médico. Deve ser baseado em métodos que forneçam informações essenciais. Essas informações são cruciais pra o adequado encaminhamento do tratamento ao paciente. Baciloscopia de Esco Realizar baciloscopia em duas amostras de escarro, uma no primeiro momento e outra no dia seguinte, preferencialmente ao despertar. Se ambas forem negativas, amostras adicionais podem ser solicitadas. Essencial para diagnóstico e controle do tratamento da TB. O diagnóstico de TB pulmonar sem baciloscopia não é aceitável, exceto em crianças. O método de coloração utilizado no Brasil é o de Ziehl-Neelsen, que é de baixo custo. A sensibilidade da baciloscopia é superior a 80% na primeira amostra, aumentando em 12% com a segunda. O exame a juda a identificar casos bacilíferos, recomendando a coleta de pelo menos duas amostras. Indicações para Baciloscopia: Sintomáticos respiratórios durante busca ativa. Suspeita clínica/radiológica de TB pulmonar, independentemente do tempo de tosse. Acompanhamento e controle de cura em casos pulmonares confirmados. Limitações: Sensibilidade e especificidade não são 100%. Falsos positivos podem ocorrer devido a outras micobactérias ou bactérias como Nocardia sp. e Rhodococcus equi. Resultados baseados na quantidade de bacilos encontrados: Negativo: nenhum bacilo em 100 campos. Positivo +: 10 a 99 BAAR em 100 campos. Positivo ++: 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos. Positivo +++: mais de 10 BAAR por campo em 20 campos. Cultura pa Micobactérias Existem diversos meios de cultura na microbiologia clínica para o crescimento de micobactérias. O meio de cultura mais utilizado no Brasil e aprovado pela OMS é o de Löwenstein- Jensen. 50 Resumo feito por Wanessa Mello Indicações de Cultura para Micobactérias: 1. Casos Suspeitos de TB Pulmonar: Quando o exame direto é persistentemente negativo. 2. Diagnóstico de Formas Extrapulmonares: Inclui meningoencefálica, renal, pleural, óssea ou ganglionar. 3. Suspeita de Resistência Micobacteriana: Seguir com o Teste de Sensibilidade (TS). 4. Tecido e Cavidades com Baciloscopia Rara ou Ausente: Solicitar cultura em urina, líquidos cavitários (pleural, pericárdico, peritoneal e líquor) e secreções não pulmonares. Meios Líquidos de Cultura: Estão se tornando mais frequentes, apesar do custo mais alto em comparação ao Löwenstein-Jensen. Eles oferecem crescimento mais rápido (média de 15 dias) em comparação aos 60 dias do meio tradicional. Amostras de Urina: Em suspeita de TB de vias urinárias, solicitar pelo menos cinco amostras em dias alternados, utilizando toda a urina da manhã para baciloscopia e cultura após centrifugação. Teste Molecul Rápido pa Tubculose (GeneXpt®) Implantação: Em 2014, o Ministério da Saúde introduziu o teste rápido GeneXpert® em várias cidades. Funcionamento: Utiliza escarro do paciente para identificar a micobactéria com sensibilidade de 90%. Tipo de Teste: É um teste de amplificação de ácidos nucleicos que detecta o DNA do M. tuberculosis. Resistência à Rifampicina: O teste também indica se o bacilo é resistente à rifampicina, com sensibilidade de 90%. Objetivo: Facilitar o diagnóstico, especialmente em áreas com dificuldades técnicas para baciloscopia tradicional. Indicações: Prioritariamente para diagnóstico de tuberculose laríngea e pulmonar em adultos e adolescentes; sensibilidade em crianças é de 66%, limitando seu uso nessa faixa etária. Limitações: Não deve ser usado para retratamento, pois pode detectar bacilos mortos ou inviáveis; recomendado para infecções primárias. Amostras Utilizáveis: Pode ser aplicado em escarro, lavado broncoalveolar e líquor. Uso no Brasil: O teste molecular é amplamente utilizado como suporte no diagnóstico da forma pulmonar, especialmente em locais com poucos técnicos treinados. 51 Resumo feito por Wanessa Mello Unidade 3 – Tópico 2: Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) e Antibióticos Princípios pa a Realização do TSA Material Necessário: Para a técnica, é preciso ter cultura pura de microrganismos isolados. Definição de Cultura Pura: É aquela em que se observa apenas um tipo de microrganismo em crescimento na placa. Cultura Recente: As culturas devem ser novas ou jovens, coletadas e semeadas em meio de cultura. Incubação: Após a semeadura, as culturas são incubadas, e o crescimento ocorre em um período de 18 a 24 horas,