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PARASITOLOGIA CLÍNICA AULA 2 Profª Larissa Barbosa de Paula 2 CONVERSA INICIAL Dentre os protozoários que compõem o Sub-reino Protozoa, o Filo Sarcomastigophora – Subfilo Sarcodina inclui as amebas patogênicas e não patogênicas. Nesta etapa, você conhecerá as principais espécies ameboides de importância clínica para humanos: Entamoeba spp., Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii, Naegleria fowleri e Acanthamoeba spp. Para compreender o assunto e atingir as competências e objetivos do estudo, vamos analisar uma situação hipotética que se aproxima dos conteúdos teóricos abordados ao longo da etapa: “Pedro, 11 anos de idade, compareceu à emergência queixando-se de febre, vômito e estado mental alterado. Durante a anamnese, declarou estar se sentindo bem até dois dias antes, quando passou a apresentar cefaleia e fotofobia, e contou que havia nadado em um rio local há 5 dias. Uma tentativa de punção lombar foi realizada, porém sem sucesso devido à intensa agitação do paciente. Suspeitando de meningite, o médico plantonista administrou antibióticos e transferiu Pedro para a unidade de tratamento intensivo; porém, durante o trajeto, o paciente sofreu uma convulsão, com espasmos do lado direito. O hemograma revelou contagem de leucócitos aumentada, com predomínio de neutrófilos segmentados. A nova tentativa de punção lombar demonstrou um fluido amarelado semelhante a pus e os níveis de proteínas, leucócitos e eritrócitos do líquido cefalorraquidiano (LCR) encontravam-se aumentados, contrariamente aos níveis de glicose. A análise microscópica de uma preparação úmida do LCR revelou a presença de trofozoítos móveis. Três dias após sua admissão no hospital, Pedro entrou em coma e não retomou a consciência, indo à óbito dois dias depois”. A principal característica que diferencia as amebas dos demais grupos de protozoários é a forma de locomoção, através da extensão de seu citoplasma formando pseudópodes. Basicamente existem duas formas morfológicas no ciclo biológico amebiano: a) trofozoíto, que se alimenta, se multiplica e forma os pseudópodes; e b) cisto, que não se alimenta e é caracterizado por uma membrana espessa que protege o parasito de condições ambientais desfavoráveis – sendo semelhantes os ciclos biológicos de todas as amebas intestinais. O modo de transmissão para o ser humano mais comum é através da ingestão de cisto infectante em água e/ou alimentos contaminados; o qual se converte morfologicamente em trofozoíto (excistamento) na região ileocecal 3 intestinal. Já a conversão de trofozoíto em cisto (encistamento) também ocorre no intestino, quando o ambiente deixa de ser propício para a multiplicação do trofozoíto. Os cistos apresentam uma parede celular protetora, denominada parede cística, que viabiliza a chegada destes ao ambiente externo juntamente com as fezes; possibilitando, também, sua viabilidade durante longos períodos (Aziz; Zeibig, 2014). TEMA 1 – ENTAMOEBA SPP. As espécies pertencentes ao gênero Entamoeba são classificadas em quatro grupos, conforme a quantidade de núcleos presentes nos cistos ou a ausência / desconhecimento dessa forma parasitária: • Cistos contendo oito núcleos ou grupo coli – E. coli (humanos), E. muris (roedores) e E. gallinarum (aves domésticas) • Cistos contendo quatro núcleos ou grupo histolytica – E. histolytica (humanos), E. dispar (humanos), E. ranarum (sapos e rãs), E. invadens (cobras e répteis) e E. moshkoviskii (vida livre) • Cistos contendo apenas um núcleo – E. polecki (porcos, macacos e humanos, eventualmente) e E. suis (porcos) • Cistos desconhecidos ou ausentes – E. gingivalis (humanos e macacos) (Silva; Gomes, 2016). Infecções por Entamoeba histolytica ocorrem em cerca de 10% da população mundial, sendo considerada uma das principais causas de morte por infecção parasitária; atrás apenas da malária e da esquistossomose. Além da ingestão de água e/ou alimentos contaminados, os cistos podem ser transmitidos sexualmente ou através de vetores mecânicos como moscas e baratas. Linhagens invasivas e não invasivas podem ser diferenciadas por eletroforese de isoenzimas e análise dos zimodemas ou padrões de isoenzimas; porém, não são testes úteis na rotina laboratorial. Em 1977, a OMS assumiu ser a E. dispar responsável pela maioria das infecções assintomáticas atribuídas à E. histolytica; entretanto, foram detectados casos de amebíase sintomática (colite não disentérica) produzidos pela E. dispar e com ausência de invasão da mucosa, constituindo um forte indício de que esta ameba não produz doença como a E. histolytica. Mesmo com a existência de E. dispar, a amebíase (sintomática ou não) continua sendo uma infecção atribuída à E. histolytica. 4 Outra espécie com morfologia também indistinguível de E. histolytica, a E. moshkovskii é considerada uma ameba de vida livre e infecta os seres humanos ocasionalmente. Sendo assim, torna-se necessário o desenvolvimento e o emprego de técnicas sensíveis, específicas e de baixo custo para o diagnóstico diferencial entre E. histolytica, E. dispar e E. moshkovskii (Silva; Gomes, 2016; Aziz; Zeibig, 2014). E. histolytica constitui a única ameba intestinal patogênica; podendo causar infecção assintomática, amebíase intestinal sintomática ou amebíase extraintestinal sintomática (abscesso hepático e disseminação através do diafragma, causando pneumonia amebiana). Escolha do fármaco, posologia e duração do tratamento dependem da localização, da intensidade da infecção e da idade do paciente. Segundo o Plano Nacional de Vigilância e Controle das Enteroparasitoses, elaborado pela Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, as drogas de primeira escolha são tinidazol ou secnidazol ou metronidazol; e as de segunda escolha são tetraciclina ou paramomicina + furoato de diloxanida ou cloroquina + furoato de diloxanida ou nimorazol – iodoquinol podendo substituir o furoato de diloxanida (Aziz; Zeibig, 2014). Alguns fatores relacionados aos hospedeiros – região geográfica, sexo, idade, resposta imunológica, dieta, estado nutricional, alcoolismo e hábitos sexuais – parecem contribuir para a virulência da E. histolytica, transformando-a de comensal para invasora e elevando seu potencial patogênico. A evolução da patogenia se dá após trofozoítos infectantes invadirem os tecidos, por mecanismos ainda não totalmente elucidados. A hipótese mais discutida aponta para um efeito letal diretamente sobre as células através da forte adesão das amebas (mediada por lectinas presentes em sua superfície e auxiliadas por formações filopódicas que ampliam a adesão), seguida pela fagocitose; primeiramente em regiões intraglandulares, pela certa dificuldade de invasão na mucosa intestinal intacta (Silva; Gomes, 2016). Os trofozoítos de E. histolytica apresentam tamanho médio entre 12 e 25 µm, e citoplasma finamente granular aparentando vidro fosco. A presença de eritrócitos no citoplasma constitui um achado exclusivo da doença, já que se trata da única ameba intestinal com essa característica. Os cistos são arredondados a esféricos, com tamanho médio entre 12 a 18 µm, apresentam uma parede cística hialina que auxilia em sua identificação e de um a quatro núcleos facilmente identificáveis (Figura 1) (Aziz; Zeibig, 2014). 5 Figura 1 – Trofozoíto com eritrócito ingerido (esquerda) e cisto (direita) de Entamoeba histolytica Fonte: CDC. Amebiasis. A prevalência da infecção por Entamoeba hartmanni é semelhante à epidemiologia das infecções por E. histolytica, assim como as maneiras pelas quais a água e/ou os alimentos se tornam contaminados por cistos infectados na transmissão do parasito. Entretanto, as infecções por E. hartmanni são tipicamente assintomáticas e, portanto, essa ameba costuma ser considerada não patogênica e o tratamento,normalmente não indicado. Medidas de prevenção contra esse tipo de amebíase incluem boas práticas de higiene pessoal e boas condições de saneamento, além de proteção dos alimentos contra moscas e baratas (Aziz; Zeibig, 2014). Além de diferenças na sorologia, a principal distinção entre E. histolytica e E. hartmanni ocorre pelo tamanho médio apresentado pelos trofozoítos e cistos, menores nesta espécie: os trofozoítos geralmente medem entre 5 e 15 µm, enquanto que os cistos apresentam média de 7 a 9 µm de diâmetro. O citoplasma dos trofozoítos é finamente granular e pode conter bactérias; mas não apresenta eritrócitos fagocitados, como em E. histolytica. Os cistos também podem apresentar de um a quatro núcleos, sendo menores que o núcleo único das formas trofozoíticas e se desenvolvendo igualmente aos cistos de E. histolytica (Figura 2) (Aziz; Zeibig, 2014). 6 Figura 2 – Trofozoíto (esquerda) e cisto (direita) de E. hartmanni Fonte: CDC. Intestinal (non-pathogenic) amebae. Outra amebíase geralmente assintomática e, portanto, para a qual o tratamento costuma não ser indicado, é a causada por Entamoeba coli, ameba não patogênica encontrada mundialmente, em climas quentes ou frios; apresentando maior risco de se tornar endêmica em regiões com precárias condições de higiene e pobres em práticas sanitárias. Assim como nas amebíases anteriores, a transmissão ocorre pela ingestão de cistos infectantes em água e/ou alimentos contaminados e, dentre as medidas de prevenção e controle, destaca-se o adequado descarte de fezes humanas e as boas práticas de higiene pessoal; além da proteção de alimentos e bebidas contra moscas e baratas (Aziz; Zeibig, 2014). Em média, os trofozoítos dessa espécie medem entre 18 e 27 µm, embora alguns alcancem a marca dos 55 µm; apresentando evidentes pseudópodes, motilidade lenta e não progressiva, e citoplasma grosseiramente granulado, geralmente demonstrando vacúolos contendo bactérias e ausência de inclusões de eritrócitos. Os cistos possuem, em média, de 12 a 25 µm de diâmetro, parede celular espessa e um a oito núcleos facilmente identificáveis em preparações coradas e não coradas (Figura 3) (Aziz; Zeibig, 2014). 7 Figura 3 – Trofozoíto (esquerda) e cisto (direita) de E. coli Fonte: CDC. Intestinal (non-pathogenic) amebae. Com menor incidência epidemiológica, as infecções por Entamoeba polecki são raras e ocorrem em apenas algumas regiões do mundo; destacando-se Papua, Nova Guiné e alguns casos isolados no Sudeste Asiático, França e Estados Unidos – no qual todos os casos documentados ocorreram em refugiados provenientes do Sudeste Asiático. Durante muitos anos considerada ameba primariamente de suínos e primatas, as principais rotas de transmissão são de humanos para humanos e de suínos para humanos. Em pacientes sintomáticos, o único desconforto relatado é diarreia; sendo o tratamento, para essas ocasiões, a administração de metronidazol sozinho ou associado ao furoato de diloxanida (Aziz; Zeibig, 2014). Diferentemente das amebas até então estudadas, exceto pela igual ausência de patogenicidade, Entamoeba gingivalis, a primeira espécie ameboide detectada em seres humanos em 1849, infecta boca e trato genital silenciosamente; com maior frequência acometendo pacientes apresentando piorreia alveolar, em sua forma trofozoítica. A E. gingivalis é detectada nos raspados orais de todos os indivíduos cujos exames buscam a presença da ameba, contraída via contato oral-oral e contaminação de perdigotos transmitidos através de utensílios para bebida contaminados. Além da área gengival, o parasito pode ser encontrado em criptas tonsilares, abcessos pulmonares, escarro e amostras cervicovaginais (Aziz; Zeibig, 2014). 8 TEMA 2 – ENDOLIMAX NANA Encontrada principalmente em climas quentes e úmidos ou em regiões com precárias condições sanitárias e de higiene, E. nana constitui mais um exemplo de ameba não patogênica cuja infecção não é tratada por ser assintomática, e cujos meios de transmissão e as medidas de prevenção e controle seguem o padrão das demais espécies ameboides estudadas. As formas trofozoíticas são pequenas (média de 7 a 10 µm), com motilidade vagarosa e não progressiva; citoplasma granular vacuolizado, geralmente contendo bactérias e ausência de cromatina periférica: característica-chave para identificação do parasito. Os cistos, contendo tamanho médio igual ao dos trofozoítos, podem apresentar de um a quatro núcleos; mas são mais frequentemente observadas formas císticas maduras tetranucleadas (Figura 4) (Aziz; Zeibig, 2014). Figura 4 – Trofozoíto vacuolizado (esquerda) e cisto tetranucleado(direita) de Endolimax nana Fonte: CDC. Intestinal (non-pathogenic) amebae. TEMA 3 – IODAMOEBA BÜTSCHLII Infecções por Iodamoeba bütschlii são muito menos frequentes que as amebíases por E. coli e E. nana; apresentando maior prevalência em regiões tropicais do que em regiões temperadas e sendo considerada não patogênica por comumente não ocasionar sintomas clínicos; não havendo, portanto, 9 indicação para tratamento. As vias de transmissão e as medidas de prevenção e controle são as mesmas já apresentadas para as demais espécies, e o termo Iodamoeba deve-se à sua muito boa coloração pelo iodo. Trofozoítos de I. bütschlii variam de 8 a 22 µm, exibindo motilidade lenta e progressiva; e citoplasma grosseiramente granular e vacuolizado, podendo conter bactérias, leveduras ou outros detritos. Os cistos apresentam apenas um núcleo e o tamanho médio gira em torno de 8 a 12 µm; em formatos ovoides, elipsoides, triangulares ou outros. Uma característica morfológica típica desses cistos e que auxilia no diagnóstico da infecção é a presença de um vacúolo de glicogênio bem definido, com bordas igualmente definidas (Figura 5) (Aziz; Zeibig, 2014). Figura 5 – Trofozoíto (esquerda) e cisto contendo vacúolo de glicogênio (direita) de Iodamoeba bütschlii Fonte: CDC. Intestinal (non-pathogenic) amebae. TEMA 4 – NAEGLERIA FOWLERI Agente etiológico da meningoencefalite amebiana primária e única espécie ameboide com três formas (trofozoítos ameboides, formas flageladas e cistos), a Naegleria fowleri é encontrada principalmente em águas quentes e capaz de se multiplicar em temperaturas de até 45ºC; tendo, portanto, maior prevalência no verão. Medidas de prevenção e controle contra a disseminação parasitária incluem sinalização proibindo contato com a água em fontes conhecidamente contaminadas e cloração da água em piscinas e banheiras de hidromassagem; além do reparo imediato de rachaduras em paredes de piscinas 10 e banheiras, evitando o desenvolvimento de uma possível fonte de contaminação (Neves; Costa, 2016; Aziz; Zeibig, 2014). A patogenia da doença parece ocorrer via penetração amebiana pela mucosa nasal, atravessando a placa cribiforme e percorrendo o nervo olfatório até atingir o encéfalo. Pacientes cuja infecção é resultado da colonização amebiana nas fossas nasais geralmente são assintomáticos. Quando trofozoítos ameboides invadem tecidos cerebrais e causam a rápida destruição destes, os pacientes podem apresentar cefaleia, febre, dor de garganta, náuseas e vômitos; além de sintomas meningíticos que evoluem rapidamente, incluindo convulsões e rigidez da nuca. Frequentemente também apresentam alterações no olfato e paladar, congestão nasal e sinal de Kernig (sintoma típico de meningite, em que o paciente não é capaz de esticar completamente a perna caso o quadril esteja em flexão 90º). Pacientes não tratados costumam ir a óbito três a seis dias após início dos sintomas; para os quais o melhor tratamento é a rápida e agressiva terapia com anfotericina B, apesar da toxicidade – em casos raros, a anfotericina B pode ser associada à rifampicina ou miconazol (Neves; Costa, 2016; Aziz; Zeibig, 2014).O primeiro caso de meningoencefalite amebiana primária (MAP) foi relatado na Austrália por Carter e Fowleri em 1965. Uma espécie que poderá infectar humanos em um futuro próximo é a Naegleria australiensis, predominante na Ásia, Austrália, Europa e Estados Unidos; cuja patogenicidade já foi estudada em camundongos expostos ao parasito por instilação intranasal (Aziz; Zeibig, 2014). A detecção das formas trofozoíticas ameboides se dá pela análise microscópica do líquido cefalorraquidiano, podendo também ser analisadas amostras de tecidos e secreção nasal. Nos últimos anos, as técnicas como PCR, teste com anticorpos monoclonais, citometria de fluxo e hibridização de DNA vêm sendo utilizadas para classificar, identificar e determinar as espécies de Naegleria; além de estudos envolvendo polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição de DNA (RFLP), para classificação taxonômica (Neves; Costa, 2016; Aziz; Zeibig, 2014). A forma de trofozoíto ameboide é alongada, com 8 a 22 µm de comprimento, extremidade anterior geralmente alargada e posterior afinada; a motilidade é lenta e o citoplasma é granular, frequentemente contendo vacúolos (Figura 6). A forma flagelada é piriforme, com 7 a 15 µm de comprimento, 11 contendo duas estruturas em formato de chicote (flagelos) que auxiliam na locomoção irregular ou giratória do parasito e citoplasma igual ao dos trofozoítos ameboides (Figura 6). Já os cistos normalmente são arredondados, medindo entre 9 e 12 µm, apresentam apenas um núcleo, citoplasma granular frequentemente contendo vacúolos e uma espessa parede celular, conforme demonstrado na Figura 7 (Aziz; Zeibig, 2014). Figura 6 – Trofozoíto ameboide e forma flagelada de N. fowleri Fonte: CDC. Free living amebic infections. Figura 7 – Cisto de N. fowleri Fonte: CDC. Free living amebic infections 12 TEMA 5 – ACANTHAMOEBA SPP. Infecções no sistema nervoso central (principalmente em pacientes imunocomprometidos) e nos olhos (especialmente em usuários de lentes de contato gelatinosas) por espécies de Acanthamoeba já foram relatados em muitos países. Com um ciclo biológico ainda pouco conhecido, medidas de prevenção e controle contra as infecções oculares incluem, principalmente, seguir os protocolos de higiene das lentes de contato preconizados pelos fabricantes; uma vez que práticas inadequadas, como a utilização de soluções salinas não estéreis, são o principal fator de risco para a ocorrência dessas infecções (Neves; Costa, 2016; Aziz; Zeibig, 2014). Quando a infecção ocorre no sistema nervoso central, conhecida por encefalite amebiana granulomatosa (EAG), os sintomas se desenvolvem vagarosamente ao longo do tempo e incluem cefaleia, náuseas, vômitos, convulsões e rigidez da nuca; podendo ser detectados trofozoítos ou cistos. Ocasionalmente, espécies de Acanthamoeba infectam outros órgãos e tecidos como rins, pâncreas, próstata, útero e pele, formando lesões granulomatosas similares às cerebrais. Quando nos olhos, a infecção é conhecida por ceratite amebiana e os sintomas incluem intensa dor local e dificuldades visuais; os quais podem evoluir para perfuração da córnea e cegueira. A maior parte dos pacientes com EAG vão à óbito antes da conclusão diagnóstica, em virtude da lenta progressão da doença, ou antes que um tratamento possa ser testado – sendo um dos métodos mais utilizados a terapia com sulfametazina. Os casos de ceratite têm obtido êxito com diversos fármacos como itraconazol, cetoconazol, miconazol, rifampicina e, principalmente, isotianato de propamidina; quando administrados imediatamente após o diagnóstico da infecção (Neves; Costa, 2016; Aziz; Zeibig, 2014). Trofozoítos de Acanthamoeba spp. possuem tamanho médio entre 12 e 45 µm, motilidade lenta e às vezes progressiva, pseudópodes em formato de espinhos (acantopódios), apenas um núcleo e citoplasma granular vacuolizado. Os cistos são arredondados, medindo de 8 a 25 µm e contendo apenas um núcleo e citoplasma desorganizado, granular e ocasionalmente vacuolizado. Envolvendo os cistos há uma parede celular dupla; sendo a interna lisa e a externa irregular (Figura 8), uma característica-chave na identificação dessas formas parasitárias (Aziz; Zeibig, 2014). 13 Figura 8 – Trofozoíto com acantopódios (esquerda) e cistos com parede celular irregular (direita) de Acanthamoeba spp. Fonte: CDC. Free living amebic infections. NA PRÁTICA Responda com base no caso clínico apresentado no início da etapa: 1) Qual ameba provavelmente infectou Pedro? 2) Cite as doenças associadas ao parasito responsável. 3) Desenhe o ciclo biológico do parasito enfatizando sua epidemiologia, rota de transmissão, estágios infectantes e diagnóstico. 4) Quais são os tratamentos disponíveis para essa infecção e como ela pode ser prevenida ou controlada? 5) Qual é a amostra de escolha para a detecção do parasito? 6) Interprete os resultados laboratoriais apresentados no caso e proponha exames de acompanhamento específicos que poderiam auxiliar na identificação da infecção. FINALIZANDO As amebas são diferenciadas por suas características de tamanho, forma, quantidade de núcleos, aspectos do citoplasma inclusões citoplasmáticas; devendo os analistas clínicos examinarem cuidadosa e detalhadamente todas as amostras recebidas no laboratório em busca de formas amebianas suspeitas, através de tais características típicas amebianas. 14 REFERÊNCIAS AZIZ, H.; ZEIBIG, E. Amebas. In: ZEIBIG, E. A. Parasitologia Clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. Rio de Janeiro: Elsevier, 2014. p. 41-76. NEVES, D. P.; COSTA, A. O. Amebas de vida livre. In: NEVES, D. P. Parasitologia Humana. 13. ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2016. p. 155-157. SILVA, E. F.; GOMES, M. A. Amebíase: Entamoeba histolytica / Entamoeba dispar. In: NEVES, D. P. Parasitologia Humana. 13. ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2016. p. 141-154.