aula PCR

Prévia do material em texto

Kary Mullis (meados da década de 80) 
Verdadeira revolução na biologia 
molecular 
Premio Nobel 1994 
 Pesquisa 
 Diagnóstico 
 Produtos de laboratório. 
Kary Mullis 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
(PCR – Polymerase Chain Reaction) 
 1980 - Mullis descreve a técnica da Reação em Cadeia da 
Polimerase (PCR) 
 cuja patente foi obtida por Perkin-Elmer Cetus, em 1985 e 
vendida em 1991 a Roche Molecular Systems, por 300 
milhões de dólares. 
 Mullis, tentou publicar seus experimentos nas revistas 
Science e Nature que negaram a publicação 
Duplicação “in vitro” 
• DNA molde 
• dNTP (desoxiribonucleotídeos tri-fosfatados) 
• primers 
•DNA polimerase 
• MgCl2 
 
 A reação de PCR se baseia no pareamento e extensão 
enzimática de um par de primers (iniciadores) que 
delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da 
amplificação. 
 
 Estes primers são sintetizados artificialmente de 
maneira que suas sequências de nucleotídeos sejam 
complementares a sequências específicas que 
flanqueiam a região alvo. 
 
Primer de RNA ou DNA? 
Um ciclo de PCR envolve 3 etapas: 
1) desnaturação do DNA alvo (92 a 95°C) 
2) Pareamento (anelamento) do primer (35 a 60°C) e 
3) extensão pela DNA polimerase (72°C). 
Este ciclo é repetido de 20 a 30 vezes. 
 Uma vez que a cada ciclo a quantidade da sequência alvo 
dobra, depois de apenas 20 ciclos são produzidos mais 
de um milhão de vezes a quantidade inicial da 
sequência alvo. 
Permite iniciar com uma quantidade mínima de DNA e 
terminar a reação com grandes quantidades. 
Duplicação do DNA “in vitro” 
dNTP 
MgCl2 
Tampão 
•Tris-HCl pH 8,3 
• KCl 
• H2O 
Enzima 
Taq 
água 
DNA 
molde 
Primer 
PCR 
TEMPERATURA 
• 92C a 95ºC - 4 min 
• 20 a 30 ciclos 
• 92ºC a 95ºC 
• 35ºC a 60 ºC 
• 72ºC 
• 72ºC – 5min 
5’ ----- ATTGGCCACCAGGCTCG ---- TCAGACTAAC ---- CGATCGTACGGGCATCGC ----- 3’ 
3’ ----- TAACCGGTGGTCCGAGC ---- AGTCTGATTG ---- GCTAGCATGCCCGTAGCG ----- 5’ 
5’ ----- ATTGGCCACCAGGCTCG ---- TCAGACTAAC ---- CGATCGTACGGGCATCGC ----- 3’ 
3’ ----- TAACCGGTGGTCCGAGC ---- AGTCTGATTG ---- GCTAGCATGCCCGTAGCG ----- 5’ 
5’ ----- ATTGGCCACCAGGCTCG ---- TCAGACTAAC ---- CGATCGTACGGGCATCGC ----- 3’ 
3’ ----- TAACCGGTGGTCCGAGC ---- AGTCTGATTG ---- GCTAGCATGCCCGTAGCG ----- 5’ 
3’ ----- TAACCGGTGGTCCGAGC ---- AGTCTGATTG ---- 
---- TCAGACTAAC ---- CGATCGTACGGGCATCGC ----- 3’ 
Desnaturação Pareamento 
Extensão 
3’ GCTAGCATGC 5’ 
5’ ACCAGGCTCG 3’ 
GCTAGCATGC 5’ 
5’ ACCAGGCTCG 
desnaturação pareamento extensão 
A cada ciclo inserir nova DNA polimerase que se desnaturava em 
alta temperatura 
Amplificação (PCR): 
• Termociclador 
Taq polimerase – T (Thermus) aq (aquaticus) 
Eletroforese: 
Coloração e Fotodocumentação: 
• Brometo de Etídeo 
• Transiluminador UV 
APLICAÇÕES 
CN CP 
Gel de determinação sexual de Sotalia guianensis. Indivíduos com 
duas bandas representam machos e as fêmeas apresentam apenas 
uma banda. M = Marcador de 100pb, C = controle negativo. 
DNA extracted from acute malaria patients and amplified by multiplex 
PCR. 1: Molecular weight (100 bp, Invitrogen); 2: negative control; 3 
and 10: negative results from positive patients; 4–9, 11–13 and 15–
16: P. vivax fragment (499 bp); 14: P. malariae fragment (269 bp). 
CN N N 
P. vivax P. malariae 
Otimização da reação de polimerase em cadeia para detecção de 
Toxoplasma gondii em sangue venoso e placenta de gestantes 
Silvia Maria Spalding1, Maria Regina Reis Amendoeira2, Janice M.C. 
Coelho3, Sergio O. Angel4